豬胸膜肺炎放線桿菌OmpD、LppB蛋白的原核表達(dá)及免疫原性分析

摘 要： 本研究旨在評價豬胸膜肺炎放線桿菌OmpD和LppB蛋白的免疫原性和保護(hù)效果。通過同源性分析，發(fā)現(xiàn)19個血清型的APP均含有ompD和lppB基因，氨基酸序列相似性分別為98.2%～100%和99.3%～100%。利用基因工程大腸桿菌表達(dá)純化了1型菌株的rOmpD和rLppB蛋白，并進(jìn)行了免疫原性分析。結(jié)果顯示，兩種蛋白均能有效表達(dá)，與豬康復(fù)血清反應(yīng)明顯。小鼠免疫rOmpD、rLppB蛋白后，ELISA抗體水平顯著提高，對國內(nèi)流行的1型、7型菌株攻毒保護(hù)率為70%～80%。進(jìn)一步制備含rOmpD和rLppB的油乳劑，免疫仔豬后，ELISA抗體水平顯著提高，對1型、7型菌株攻毒具有部分保護(hù)作用和交叉保護(hù)能力，但未能完全阻止感染和死亡。因此OmpD、LppB有作為APP亞單位疫苗開發(fā)候選抗原的潛力，本研究為進(jìn)一步開發(fā)具有良好交叉保護(hù)效果的疫苗提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞： 豬胸膜肺炎放線桿菌；OmpD；LppB；免疫原性；免疫效果

中圖分類號： S852.619"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0343-10

收稿日期：2024-01-26

基金項目：國家自然科學(xué)基金面上項目（32473062）；“十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項目（2022YFD1800902）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)-人才引進(jìn)項目（SWU020020）；國家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心項目（NCTIP-XD/B11; NCTIP-XD/C17）

作者簡介：曾 焱（1999-），女，重慶永川人，碩士生，主要從事動物細(xì)菌病疫苗研究與開發(fā)研究，E-mail： 2685343085@qq.com

*通信作者：廖永洪，主要從事動物細(xì)菌病疫苗研究與開發(fā)研究，E-mail： yonghongliao@swu.edu.cn

ZENG" Yan OU" Xianglong YAN" Xiaoyang LIU" Can LIAO" Yonghong 以急性出血性纖維素性胸膜肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜肺炎為特征，急性型呈現(xiàn)高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失^［1］。疫苗免疫是該病有效的預(yù)防和控制手段，APP血清型多，至今研究者已發(fā)現(xiàn) APP 有 19 個血清型，有的臨床分離株不能分型^［2］。我國目前流行血清型主要為 1、2、3、7型，也有其它血清型如 5、10、11、12、13、15型的流行報道^［3-5］。目前上市的全菌滅活疫苗交叉保護(hù)效果差^［6］，國內(nèi)上市的亞單位疫苗包括進(jìn)口的亞單位疫苗（含有天然的3種Apx類毒素蛋白和42 ku的外膜蛋白）和國內(nèi)疫苗企業(yè)生產(chǎn)的亞單位疫苗（含有大腸桿菌表達(dá)的ApxII、Oml-1、Oml-7），上市的亞單位疫苗交叉保護(hù)效果有限^［7-9］。因此開發(fā)豬胸膜肺炎放線桿菌交叉保護(hù)良好的亞單位疫苗是當(dāng)前的重要研究方向，此類疫苗最重要的是篩選出免疫原性良好的交叉保護(hù)良好的抗原。OmpD是革蘭陰性菌的一種外膜蛋白，形成跨越外膜的通道，允許小分子物質(zhì)進(jìn)出細(xì)菌細(xì)胞。OmpD 在維持外膜通透性、營養(yǎng)物質(zhì)攝取和毒力因子分泌等方面發(fā)揮重要作用。在杜克雷嗜血桿菌、巴氏桿菌和遲鈍愛德華菌中該蛋白具有良好的免疫原性^［10-12］。此外該蛋白在同一種細(xì)菌不同血清型間具高度保守性，如在鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌中就呈現(xiàn)高度保守現(xiàn)象^［13］。LppB是革蘭陰性菌的一種外膜脂蛋白，主要負(fù)責(zé)連接外膜和肽聚糖層，維持外膜的穩(wěn)定性，并參與細(xì)胞分裂。在Bartonella bacilliformis中，該蛋白能與病人的血清發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)原性優(yōu)勢顯著^［14-15］，具有潛在的免疫原性。已有研究報道APP的OmpD和LppB具有免疫反應(yīng)性^［16］，但其在動物體內(nèi)的系統(tǒng)評價還未見有報道。本研究選擇在所有血清型中均有分布且同源性較高的OmpD、LppB進(jìn)行原核表達(dá)，并對表達(dá)的蛋白在小鼠和仔豬進(jìn)行免疫原性和免疫保護(hù)效果評價，以期篩選出免疫原性良好的交叉保護(hù)性疫苗候選抗原。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細(xì)菌基因組 DNA 快速抽提試劑盒、SanPfu PCR Mix 預(yù)混液、SanPrep 核酸純化套件均為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司。十二烷基肌胺酸鈉（N-lanrayl sarcosine Na Salt SKL） 購自Sigma公司；IPTG為Promega產(chǎn)品；溶菌酶以及氧化型、還原型谷胱甘肽、聚乙二醇 （polyethyleneglycol 4000， PEG4000） 購于麥克林公司。SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、蛋白定量試劑盒均購自碧云天生物；PVDF膜購自賽默飛世爾科技公司；辣根過氧物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為Southern Biotech公司產(chǎn)品。白油為美孚公司產(chǎn)品；抗生素、吐溫80、司本85購自麥克林公司。豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ-ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前生物股份有限公司。

1.2 不同血清型ompD和lppB基因同源性分析

從NCBI Gene查找APP ompD基因（Gene ID： 5852202）和lppB基因（Gene ID： 5851473），用獲得的基因序列在NCBI blastn中分別進(jìn)行對比分析，找出能與APP 血清1～19型菌株全基組中全覆蓋且相似性達(dá)90%以上基因，從APP1～19型全基因組中下載與之對應(yīng)的氨基酸序列，涉及的1～19型菌株全基因組登陸號如下：APP1：CP030753.1、APP2：CP031875.1、APP3：CP031874.1、APP4：CP031873.1、APP5a：CP069797.1、APP5b：CP000569.1、APP6：CP069796.1、APP7：CP031869.1、APP8：CP031866.1、APP9：CP031865.1、APP10：CP031864.1、APP11：CP031863.1、APP12：CP031862.1、APP13：CP031861.1、APP14：CP031860.1、APP15：CP031859.1、APP16：CP069795.1、APP17：CP031856.1、APP18：CP031855.1、APP19：MT468887.1。CP030753.1（APP1）、CP031875.1（APP2）、CP031874.1（APP3）、CP031873.1（APP4）、CP069797.1（APP5a）、CP000569.1（APP5b）、CP069796.1（APP6）、CP031869.1（APP7）、CP031866.1（APP8）、CP031865.1（APP9）、CP031864.1（APP10）、CP031863.1（APP11）、CP031862.1（APP12）、CP031861.1（APP13）、CP031860.1（APP14）、CP031859.1（APP15）、CP069795.1（APP16）、CP031856.1（APP17）、CP031855.1（APP18）、MT468887.1（APP19）。

使用Mega軟件對獲得的19個血清型OmpD、LppB蛋白的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。

1.3 實驗動物、質(zhì)粒、菌株與培養(yǎng)條件及康復(fù)血清

實驗動物：SPF級BALB/c小鼠購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，42日齡仔豬購自重慶市榮昌區(qū)周邊養(yǎng)殖場。

菌株及培養(yǎng)：臨床分離株血清1型WZ2201株和血清7型RC2103株均分離自豬場發(fā)病典型的病死豬肺臟，APP參考菌株、臨床分離株、載體pET-28a、大腸埃希菌DH5α、BL21（DE3）均由本實驗室保存。在LB液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)時加入1 mmol·L^-1 IPTG；APP則在含有5%的小牛血清和10 μg·mL^-1 NAD 的TSA或TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

康復(fù)血清的制備：選取3頭APP陰性豬，通過氣管注射途徑以1×107CFU·頭^-1的劑量感染APP 4 074株。觀察7 d后2只存活，攻毒后14 d再用同樣劑量的感染，二次感染后觀察7 d后，采血分離血清。2頭豬的血清混合測定其抗體效價（豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ-ELISA抗體檢測試劑盒），制備的血清分裝凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的APP1型參考菌株4074全基因組中ompD、lppB基因序列、應(yīng)用Primer（6.0）設(shè)計2對特異性引物，從起始密碼子到終止密碼子擴(kuò)增ompD、lppB完整的基因序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成。引物序列見表1。

1.5 質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白表達(dá)與純化

基因克隆：使用表1引物擴(kuò)增血清1型4074菌株的ompD和lppB基因，經(jīng)雙酶切后克隆至pET28a質(zhì)粒，并通過生工生物工程（上海）股份有限公司測序驗證。

蛋白表達(dá)及純化：將測序驗證后的質(zhì)粒pET28a-ompD、pET28a-lppB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3），于含50 μg·mL^-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37℃ 220 r·min^-1振蕩培養(yǎng)。當(dāng)OD 600 nm值達(dá)1.0時，加入1 mmol·L^-1 IPTG誘導(dǎo)4 h。用PBS洗滌菌體，Buffer A重懸，超聲波破碎，10 000 r·min^-1離心10 min，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次。沉淀中加入Buffer A和20%SKL，4℃溶解過夜。15 000 r·min^-1離心15 min，取上清，加入20% PEG4000至0.2%，加入氧化型和還原型谷胱甘肽至1和2 mmol·L^- 4 ℃復(fù)性過夜。TE（pH8.0）透析，定量后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 SDS-PAGE和Western blot分析

將純化的蛋白和對照蛋白GST SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，將PVDF膜在5%的牛血清白蛋白中室溫封閉2h；以豬感染APP血清1型菌株康復(fù)血清（1∶1 00） 為一抗，37 ℃孵育 1 h，用PBST洗膜3次，之后加入HRP標(biāo)記的羊抗豬IgG抗體（1∶5 000）為二抗，37℃孵育1h；用PBST洗膜3次，每次5min；DAB顯色。

1.7 小鼠和仔豬的免疫保護(hù)評價

將純化的蛋白用PBS稀釋至150 μg·mL^-1（小鼠）和300 μg·mL^-1（豬）的質(zhì)量濃度，分別與白油佐劑按1∶2的體積比混合乳化，制備成油包水乳劑。含有rOmpD或rLppB蛋白的乳劑對小鼠進(jìn)行免疫評價，含rOmpD、rLppB 2種抗原的乳劑用于豬免疫保護(hù)評價。

1.7.1 小鼠免疫保護(hù)

16 g±2 g SPF小鼠，共60只，隨機(jī)分成3組，每組20只，即rOmpD免疫組、rLppB免疫組、PBS對照組。對小鼠進(jìn)行兩次腹腔注射免疫，1 mL·次^- 首免后兩周進(jìn)行二免，二免后10 d，每組選取10只小鼠分別進(jìn)行血清1型和血清7型菌株的攻毒試驗。攻毒劑量分別為2.0×107CFU·只^-1（5LD 50）、5×107CFU·只^-1（5LD 50），攻毒后觀察兩周，記錄小鼠死亡情況。

1.7.2 仔豬免疫保護(hù)

選取42日齡的Apx VI抗體陰性仔豬20頭，隨機(jī)分為4組，每組5頭：2組免疫組和2組PBS對照組。對仔豬進(jìn)行兩次2mL的頸部肌肉注射免疫，首次免疫后兩周進(jìn)行第二次免疫，二次免疫后三周，使用WZ2201株和RC2103株通過氣管注射方式對仔豬進(jìn)行攻毒，劑量分別為1×108和5×108 CFU·頭^-1。攻毒后觀察兩周，記錄仔豬臨床表現(xiàn)、死亡情況及肺部病變情況。

1.8 間接ELISA測定抗體水平

包被rOmpD或rLppB蛋白ELISA板，包被濃度為1 μg·mL^- 100 μL·孔^- 37 ℃，1 h，洗滌液洗3次；用抗體稀釋液1∶200倍稀釋待檢血清，37 ℃，1h，洗滌3次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG或羊抗豬IgG（1∶5 000），100 μL·孔^- 洗滌3次，加入底物顯色液，室溫避光反應(yīng)10 min，之后加入終止液終止反應(yīng)，以PBS孔作空白對照，630nm測定各孔OD值。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism軟件對小鼠和豬的ELISA抗體水平進(jìn)行統(tǒng)計分析，對照組和免疫組間抗體水平比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 OmpD、LppB蛋白同源性分析

查詢分析結(jié)果顯示，APP不同血清型菌株中均有OmpD、LppB蛋白，且OmpD氨基酸水平的相似性達(dá)97.4%～100%，LppB相似性達(dá)98.3%～100%。

2.2 rompD、rlppB的克隆

將重組質(zhì)粒pET28a-ompD、pET28a-lppB經(jīng)EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析（圖1），可見酶切條帶大小與預(yù)期的相符。pET28a-ompD質(zhì)粒酶切片段大小約為5 300和2 300 bp；pET28a-lppB的質(zhì)粒酶切片段大小約為5 300和1 200 bp。測序結(jié)果顯示序列正確，未發(fā)生點(diǎn)突變、插入或缺失等。

2.3 SDS-PAGE及Western blot分析

構(gòu)建正確的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，OmpD和LppB蛋白成功表達(dá)于包涵體內(nèi)，相對分子質(zhì)量分別為89和42 ku，與預(yù)期大小一致。純化的rOmpD和rLppB蛋白通過SDS-PAGE電泳，在預(yù)期的相對分子質(zhì)量位置（約89和42 ku）出現(xiàn)蛋白條帶（圖2A），設(shè)置GST蛋白作為對照蛋白（圖2B）。Western blot結(jié)果顯示，在rOmpD和rLppB蛋白相應(yīng)的相對分子質(zhì)量位置出現(xiàn)顯色帶，而對照蛋白GST無顯色帶（見圖2B）。

2.4 rOmpD、rLppB蛋白免疫原性評價

2.4.1 免疫小鼠rOmpD、rLppB特異性抗體檢測

圖3顯示，rOmpD、rLppB蛋白免疫組ELISA抗體水平顯著高于對照組。首次免疫兩周后，ELISA檢測結(jié)果（OD平均值）分別為1.11和0.98，與對照組（0.22）相比，差異極顯著 （Plt;0.01）。加強(qiáng)免疫后，rOmpD和rLppB蛋白免疫組的OD平均值分別增至2.03和1.88，持續(xù)顯著高于對照組（Plt;0.01）。

2.4.2 rOmpD、rLppB蛋白對小鼠的免疫保護(hù)

二次免疫后10 d，使用APP 1型菌株攻毒，對照組小鼠死亡9/10，而rOmpD和rLppB免疫組小鼠均死亡3/10，保護(hù)率達(dá)到70%（表2）。使用APP 7型菌株攻毒，對照組小鼠死亡8/10，rLppB免疫組小鼠死亡2/10，保護(hù)率為80%；rOmpD免疫組小鼠死亡3/10，保護(hù)率為70%（表2）。

2.4.3 rOmpD和rLppB蛋白在豬體上的評價

2.4.3.1 豬免疫后的特異性抗體檢測：

圖4顯示，rOmpD、rLppB蛋白免疫組ELISA抗體水平顯著高于對照組。首次免疫兩周后，ELISA檢測結(jié)果OD平均值分別為0.31和0.30，與對照組（0.15）相比，差異極顯著 （Plt;0.01）。加強(qiáng)免疫后，免疫組抗體水平均迅速上升，2種蛋白免疫組抗體水平OD平均值分別為0.95和0.80，持續(xù)顯著高于對照組（Plt;0.01）。

2.4.3.2 豬體的免疫保護(hù)效果：

血清1型菌株攻毒后24 h內(nèi)，所有對照豬均出現(xiàn)呼吸困難、厭食和精神不振，感染后48 h內(nèi)全部死亡（圖5），死亡豬出現(xiàn)口鼻出血，伴有泡沫。免疫組的豬在48 h內(nèi)死亡2頭（圖5），存活的3頭中有2頭出現(xiàn)體溫上升，最高至40.3 ℃，出現(xiàn)呼吸困難、厭食和精神不振等癥狀，感染后3 d即恢復(fù)正常；余下的1頭豬未出現(xiàn)任何臨床癥狀。解剖時發(fā)現(xiàn)，對照組豬出現(xiàn)嚴(yán)重的出血性壞死性肺炎（圖6）。免疫組豬感染死亡后解剖時，也觀察到嚴(yán)重的出血性壞死性肺炎；免疫組感染后存活的豬在感染后14 d解剖時，有一過性臨床表現(xiàn)的仔豬觀察到有輕微的纖維性胸膜炎，而未出現(xiàn)臨床癥狀的免疫豬解剖時未觀察到明顯的病變（圖6）。

血清7型菌株攻毒后，對照豬感染后48 h內(nèi)5頭中有3頭死亡（圖5），死亡豬出現(xiàn)口鼻出血，伴有泡沫，存活的2頭豬出現(xiàn)呼吸困難、厭食和精神不振，體溫升高至 40.5 ℃ 以上，至觀察結(jié)束（感染后14 d）仍表現(xiàn)出呼吸困難、厭食和精神不振。而免疫組攻毒后48 h內(nèi)死亡2頭（圖5），余下3頭在感染后48 h內(nèi)體溫上升最高至40.1 ℃，之后隨即恢復(fù)正常，未表現(xiàn)出其它任何臨床癥狀。感染后14 d解剖顯示，對照組存活的2頭豬出現(xiàn)了嚴(yán)重的纖維性胸膜炎，肺臟表面有明顯的膿腫（圖6），而免疫組的3頭存活豬解剖時除了有輕微的纖維素性胸膜炎和膿腫外，肺部未觀察到其它明顯的病變（圖6）。

3 討 論

3.1 目的基因的選擇、克隆、表達(dá)與純化

前期免疫蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果表明，OmpD、LppB蛋白均具有免疫反應(yīng)性^［16］。通過不同血清型菌株OmpD、LppB蛋白序列對比分析，這2個蛋白在所有血清型菌株中均存在，且氨基酸水平的同源性很高，表明這2個蛋白在豬胸膜肺炎放線桿菌中保守性良好。因此我們選擇了這2個基因進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，作為亞單位疫苗的候選蛋白進(jìn)行研究。

將ompD、lppB基因克隆至表達(dá)質(zhì)粒pET28a，獲得重組質(zhì)粒pET28a-ompD、pET28a-lppB，2個基因均得到表達(dá)，且Western blot結(jié)果顯示表達(dá)的蛋白與豬胸膜肺炎放線桿菌康復(fù)血清反應(yīng)形成明顯的顯色條帶，表明rOmpD、rLppB蛋白具有良好的免疫反應(yīng)原性，同時也表明OmpD、LppB是APP在感染過程中表達(dá)的抗原蛋白。

3.2 目的蛋白在小鼠及仔豬中的免疫保護(hù)評價

用SPF小鼠對表達(dá)的蛋白進(jìn)行了免疫保護(hù)性評價，與對照組相比，2種重組蛋白免疫小鼠后均產(chǎn)生了較高的抗體水平，均極顯著高于對照組，表明表達(dá)的2種蛋白具有較好的免疫原性。二次免疫后10 d用APP血清1型菌株和7型菌株進(jìn)行攻毒，OmpD、LppB對小鼠的保護(hù)率有一定的差異，1型菌株攻毒后對小鼠的保護(hù)率均為70%；7型菌株攻毒后rOmpD、rlppB免疫組的攻毒保護(hù)率分別為70%和80%；總體來看，rOmpD、rLppB對小鼠的保護(hù)效果明顯。以上試驗結(jié)果表明OmpD、LppB是免疫原性良好的保守抗原。

對于細(xì)菌病而言，致病機(jī)制復(fù)雜，特別是在本動物，僅用一個蛋白難以達(dá)到良好的免疫保護(hù)效果。因此我們基于rOmpD、rLppB在小鼠模型中良好的免疫保護(hù)效果，設(shè)計評價了含有這兩種蛋白的乳劑在豬體內(nèi)的免疫保護(hù)效果。豬在首免后2周抗體水平上升較明顯，二免后3周抗體水平極顯著高于對照組，表明這2種蛋白在豬體內(nèi)產(chǎn)生了良好的體液免疫反應(yīng)。

使用血清1型菌株攻毒后，免疫組對血清 1 型菌株表現(xiàn)出了部分保護(hù)作用。免疫組在攻毒后，雖然有 2 頭豬死亡，但其余 3 頭豬表現(xiàn)出不同程度的抵抗力，其中 2 頭出現(xiàn)短暫的臨床癥狀后恢復(fù)，1 頭完全無癥狀。相比之下，對照組全部死亡，說明本研究制備的含有2種抗原的乳劑具有一定的保護(hù)作用。免疫組存活豬的病理變化明顯輕于對照組，表明免疫的2種抗原能夠減輕 APP 感染引起的肺部損傷。但未能完全阻止感染和死亡，免疫組有臨床癥狀的豬在觀察結(jié)束解剖時仍見有纖維性胸膜炎，說明本研究制備的含有2種抗原的乳劑保護(hù)效果還有待提高。

與血清 1 型菌株攻毒后類似，免疫組在血清7型菌株 APP 攻毒后也表現(xiàn)出部分保護(hù)作用，存活率高于對照組，且臨床癥狀較輕。含有2種抗原的乳劑能夠?qū)Σ煌逍偷?APP 菌株提供部分保護(hù)，推測 OmpD 和 LppB 蛋白具有廣譜的保護(hù)性抗原表位，這與OmpD 和 LppB 蛋白在小鼠免疫攻毒保護(hù)中表現(xiàn)出的交叉保護(hù)效果相符。Domínguez-Medina等^［13］的研究發(fā)現(xiàn)，在沒有O抗原空間位阻的情況下，針對鼠傷寒沙門菌 OmpD 的抗體對缺失O抗原的腸炎沙門菌的有良好的中和殺菌作用，表明沙門菌中OmpD產(chǎn)生的抗體具有交叉保護(hù)的潛力，但因存在O抗原空間位阻，實際的交叉保護(hù)效果較差。本研究中APP 1型和7型菌株間可能不存在這種O抗原產(chǎn)生的空間位阻，在小鼠和豬的試驗中均表現(xiàn)出了較好的交叉保護(hù)作用。Fletcher等^［17］的研究表明腦膜炎奈瑟菌 LppB 蛋白具有免疫原性和保護(hù)性潛力，發(fā)現(xiàn) LppB 蛋白能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體和保護(hù)性免疫反應(yīng)，其產(chǎn)生的抗體還能夠識別不同腦膜炎奈瑟菌菌株，提示 LppB 蛋白可能具有一定的交叉保護(hù)潛力。在本研究中LppB的小鼠和豬免疫攻毒試驗證實LppB有較好的交叉保護(hù)效果。

總之，含有OmpD 和 LppB 蛋白的乳劑免疫豬后對血清1型和7型APP強(qiáng)毒株攻擊表現(xiàn)出了較好的交叉保護(hù)效果，表明 OmpD 和 LppB 蛋白是開發(fā) APP 疫苗的潛在候選抗原。然而僅含有本研究中的2種抗原保護(hù)效果還有待提高，需要進(jìn)一步的研究和優(yōu)化。保護(hù)效果有限可能是因為制備的乳劑中不含有其它與致病機(jī)理密切相關(guān)的抗原蛋白，比如Apx毒素蛋白在 APP 的感染和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。基于本研究評價的2種抗原蛋白，進(jìn)一步開發(fā)APP有效的亞單位疫苗需要考慮將這類毒素蛋白納入進(jìn)行研究評價。

4 結(jié) 論

豬胸膜肺炎放線桿菌OmpD和LppB蛋白免疫小鼠和豬后對1型、7型菌株攻毒具有部分保護(hù)作用和交叉保護(hù)能力，但未能完全阻止感染和死亡。OmpD、LppB有作為APP亞單位疫苗開發(fā)候選抗原的潛力。

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（編輯 白永平）