牛活檢胚胎細胞微量擴增體系效果評估

摘 要： 旨在通過二代測序技術評估不同單細胞全基因組擴增體系對不同數量胚胎細胞的擴增效率。本研究選擇同一飼養管理條件下、體況良好的華西牛母牛為供體，采用FSH法超數排卵后進行人工授收集第7天胚胎，通過活檢技術獲得含1細胞（cell，1C）、5C、10C胚胎細胞樣本用于全基因組擴增（whole genome amplification），隨后通過全基因組重測序（whole genome sequencing）技術評估單細胞基因組擴增體系擴增效率的差異。結果顯示，在1C和5C樣本中多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）體系的擴增成功率優于多次退火環狀循環擴增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）體系（100% vs. 60%，100% vs. 80%，Plt;0.05），此外MDA體系的擴增產物總量極顯著高于MALBAC體系（Plt;0.01）；基于測序分析指標：正確比對率、重復率、分型一致率、等位基因缺失率、假陽性率等，MALBAC體系優于MDA體系；全同胞樣品的分型一致率大于半同胞樣品的分型一致率，但不同全同胞、半同胞胚胎樣本之間的分型一致率有很大差異。綜上所述，MDA和MALBAC體系各具特點，結合兩者優勢可能是改進擴增效率的途徑之一，本研究為牛早期胚胎全基因組選擇研究和促進牛育種發展提供一定理論基礎。

關鍵詞： 華西牛；活檢胚胎；擴增體系；效果比較

中圖分類號： S823.3" """文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0246-13

收稿日期：2024-07-02

基金項目：國家重點研發計劃政府間重點專項（2022YFE0100200）；國家自然科學基金國際合作項目（32161143032）；農業農村部和財政部資助：現代農業產業技術體系資助（CARS-36）；國家家養動物種質資源庫；中國農業科學院科技創新工程（ASTIP-IAS06）

作者簡介：牛一凡（1999-），男，河北邯鄲人，碩士生，主要從事動物繁殖研究，E-mail： nyf.niuyifan@qq.com

*通信作者：趙學明，主要從事家畜胚胎生物技術的研究，E-mail：zhaoxueming@caas.cn；馬友記，主要從事綿、山羊繁育與疾病防治的研究，E-mail：yjma@gsau.edu.cn

NIU" Yifan EGS）主要應用于加快牛遺傳育種進展，該項技術的基本步驟首先是對牛人工授精或自然交配產生的第 7天左右的胚胎進行活檢取樣，利用顯微切割系統切取微量滋養層細胞，隨后通過微量細胞全基因組擴增（whole genomic amplification， WGA），利用測序技術獲得該胚胎基因組單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphism， SNP）信息，并基于此對胚胎發育個體的生產性能進行預測，從而篩選出具有高育種價值的優良胚胎^［1］。通過EGS技術，可以提前估計候選胚胎育種值^［2］，從而加大選擇強度、縮短世代間隔^［3］、降低動物資源生產成本^［4］等。然而，二代測序至少需要1 ng DNA^［5］，而牛的單個卵裂球僅含有6 pg DNA^［6-7］，不足以進行全基因組重測序（whole genome sequencing，WGS）^{［5，8］}，當前微量細胞WGA體系不能滿足EGS技術的需求，不能獲得高質量的模板產物。因此，選擇一套高效精確的WGA技術，從胚胎活檢細胞獲得足夠的模板DNA以供后續分析^［9-11］是EGS技術的關鍵^［12］。

目前，在牛上常用的單細胞全基因組擴增體系主要包括多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）體系和多次退火環狀循環擴增（multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC）體系^{［ 13-14］}。MDA體系是一種恒溫擴增體系^［15-17］，該體系可以在恒溫30℃的條件下，充分利用phi29 DNA聚合酶的強大處理能力，先是隨機的6堿基引物在多個位點與模板DNA退火結合，發生鏈置換擴增反應，產生大量片段大于10 kb的擴增產物^［18］。MALBAC體系結合了PCR和MDA兩種技術，該體系先進行預擴增時期的部分隨機引物退火；再通過DNA聚合酶進行鏈延伸；然后半擴增子產生兩端互補的全擴增子；全擴增子環化以防止全擴增子在第一時期PCR中進一步擴增和交叉雜交，而在第二時期PCR中作為靶標^［19］。最后，產生的擴增產物片段大小為0.2～2.0 kb^［20］。然而在已發表的文章中，兩個體系的效率比較是關于單個精子^［21］、纖毛蟲^［22］、人胚胎致病基因^［23］、成肌纖維細胞^［24］等，鮮少涉及在牛上的擴增效率比較，尤其是對于牛的活檢胚胎細胞。

因此，本研究基于不同數量（1C、5C、10C）華西?；顧z胚胎細胞樣本，比較了MDA和MALBAC擴增體系在擴增效率、測序質量上的差異，同時分析了全同胞、半同胞樣本間的基因組差異，為改進牛EGS技術和促進牛遺傳育種進展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品的采集

試驗所需牛體內胚胎與牛血液均來自北京安伯胚胎生物技術有限公司石家莊肉牛良種場，于2022年12月份到2023年1月份采集，供體的母牛與公牛品種均為華西牛，母牛采用FSH法超數排卵、人工授精后的第7天胚胎進行沖胚，體視顯微鏡（Nikon，日本）下進行檢胚，挑選發育良好的牛體內囊胚放入冷凍液中，用慢速程序化冷凍儀（Crylogic，澳大利亞）進行胚胎的冷凍保存，液氮運輸。采集5 mL牛血液冰袋運輸，-20℃冰箱保存。

1.2 牛體內胚胎的活檢

先將胚胎麥管用37℃～38℃的溫水解凍，再將麥管中來自同一母牛的胚胎轉移至培養皿中，隨后用口細管將胚胎逐個放入Medium 199（Gibco，1×，美國）制成的液滴中，用75%酒精把微刀消毒，然后用微刀（ABT，美國）在培養皿底部劃幾道橫向劃痕來穩定胚胎，用微刀片輕輕切斷胚胎的一小部分，按照1C、5C、10C分離出3種數量的胚胎細胞。將切下的胚胎細胞轉移至Hoechst 33342（索萊寶，中國）溶液染色（注意避光，因Hoechst 33342染液遇光容易淬滅）。在普通熒光顯微鏡（Nikon，日本）下拍照，觀察細胞數量。最后用口細管將觀察過數量的細胞樣品用PBS（NucleoTech，中國）洗滴清洗3遍，然后將細胞樣品轉移至提前按各體系要求配制好的細胞裂解緩沖液中。

1.3 不同體系擴增活檢胚胎細胞

細胞樣品用兩種體系的試劑盒進行擴增，MDA體系試劑盒采用REPLI-g Single Cell Kit（QIAGEN，德國），其步驟為：在離心管中用PBS sc將活檢胚胎細胞補充到4 μL，加入3 μL緩沖液D2后65℃孵育10 min，再加入5 μL停止液，最后加入由9 μL H 2O sc、29 μL反應緩沖液和2 μL DNA聚合酶組成的40 μL主混合液，在30℃孵育8 h后，將酶在65℃下滅活5 min，擴增產物保存于-20℃。

MALBAC體系試劑盒采用億康MALBAC 單細胞全基因組擴增試劑盒（Yikon，中國），其基本操作步驟為：將活檢胚胎樣品（樣品所帶PBS不超過2 μL）收集至盛有5 μL裂解混合液的PCR管中，反應條件為50℃ 50 min 和80℃ 100 min孵育。再加入30 μL預擴增混合液，反應條件為95 ℃ 3 min，然后運行8次預擴增循環（每次循環：20 ℃ 40 s，30 ℃ 40 s，50 ℃ 30 s，60℃ 30 s，70 ℃ 4 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 10 s），然后加入30 μL擴增混合液，反應條件為95 ℃ 3 min，并運行17次PCR擴增循環（每次循環： 94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min），擴增產物保存在-20℃。MALBAC體系步驟中描述需要設置陽性與陰性對照（30 pg·μL^-1血液基因組DNA 溶液1 μL，加入含4 μL細胞裂解緩沖液的 PCR 管中，作為陽性對照；DNA換為無核酸酶水即為陰性對照）^［14］。

1.4 ?；顧z胚胎擴增產物的質檢

牛胚胎細胞擴增出的DNA采用Qubit紫外分光光度計進行DNA定量質控，MDA體系擴增產物吸取1 μL然后稀釋10倍后吸取60 ng與3 μL Loading Buffer點樣于0.8%瓊脂糖凝膠，170 V、25 min電泳，Marker采用3 μL Transfer2000 plusⅡ。MALBAC體系擴增產物吸取40 ng點樣于1%瓊脂糖凝膠，其余操作同MDA體系。

1.5 ?；顧z胚胎細胞擴增產物的文庫構建

胚胎細胞擴增產物質控合格后進行打斷、末端修復、加 “poly-A”尾、加測序接頭、 PCR 富集、PCR產物純化等步驟，構建 DNA 文庫。

1.6 ?；顧z胚胎細胞擴增產物文庫DNA的質檢

文庫構建完成后，使用 dsDNA HS Assay Kit for Qubit 試劑盒，對活檢胚胎擴增產物文庫進行定量（1 μL擴增產物文庫DNA+199 μL工作 Buffer），根據定量得到的濃度取 80 ng PCR 純化產物于96孔血凝板內，加3.5 μL 的溴酚黃，吹打混勻后于 3%瓊脂糖凝膠、170 V、25 min 電泳檢測，合格文庫片段大小在 450 bp 左右，至此全基因組文庫構建完成。

1.7 牛活檢胚胎細胞擴增產物的上機測序

測序前需進行 DNA 納米球（DNA nano ball）的制備和加載。將雙鏈的靶區域文庫進行變性、環化和消化，得到單鏈環狀 DNA。單鏈環狀 DNA 通過滾環擴增技術（rolling circle amplification）得到的擴增產物即 DNA 納米球。文庫質量合格后利用DNBSEQ-T7RS測序儀對擴增成功樣本的DNA片段進行雙末端測序，按照雙端PE 150測序策略執行，獲得的原始reads以FASTQ格式保存。

1.8 牛血液DNA對照的設立

采集的5 mL母牛血液DNA抽取1 mL提取DNA，作為胚胎擴增產物測序數據對照，質檢后的文庫構建、文庫質檢、上機測序同胚胎樣品。

1.9 不同體系擴增成功率統計與測序數據的處理分析

采用Excel 2016統計不同體系的擴增成功率，文庫DNA質檢合格暨擴增成功。通過BWA軟件將Clean reads比對到參考基因組（Bos taurus ARS-UCD1.3 GCA_002263795.3）上，統計各樣品的比對率、測序深度、基因組覆蓋度等信息。檢出率：是指該樣本所有位點基因型檢出（非缺失）SNPs位點數與重測序所有樣本SNPs位點比值。分型一致率：以原始對照血液重測序樣本檢出位點基因型為參考，擴增樣本的基因型（非缺失）與對照樣本基因型（非缺失）一致的比率。等位基因缺失率：參考的對照組重測序樣本基因型為AC，擴增后位點變為純合AA，統計擴增后等位基因發生缺失的位點比例。假陽性率計算：參考的對照組重測序樣本基因型為AA，擴增后位點變為AC，統計擴增后等位基因發生改變（假陽性）的位點比例。本次重測序獲得10×數據量總SNPs位點數為26 500 078個；15×數據量總SNPs位點數為 30 822 595個。（總SNPs位點數為檢出位點數、對照組缺失位點、擴增組缺失位點、對照組和擴增組同時缺失位點的總和）。樣本數據通過SPSS 25.0 進行獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，利用GraphPad Prism 8進行差異顯著性柱狀圖的繪制。

2 結 果

2.1 ?；顧z體內胚胎普通熒光顯微鏡拍照結果

為了確認活檢牛胚胎細胞的數量，本研究對?；顧z胚胎細胞進行了活細胞染色，在普通熒光顯微鏡下的照片如圖1所示。

2.2 不同體系對不同數量梯度（1C、5C和10C）?；顧z胚胎細胞樣品擴增效果統計

為了探究不同單細胞全基因組擴增體系對不同數量梯度?；顧z胚胎細胞的擴增效果，本研究對不同體系的成功擴增產物進行了濃度測定與擴增產物總質量計算，如表1所示，MDA體系的擴增產物最終體積為50 μL，MALBAC體系為65 μL，且成功擴增的擴增產物濃度、純度、完整性和總量都滿足試驗要求。Qubit紫外分光光度計測定的擴增產物濃度結果表明不論是1C、5C和10C的牛活檢胚胎細胞樣品，使用MDA體系的擴增產物濃度和總質量都極顯著的優于MALBAC體系（Plt;0.01）。

對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳（圖2），結果發現MDA體系擴增牛活檢胚胎細胞的擴增產物片段主帶大小在8 kb以上，MALBAC體系的擴增產物片段大小為0.25～3 kb，本研究結果表明，MDA體系的擴增產物片段比MALBAC體系的大。

2.3 牛活檢胚胎細胞擴增產物測序數據量結果

為評判此次全基因組擴增產物的測序數據量是否達標，本研究對?；顧z胚胎細胞經過不同體系擴增后測序數據量、Q20值、Q30值和GC含量進行統計匯總，同時統計大量血液DNA作為原始對照（NC組）的測序量。如表3所示，本次除去NC組共計測出1437.85G的原始數據，Q20值的總體均值為98.10%，Q30值的總體均值為94.02%，說明本次的數據產出足夠，Q20值與Q30值合格?？傮w的GC含量均值為42.52%，其中，MDA體系擴增產物測序的GC含量都低于NC組，MALBAC體系都高于NC組，說明MALBAC體系更偏向于擴增高GC含量的區域。

2.4 不同數量活檢體內胚胎細胞成功擴增產物測序結果分析

2.4.1 不同數量活檢胚胎細胞擴增產物比對統計結果

為了探究兩種擴增體系對不同數量?；顧z胚胎細胞擴增產物測序的比對效果，本研究進行了1C、5C和10C樣品的擴增產物重測序的比對統計。如圖3所示，本次比對統計結果顯示MDA體系10C樣品擴增產物的比對率為（99.64%±0.04%），極顯著高于MALBAC體系10C樣品的比對率" （99.54%±0.03%，Plt;0.01）。從正確比對率來看，MDA體系1C的正確比對率為（93.11%±1.64%），顯著低于MALBAC體系1C樣品的正確比對率（（97.15%±1.07%），Plt;0.05）；MDA體系5C樣品的正確比對率為（90.75%±1.41%），極顯著低于MALBAC體系5C樣品的正確比對率（（97.49%±0.50%），Plt;0.01）；MDA 體系10C的正確比對率為（93.61%±0.37%），極顯著低于MALBAC體系10C樣品的正確比對率（（95.85%±0.59%），Plt;0.01）。從重復率來看，MDA體系1C樣品的重復率為（1.37%±0.36%），顯著高于MALBAC體系1C樣品的重復率（（2.24%±0.25%），Plt;0.05）；MDA體系10C樣品的重復率為（1.24%±0.12%），極顯著低于MALBAC體系10C樣品的重復率（（2.09%±0.35%），Plt;0.01）。本研究結果表明，MALBAC體系的比對統計結果較好。

2.4.2 不同數量活檢胚胎細胞擴增產物測序覆蓋度統計結果

為了探究兩種擴增體系對不同數量?；顧z胚胎細胞擴增出文庫DNA的測序覆蓋效果，本研究進行了1C、5C和10C樣品的擴增產物重測序的測序覆蓋度統計。如圖4所示，本次覆蓋度結果顯示，MDA體系10C擴增產物的5×覆蓋度（90.18%±3.37%）極顯著高于MALBAC體系（（62.06%±1.76%），Plt;0.01）；MDA體系10C樣品的10×覆蓋度（76.87%±6.70%）極顯著高于MALBAC體系（（45.27%±1.80%），Plt;0.01），本研究結果表明，MDA體系對牛活檢胚胎細胞擴增產物的測序覆蓋度效果優于MALBAC體系，尤其是10C樣品。

2.4.3 不同數量活檢胚胎細胞擴增產物測序質控統計結果

為了探究兩種WGA體系對不同數量活檢胚胎細胞擴增產物測序的質量，本研究以15×測序深度數據為對照，分析了兩種體系擴增產物10×測序數據的分型一致率、等位基因缺失率、假陽性率與檢出率。如圖5所示，本次測序質控統計結果顯示MALBAC體系1C的分型一致率（97.62%±0.65%）極顯著高于MDA體系（（85.91%±3.26%），Plt;0.01）。MDA體系1C樣品的等位基因缺失率（5.99%±2.23%）顯著高于MALBAC體系（（1.28%±0.52%），Plt;0.05）。MDA體系"" 1C樣品的假陽性率（4.74%±2.26%）顯著高于MALBAC體系（（0.12%±0.00%），Plt;0.05）。MDA體系10C樣品的10×檢出率為（91.52%±7.82%）顯著高于MALBAC體系（（81.28%±0.95%），Plt;0.05）。

2.5 活檢體內胚胎細胞成功擴增產物總體測序效果分析

2.5.1 ?；顧z胚胎細胞擴增產物比對統計結果

為探究不同擴增體系對于?；顧z胚胎細胞的比對效果與體系重現性，本研究對經不同體系擴增的?；顧z胚胎細胞進行比對統計匯總。如圖6所示，本次比對統計結果顯示MDA體系的正確比對率為（92.57%±1.69%），MALBAC體系為（96.65%±1.01%），MALBAC體系的正確比對率極顯著高于MDA體系（Plt;0.01），本研究結果說明MALBAC體系的比對結果好于MDA體系。

2.5.2 牛活檢胚胎細胞擴增產物測序覆蓋度統計結果

為研究兩種WGA體系擴增產物的測序覆蓋度效果，本研究統計了兩種體系擴增產物測序的測序覆蓋度。如圖7所示，本次的平均測序深度結果顯示，MDA體系與MALBAC體系無顯著性差異。

2.5.3 ?；顧z胚胎細胞擴增產物測序質控統計結果

為了探究兩種WGA體系擴增產物測序的質量效果，本研究以15×測序深度數據為對照，分析了兩種體系擴增產物10×測序數據的分型一致率、等位基因缺失率、假陽性率與檢出率。如圖8所示，?；顧z胚胎細胞擴增產物的測序質控統計結果顯示，MDA體系的分型一致率（90.27±8.27）%，極顯著低于MALBAC體系（（97.34±1.09）%，Plt;0.01）；MALBAC體系的等位基因缺失率（1.59±0.78）%顯著低于MDA體系（（4.38±3.50）%，Plt;0.05）；MALBAC體系的假陽性率（0.11±0.02）%顯著低于MDA體系（（2.94±3.75）%，Plt;0.05），本試驗結果說明MALBAC體系的測序擴增產物的測序質量效果優于MDA體系。

2.6 全同胞、半同胞胚胎細胞樣本分型一致性分析

為了識別全同胞、半同胞胚胎樣本兩者之間不同的位點，為基因組選擇提供位點信息，本研究分析了兩種體系下的全同胞關系與半同胞胚胎樣本的分型一致率，詳見表4。結果顯示全同胞的分型一致率在77%～87%之間，總體均值為（82.41±4.42）%；半同胞樣本的分型一致率在76%～83%之間，總體均值為（79.99±2.52）%。本研究結果表明，全同胞樣品的分型一致率大于半同胞樣品的分型一致率，但不同全同胞、半同胞胚胎樣本之間的分型一致率有很大差異。MDA體系擴增10C全同胞關系樣品的分型一致率（87.82%）高于MALBAC體系（84.02%），同時，MDA體系擴增5C和10C半同胞關系樣品的分型一致率（82.28%、82.05%）都高于MALBAC體系（76.38%、78.58%），本研究結果說明了牛體內活檢全同胞、半同胞關系胚胎細胞樣本經MDA體系擴增后建庫測序后胚胎間一致性高，表明MDA體系尚不成熟。

3 討 論

隨著現代畜牧業發展的需求和國內外牛種生產水平差距大的現狀，牛養殖和科研行業的當務之急是加快牛的育種進程、縮短牛的世代間隔、做好牛的品種改良，這使得牛的胚胎基因組選擇工作受到養殖產業的廣泛關注。本研究采用我國自主培育的“華西?！斌w內胚胎，活檢后獲得不同數量的（1C、5C和10C）活檢胚胎細胞，通過二代測序得到兩種單細胞全基因組擴增體系擴增活檢樣品的效率，同時分析全同胞與半同胞的異同，對實踐應用具有重要的指導意義。?；顧z胚胎細胞在經過單細胞全基因組擴增體系的擴增時會存在非特異性擴增^{［14，25-27］}、保真度不足^［28］、等位基因缺失^{［26，29］}、假陽性^{［8，30-31］}等問題，可能會導致二代測序結果不盡如人意。需要進一步改進現有單細胞全基因組擴增體系，為加快牛的育種進程和促進牛的品種改良打下堅實基礎。

本研究基于不同數量活檢胚胎細胞、不同體系擴增結果、體系擴增成功率的統計，發現MDA體系" 擴增1C、5C、10C樣本和總體的擴增產物濃度和總質量都極顯著高于MALBAC體系，造成這種情況是由于兩個體系所采用的原理不同導致的。MDA體系是基于指數擴增的原理^{［14，16］}，而MALBAC體系是基于準線性擴增的原理^{［14，31-32］}。同時，本研究結果顯示MDA體系擴增1C胚胎樣品的擴增成功率為100%，比Fu等^［25］的MDA體系擴增單個卵裂球成功率（94.44%（85/90））高。原因可能是由于本研究中擴增的樣品數量較少，且樣本量較小，可能會導致隨機誤差。同時MDA的擴增成功率高于MALBAC體系，尤其是MALBAC體系擴增1C樣品的成功率較低。造成這種現象的原因可能是活檢得到的單細胞在試驗中可能存在已經死亡的情況，死亡細胞的雙鏈DNA會發生斷裂、產生DNA片段化^［33］，這同樣會導致擴增成功率的下降。

本研究通過對1C、5C和10C活檢胚胎細胞擴增產物的比對統計結果、總體比對統計結果進行分析，發現MDA體系10C樣品的比對率顯著高于MALBAC體系，與Hou等^［34］擴增人胃癌細胞分析出的單細胞獲得的比對率結果相似（MDA vs. MALBA為（98.11±0.363）% vs. （97.68±0.165）%）。但MALBAC體系的正確比對率極顯著高于MDA體系，這說明了MALBAC體系的擴增產物文庫測得的可以比對到參考基因組上的reads數目更多，擴增的隨機偏差較小^［14］。同時，MALBAC體系1C樣品的重復率顯著高于MDA體系、MALBAC體系10C樣品的重復率極顯著高于MDA體系，這說明MALBAC體系的重現性更好。Zhou等^［14］的研究同樣表明，MALBAC體系的均勻性更好，但重復率較高，因為MALBAC是準線性擴增，可以抑制擴增的隨機偏倚。

本研究同時對1C、5C和10C活檢胚胎細胞擴增產物的測序深度和覆蓋度、總體測序深度和覆蓋度進行分析，發現MDA體系擴增10C樣品的1、5、10×覆蓋度極顯著高于MALOBAC體系，此結果與Hou等^［34］研究中的覆蓋度（MDA vs. MALBAC=84% vs. 52%）結果大致相同，Zhou等^［14］同時也證明了MDA體系在基因組覆蓋度方面更好，這主要是因為MDA體系所使用的是高度合成的phi 29 DNA聚合酶，可以快速生成長單鏈擴增產物，均勻覆蓋基因組^［15］。

本研究發現，MALBAC擴增1C樣本和全部樣本的分型一致率都極顯著高于MDA體系。有學者研究了MDA體系擴增?；顧z10C樣本的分型一致率平均為72.45%（16個樣本）^［26］，低于本研究10C樣本的分型一致率為91.71%（5個樣本），造成這種情況可能的原因是本研究為全基因組測序結果，而該學者采用的是54K SNP芯片的檢出結果。與此同時，MDA體系擴增1C樣本和總體樣本的等位基因缺失率和假陽性率都顯著高于MALBAC體系，與Lauri等^［26］發現的MDA體系的ADO率較高的結論一致，也有研究發現單細胞全基因組擴增的ADO率從4%到50%或更高不等^{［25，35-40］}，但本研究MDA體系的ADO率在0.35%～12.71%之間，平均為4.38%，小于這些學者的研究結果，出現這種結果可能的原因是本試驗所使用的MDA體系經過改進。其次，Zong等^［31］同樣研究過兩種體系擴增產物的測序質控，在他的研究中，MALBAC體系容易受到環境和操作者的污染、低檢出率和ADO、擴增和測序相關的隨機和系統誤差^［41］，從而導致較高假陽性率，而本研究結果可能是由于較少的樣本量導致的系統誤差。MDA體系擴增10C樣本的10×檢出率顯著高于MALBAC體系，這說明了MDA體系的保真度較高^［34］，可以較為準確地擴增出基因組序列信息，可以比對上的SNPs位點較多，也存在MALBAC體系本身假陽性率較高的原因會導致檢出率較低^［31］。

本研究在最后對全同胞、半同胞樣本進行了分型一致性分析，發現MDA體系擴增全同胞、半同胞胚胎樣本的測序分型一致率較高，造成這種結果可能是由于MDA體系尚不成熟。此外，全同胞胚胎樣本之間分型一致率差異較大，這主要是因為全同胞的胚胎樣本也會有不同的遺傳組合^［42-43］、雌雄配子形成過程中的交叉互換^［43］、基因突變等因素的影響，而半同胞的分型一致率低于全同胞樣本，這可能是因為半同胞胚胎樣本本身母本基因型不同導致的。

4 結 論

本研究通過兩種單細胞全基因組擴增體系對?；顧z體內細胞樣本進行擴增，之后進行二代測序，統計分析后的研究結果表明，MDA體系對牛活檢胚胎細胞的擴增效果好，MALBAC體系擴增產物的測序效果好。此外，兩種體系中10C樣本的擴增效果和測序效果優于1C和5C樣本。最后，MDA體系擴增全同胞、半同胞胚胎樣本的分型一致率較高，表明MDA體系尚不成熟。

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（編輯 郭云雁）