馬皰疹病毒1型分離毒株對敘利亞金黃地鼠的致病性

摘 要： 為了解從伊犁地區分離的EHV-1/China/YL2023的生物學特性及其對敘利亞金黃地鼠的致病性，采用蝕斑試驗、病毒培養與增殖、飽和硫酸銨濃縮及蔗糖密度梯度離心等方法，對分離株進行純化。使用不同劑量的EHV-1/China/YL2023病毒，以鼻內接種的方式感染敘利亞金黃地鼠，探究該分離株的致病效果。結果表明，純化后的EHV-1/China/YL2023分離株病毒滴度達10^6.64 TCID 50·mL^-1。EHV-1/China/YL2023分離株感染4～5周齡敘利亞鼠后，14 d內的出現精神沉郁、食量減退、口部流涎、蜷縮、弓背、皮毛凌亂掉落及不同程度的神經癥狀。耐過地鼠的平均體重下降25.9%，107～105 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組的存活率均為50%。病理結果顯示，不同劑量組的病毒對敘利亞鼠的肺部腦部造成不同程度的損傷，即肺泡壁增厚，腦部神經元腫脹、大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，出血充血等。不同組織病毒載量測定結果顯示，敘利亞鼠的肺、腦及淋巴結中均含有病毒DNA，且在肺和腦中的含量較高。綜上所述，EHV-1/China/YL2023分離株對4～5周齡敘利亞金黃地鼠具有較高的致病性。本研究為EHV-1生物學特性研究及其致病機理提供依據，為后期解決EHV-1的流傳及疫苗的研發問題提供支持。

關鍵詞： 馬皰疹病毒1型；蝕斑純化；病毒增殖；致病性

中圖分類號：S852.659.1；S855.3"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0327-08

收稿日期：2024-03-11

基金項目：中央引導地方科技發展專項資金項目（ZYYD2023C03）；新疆農業大學大學生創新訓練計劃項目（S202210758063）

作者簡介：劉建華（1972-），男，重慶人，副教授，碩士，主要從事動物傳染病診斷與防治研究，E-mail：liujianhua627@126.com；撒瑞雪（1997-），女，新疆烏魯木齊人，回族，碩士生，主要從事動物傳染病的診斷與防治研究，E-mail：1715019231@qq.com。劉建華和撒瑞雪為同等貢獻作者

*通信作者：劉建華，E-mail：liujianhua627@126.com

LIU Jianhua "EHV-1）是雙鏈DNA病毒，大小約120 nm，有囊膜^［1］。EHV-1屬皰疹病毒目，皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科，水痘病毒屬^［2］。該病毒可終身潛伏于體內，在給藥期間重新激活^［3］。具有9種血清型，6～9型主要影響野生動物，1～5型對家畜影響較大^［4］。患病動物多表現為呼吸系統癥狀、腦脊髓炎及流產^［5］；除此之外伴有精神沉郁、被毛凌亂、食欲減退、日漸消瘦、神經癥狀等。EHV-1的流行，對各地區馬產業都構成威脅，對經濟造成影響。

敘利亞金黃地鼠（Syrian hamster）屬地鼠科（Cricetidae），來源于敘利亞，體型較大，毛色為金黃色，具有較強的生育力，通常一胎產仔6～12只不等。該鼠常被用于建立動物模型，與小鼠模型相比，敘利亞倉鼠更具優勢，表現在能更好的分析病毒感染的情況，在疾病癥狀、發病機制及免疫反應方面與馬皰疹病毒的宿主更加相似^［6］。本研究采用蝕斑純化、病毒培養與增殖對伊犁地區樣品進行病毒的分離；用飽和硫酸銨濃縮、蔗糖密度梯度離心對分離株進行純化，探究該分離株的生物學特性。采用不同劑量組的EHV-1/China/YL2023對敘利亞金黃地鼠進行鼻內接種，觀察其臨床變化，進一步了解對敘利亞金黃地鼠的致病效果，為后續相關疫苗的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細胞

EHV-1/China/YL2023分離株由新疆伊犁地區采集的病料中分離獲得，RK-13細胞（兔腎細胞）保存于新疆農業大學動物醫學學院傳染病研究室。

1.1.2 實驗動物

敘利亞金黃地鼠，4～5周齡，購自北京隆安實驗動物養殖中心。

1.1.3 主要試劑

高糖DMEM、2×DMEM、PBS、雙抗、胎牛血清購自BI公司；6孔、24孔、96孔細胞培養板、10、15 cm細胞培養皿購自NEST公司；病毒DNA提取試劑盒均購自 Omega 公司；2×qPCR prob Mix購自TaKaRa公司；低熔點瓊脂糖購自翌圣公司；引物和探針由有康生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖與噬斑純化

將盲傳F15代的EHV-1/China/YL2023分離株按MOI=0.1接種至單層RK-13細胞，病變85%收獲，反復凍融2次，取上清，10倍倍比稀釋（10^-1～10^-6），接種6孔板，孵育2 h，棄液，PBS洗2次，加營養瓊脂膠（5％FBS+2％雙抗）倒置培養3～4 d，觀察細胞病變（CPE）。于板底標記CPE位置，挑取噬斑至0.5 mL DMEM，反復凍融2次，接種至12孔板，產生CPE收取陽性病毒液，準備下一輪噬斑純化，如此重復5次。

1.2.2 病毒滴度檢測

將純化后的EHV-1/China/YL2023分離株10倍倍比稀釋（10^-1～10^-12），100 μL·孔^-1接種至96孔板，同時設置陰性對照，培養3 d后逐日觀察，記錄CPE孔數，利用Reed-Muench兩氏法計算病毒滴度。

1.2.3 病毒生長動力學測定

取方法“1.2.2”所測TCID 50病毒液，按MOI=0.1接種6孔板（經細胞計數），分別收取感染6、12、24、36、48、60、72 h病毒液，反復凍融測TCID 50（3次重復）。

1.2.4 病毒噬斑大小測定

取稀釋至10^-5病毒液孵育細胞，方法同“1.2.1”，待產生CPE測定噬斑大小（約50～60個噬斑）。

1.2.5 病毒濃縮與純化

擴增噬斑純化5輪后的EHV-1/China/YL2023至1 L，反復凍融，去細胞碎片，加入硫酸銨至飽和，4 ℃搖床過夜，12 000 r·min^-1離心，PBS重懸沉淀于透析袋，透析48 h，期間不停更換透析液（PBS），顏色趨向于灰白色，蔗糖密度梯度（10%、45%、60%）離心（120 000×g）2.5 h 純化病毒，脫糖后PBS重懸于-80 ℃保存。

1.2.6 病毒電鏡觀察

將“1.2.5”脫糖后用PBS重懸的病毒液，冷鏈運輸至武漢賽維爾生物科技有限公司進行透射電鏡觀察病毒粒子。

1.2.7 不同劑量EHV-1/China/YL2023對敘利亞金黃地鼠的致死性

將4～5周齡，雌性敘利亞金黃地鼠隨機分為8組，6只·組^- 濃縮純化后的EHV-1/China/YL2023病毒液10倍倍比稀釋（109～103 TCID 50·0.1 mL^-1）鼻內接種^［7］敘利亞鼠，100 μL·只^- 對照組滴入PBS。觀察攻毒后敘利亞鼠每日的臨床癥狀，體溫、體重及存活率，14 d后對其進行安樂死，解剖，采集各組織臟器用于后續試驗。

1.2.8 敘利亞金黃地鼠臨床表現及組織病理學觀察

對敘利亞鼠的臨床癥狀進行觀察與記錄，采集肺、腦、淋巴結，將肺與腦取一半進行HE染色，觀察其病理學變化。

1.2.9 敘利亞金黃地鼠各組織病毒載量測定

將所采集的另一半肺、腦與淋巴結進行研磨，反復凍融后取上清，提取病毒基因組，利用本試驗建立的qPCR檢測方法，對組織中病毒DNA拷貝數測定^［8］。

2 結 果

2.1 病毒增殖與純化

將盲傳F15代的EHV-1/China/YL2023分離株按MOI=0.1接種RK-13細胞，與對照組相比，產生經典CPE，細胞聚集，皺縮形成合胞體，收集陽性病毒液進行噬斑純化，挑取噬斑重復5輪（圖1A）。利用Reed-Muench兩氏法計算純化后分離株的病毒滴度為10^6.64 TCID 50·mL^-1。測定感染不同時間段（6、12、24、36、48、60、72 h）細胞的TCID 50，結果顯示EHV-1/China/YL2023在60 h病毒滴度達到最高，為10^6.81 TCID 50·mL^-1（圖1B）。取稀釋至10^-5病毒液孵育細胞2 h，PBS清洗，鋪2 mL營養瓊脂膠，待細胞感染60 h，測定50～60個噬斑的面積，結果顯示，噬斑平均大小在153 615.4 μm2。

經飽和硫酸銨法濃縮病毒，蔗糖密度梯度離心純化病毒，以1%磷鎢酸負染后，透射電鏡觀察顯示，病毒粒子呈球形，直徑大小約120 nm（圖1C）。

2.2 不同劑量病毒對敘利亞金黃地鼠的致死性

4～5 周齡雌性敘利亞金黃地鼠隨機分組，滴鼻感染后，6只最高劑量組的（109 TCID 50·0.1 mL^-1）敘利亞鼠，于3 d內全部死亡，除對照組外，其余7組均在第6～8天體重降低，第9天日漸平穩，但與對照組相比仍有差距，平均體重下降了25.9%（圖2B）。108～106 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組的體溫，自感染第5天開始顯著下降，個別體溫無法測出甚至死亡，第9天逐漸恢復，感染組14 d內存活的敘利亞鼠與對照組體溫相比差異小（圖2A）。107～105 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組的存活率均為50%，103 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組與對照組相同（圖2C）。以上數據表明，EHV-1/China/YL2023分離株對敘利亞金黃地鼠的感染模型成功建立，且對4～5周齡的鼠具有較高的致死性。

2.3 感染鼠的臨床表現及組織病理學變化

感染EHV-1/China/YL2023分離株的敘利亞金黃地鼠從第3天開始逐漸出現發病癥狀，除了103 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組癥狀輕微外，其余各組均在第4～5天左右出現精神沉郁、食量減退、口部流涎、蜷縮、弓背、皮毛凌亂掉落及不同程度的神經癥狀，即“頭點地”、轉圈等，個別嚴重的敘利亞鼠出現眼部癥狀，口鼻流血，倒地不起無法進食（圖3）。6只107 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組敘利亞鼠神經癥狀明顯且更具有攻擊性。對發病敘利亞鼠進行剖檢，病變主要集中于肺部和腦部。高劑量組的肺多呈“花斑狀”，不同程度的局部壞死，與對照組相比呈深紅色，水腫。腦部充血腫大，不飽滿，液化變“扁”，分離難度大。106、105 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組肺與腦呈灰黃色，最低劑量組沒有明顯的病理變化（圖4A）。組織病理切片結果顯示，肺泡壁增厚，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，出血充血，腦部神經元腫脹，壞死（圖4B）。

2.4 感染小鼠組織中病毒載量

本研究利用實驗室建立的TaqMan探針qPCR檢測方法，測定各劑量組敘利亞鼠的臟器病毒DNA拷貝數，結果顯示（圖5），感染EHV-1/China/YL2023分離株敘利亞鼠的肺、腦及淋巴結中均含有病毒DNA，且在肺和腦中的含量較高，108與107 TCID 50·0.1 mL^-1劑量組腦部病毒DNA差異不顯著，說明腦可能是高劑量EHV-1/China/YL2023主要的嗜性臟器。

3 討 論

馬皰疹病毒1型感染可引起妊娠母馬流產，幼駒呼吸道疾病，給馬產業造成嚴重經濟損失。本研究以實驗室所分離的EHV-1/China/YL2023株為研究對象，經過5輪篩選，獲得純化后的病毒，病毒滴度可達到10^6.64 TCID 50·mL^-1。與楊永龍等^［9］所分離的EHV-1 XJ2015株相比，降低了2個滴度，差" 異原因可能是本株EHV-1在RK-13細胞上分離所得，雖然也易感，但并非馬的原代細胞，故而病毒滴度有所降低。經透射電鏡觀察，病毒粒子呈球形，直徑大小約120 nm，與所報道的馬皰疹病毒特征一致^［10］。EHV-1 ORF30基因是DNA聚合酶基因^［11］，內部存在單核苷含酸多態性（SNP）^［12］，其2 245位核苷酸的改變，會影響DNA聚合酶第752位單個氨基酸殘基的突變，即天冬酰胺轉變為天冬氨酸（N-D），進一步影響EHV-1毒株的致病性^［13］。如圖6所示，將EHV-1/China/YL2023株進行氨基酸比對分析發現該分離株為神經型（D752型），目前我國所分離的EHV-1中75％左右都為非神經型，神經型毒株不足25％^［10］。

馬作為經濟動物較為昂貴，不適用于EHV-1的初期研究。為了評估EHV-1的毒力及發病機制，自1995年以來，一直嘗試研究病毒感染宿主的新模型。使用EHV-1 Ab4感染BALB/c小鼠可引起呼吸道感染，于感染高峰期可檢測到少量病毒血癥^［14］。CBA小鼠感染EHV-1后造成的腦損傷與馬感染的情況相似，可作為模型用來評估神經致病性^［15］。敘利亞金黃地鼠相較于以上兩種更易感EHV- 不僅會產生呼吸系統癥狀，還可以發展為神經癥狀，因此敘利亞金黃地鼠被用于評估EHV-1呼吸及神經系統的致病力，是目前最常用的動物模型^［16］。感染EHV-1/China/YL2023分離株的敘利亞金黃地鼠臨床癥狀表現為嚴重的呼吸系統及神經系統癥狀。剖檢肺呈“花斑狀”，局部壞死水腫，腦部充血腫大，液化等，說明該病毒對肺部和腦部損傷嚴重，肺和腦是主要嗜性器官^［7］。

綜上，明確了EHV-1/China/YL2023分離株的生物學特性，了解了該分離株對敘利亞金黃地鼠致病效果，不同劑量組的病毒對敘利亞鼠均具有一定的致病力，下一步將對其發病機制，重要蛋白的功能進行深入研究，為后期解決EHV-1的流傳及疫苗的研發問題提供支持。

4 結 論

本研究增殖并純化EHV-1/China/YL2023分離株，了解其生物學特性及對敘利亞金黃地鼠的致死性，明確了不同劑量組的病毒對敘利亞金黃地鼠均具有一定的致病力。

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（編輯 白永平）