TRIM39.2過表達對雞巨噬細胞轉錄表達的影響

摘 要： 旨在探究雞主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）定位的TRIM39.2過表達對雞巨噬細胞轉錄表達譜的影響。本研究通過RT-qPCR構建雞TRIM39.2基因組織表達譜，克隆雞TRIM39.2基因并構建攜帶標簽的重組表達載體。分別轉染空載體和TRIM39.2真核表達載體至HD11細胞內，收獲RNA制備文庫并進行轉錄組測序及生物信息學分析。篩選差異表達基因，隨后進行GO和KEGG富集分析，并用RT-qPCR方法進一步驗證轉錄組測序結果。結果表明，與其他組織相比，脾臟中TRIM39.2的表達最高。成功克隆了雞TRIM39.2基因，并構建了攜帶Myc標簽的重組表達載體pCAGGS-Myc-TRIM39. 并驗證了重組載體成功在雞HD11細胞中表達TRIM39.2重組蛋白。轉錄組測序分析獲得了33個顯著差異表達基因。GO分析主要富集于細胞因子的活性特性及其參與介導的信號傳導途徑。KEGG分析則主要富集于細胞因子與受體間的相互作用及RIG-I樣受體信號等通路。雞TRIM39.2基因在巨噬細胞介導的免疫應答和信號傳導中具有重要的調控作用，尤其對RIG-I樣受體介導的I型干擾素信號通路具有正調控作用，本研究為進一步豐富雞RIG-I樣受體信號通路調控網絡奠定基礎。

關鍵詞： TRIM39.2；雞巨噬細胞；轉錄組；GO；KEGG

中圖分類號：S831.2"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0178-11

收稿日期：2024-07-23

基金項目：國家自然科學基金（32002271）；國家肉雞產業技術體系（CARS-41）

作者簡介：吳 雙（1999-），女，江蘇東海人，碩士，主要從事家禽免疫學研究，E-mail：775216658@qq.com

*通信作者：陳世豪，主要從事家禽免疫與分子抗病育種研究，E-mail： mrrchen@yzu.edu.cn

The Effect of TRIM39.2 Overexpression on the Transcriptional Expression of Chicken

Macrophages

WU" Shuang YIN" Na YU" Mohan PING Yuyu2， BAI" Hao CHEN" Shihao "CHANG" Guobin¹

（1.College of Animal Science and Technology， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China;

2.College of Veterinary Medicine，Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract： "The study aimed to explore the effect of overexpression of TRIM39.2， localized in the chicken major histocompatibility complex （MHC）， on the transcription expression of chicken macrophages. The tissue expression profile of chicken TRIM39.2 gene was constructed using RT-qPCR.The chicken TRIM39.2 gene was cloned and a recombinant expression vector carrying the tag was constructed. HD11 cells were transfected with either an empty vector or a TRIM39.2 eukaryotic expression vector.RNA was harvested to prepare a library， and transcriptome sequencing and bioinformatics analysis were performed. Differentially expressed genes were screened， followed by GO and KEGG enrichment analysis， and RT-qPCR method was used to further verify the transcriptome sequencing results. The results showed that the expression of TRIM39.2 was the highest in the spleen compared to other tissues. The chicken TRIM39.2 gene was successfully cloned， and a recombinant expression vector carrying a Myc tag， pCAGGS-Myc-TRIM39.2，was constructed， and confirmed to express TRIM39.2 recombinant protein in chicken HD11 cells.Transcriptome sequencing analysis identified 33 significantly differentially expressed genes. GO analysis was primarily enriched in the active characteristics of cytokines and their involvement in signal transduction pathways.KEGG analysis mainly focused on the interactions between cytokines and receptors， as well as pathways such as RIG-I-like receptor signaling pathway. The chicken TRIM39.2 gene plays a significant regulatory role in macrophage-mediated immune responses and signal transduction， particularly in positively regulating the type I interferon signaling pathway mediated by RIG-I-like receptors. This study lays the foundation for further exploration of the regulatory mechanism of RIG-I-like receptor signaling pathway in chickens.

Key words： TRIM39.2; chicken macrophages; transcriptome; GO; KEGG

*Corresponding author： CHEN Shihao，E-mail：mrrchen@yzu.edu.cn

TRIM（tripartite motif）家族蛋白通常有RING、B-box和Coiled-Coil這3個自N端依次排列的結構域^［1］。此外，其C端還連接著一至兩個極具多變性且決定其功能特異性的結構域^［2］。不同的TRIM基因在組織中的表達存在差異^［3］。已有研究表明，TRIM家族蛋白參與細胞生長、分化和凋亡等生物過程，其中大都還與天然免疫調控和疾病的發生有關^［4-5］。

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）廣泛指代一類編碼關鍵免疫識別分子的基因群，是免疫系統的重要組成部分，在抗原呈遞和免疫應答方面起重要作用^［6］。研究報道，位于人MHC基因座上的TRIM10、TRIM15、TRIM26、TRIM27、TRIM31、TRIM38、TRIM39和TRIM40這8個TRIM基因均與免疫調節相關^［7-10］。例如，人TRIM38是一個先天性免疫的負調控因子，通過催化底物蛋白（如TRAF6、TRIF和IKKα/IKKβ）發生K48連接的多泛素化修飾，促進其被蛋白酶體識別并降解的過程，能夠有效抑制TLR（Toll樣受體）及RLR（視黃酸誘導基因I樣受體）信號通路的活化^［11-13］。人TRIM39具有炎性調控作用，它通過依賴E3泛素酶活性穩定鈣調蛋白以減弱TLR和TNF-α介導的RelA/p65易位，抑制IL-6和IL-8的表達^［14］。在哺乳動物中，TRIM39還具有通過調節I型干擾素（IFN）反應和宿主免疫防御來預防病毒感染的功能^［15］。

雞TRIM39.2屬于TRIM蛋白家族的一員，并且定位在16號染色體雞主要組織相容性復合體。雖有研究表明，雞TRIM39.2具有抑制J亞型禽白血病病毒復制的作用^［16］，但它在免疫調控方面的功能仍需進一步明確。本研究旨在通過轉錄組測序探究過表達雞TRIM39.2對雞巨噬細胞HD11表達譜的影響，深入分析TRIM39.2基因表達所涉及的信號通路，為認識TRIM39.2基因及其雞MHC基因組功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞HD11巨噬細胞系由本實驗室傳代保存；真核表達載體pCAGGS-Myc由本實驗室保存。采集5只21日齡SPF級白色來航雞（來自浙江立華農業科技有限公司）的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、法氏囊、十二指腸、空腸等組織放入液氮速凍后，轉移保存在-80℃冰箱中。

2×Phanta Max Master Mix、DL2000 DNA Marker、DNA純化試劑盒、DH5α感受態細胞均購自諾唯贊生物科技公司；質粒小提試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技公司；鼠源Myc標簽抗體（1∶1 000）購自日本MBL生物公司；PBS和DMEM購自Hyclone公司；胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 引物設計與合成

通過NCBI在線數據庫查詢到序列信息設計載體構建引物及熒光定量引物，合成的引物序列信息見表1。

1.3 真核表達載體pCAGGS-Myc-TRIM39.2的構建及鑒定

以HD11細胞cDNA為模板，PCR擴增TRIM39.2基因。對符合預期特征的電泳條帶進行回收，同時對pCAGGS-Myc載體進行雙酶切。將切膠回收得到的片段與雙酶切載體和PCR產物真核表達載體進行重組連接，轉化到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，再經涂板、挑菌、搖菌等一系列流程，選取陽性克隆菌送往金唯智生物公司進行測序，測序結果正確的菌繼續擴大培養，最終進行質粒小提并保存于-20 ℃。

1.4 蛋白質免疫印跡技術檢測重組質粒的表達

按照Highgene轉染試劑說明書，將制備的pCAGGS-Myc-TRIM39.2質粒轉染至巨噬細胞，培養24 h后將細胞收集到1.5 mL無酶管中。使用1 mL預冷PBS溶液洗滌細胞后每管加入100 μL配制好的細胞裂解液及蛋白酶抑制劑于冰上裂解細胞，后續Western blot試驗操作參考文獻［17］。

1.5 轉錄組測序及分析

將1 μg pCAGGS-Myc-TRIM39.2和1 μg pCAGGS-Myc分別轉染至HD11細胞，每組設3個重復，培養24 h后用1 mL Trizol試劑收集細胞并將其轉入1.5 mL無酶管中，放入裝有冰袋的泡沫箱內低溫運送至廣州基迪奧生物科技有限公司，進行RNA樣本制備、文庫制備及文庫質檢。對測序所得的原始數據進行質控，得到有效數據進行后續的分析。

1.6 基因差異表達分析

使用DESeq2軟件進行基因差異表達分析，步驟分為以下三步：首先對基因表達水平分析中得到的reads count數據進行標準化；其次根據模型進行假設檢驗概率（P value）的計算；最后進行多重假設檢驗校正，得到FDR值（錯誤發現率）。

基于差異分析結果，設定閾值為log 2FCgt;1和FDRlt;0.05，篩選顯著差異表達基因。

基于GO數據庫和有關Pathway的主要公共數據庫進行GO和KEGG富集分析，取FDR值最小的前15項GO和KEGG富集結果進行作圖。

1.7 統計分析

RT-qPCR數據結果采用2^-△△Ct法處理。使用GraphPad Prism 8.0這一統計軟件工具進行統計分析，并以“均值±標準差（SD）”的形式呈現結果，以確保數據的精確表達與解讀。

2 結 果

2.1 雞不同組織中TRIM39.2基因的表達分析

由圖1可知，TRIM39.2基因在21日齡的SPF級白色來航雞的各個組織中均有表達，其中在脾臟中的表達量最高，表明TRIM39.2可能參與脾臟中的免疫反應；在腎臟和空腸中表達量次之；在肺臟中表達量最低。

2.2 真核表達載體的構建與鑒定

PCR擴增TRIM39.2基因的電泳結果如圖2A所示，在靠近1 500 bp處有條帶，與目的條帶1 392 bp較為相符；對條帶進行切膠回收并與pCAGGS-Myc雙酶切載體進行重組連接。后續菌檢顯示，1號、3號、4號和5號在靠近1 500 bp處均有條帶（圖2B），選擇1號菌液送至金唯智生物科技公司進行測序；測序結果表明融合Myc標簽的雞TRIM39.2重組載體構建正確，命名為pCAGGS-Myc-TRIM39.2。

2.3 Western blot檢測雞TRIM39.2蛋白表達

為檢測TRIM39.2融合蛋白表達情況，將質粒轉染到HD11細胞并進行了Western blot分析。試驗結果清晰地展示了Myc標簽蛋白能夠有效識別目標重組蛋白，且該蛋白的分子量約為55 ku，與預期一致（圖3）。進一步分析表明，所構建的pCAGGS-Myc-TRIM39.2重組載體成功表達了帶有Myc標簽的TRIM39.2重組蛋白，為后續的過表達試驗奠定了基礎。

2.4 轉錄組測序差異基因的篩選

通過應用Fastp軟件對原始數據進行質控（表2），最終6個樣本獲得了37 817 626～46 438 132條高質量的有效數據。其中Q20值和Q30值均大于99％，表明測序數據質量的優質性，且符合后續試驗分析及研究需求的標準。

2.5 差異表達基因分析

對MOCK和TRIM39.2組轉錄組數據進行分析發現，顯著差異表達基因共有33個，其中24個基" 因上調，9個基因下調（圖4）。

2.6 差異基因的GO生物學功能分析

經過GO功能富集分析發現，差異表達基因顯著富集于多個關鍵生物學過程，包括細胞因子活性調控、細胞因子和趨化因子介導的信號傳導路徑，以及中性粒細胞定向遷移能力等（圖5）。

2.7 差異基因的KEGG代謝與信號通路分析

KEGG富集分析顯示，這些通路主要聚焦于免疫與疾病相關的信號傳導上。其中，富集到的前5條通路分別為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、RIG-I樣受體信號通路、胞質DNA識別與應答途徑、甲型流感病毒以及I型單純皰疹病毒感染（圖6）。

2.8 實時熒光定量PCR驗證

為進一步確認轉錄組測序數據，隨機挑選5個顯著差異基因 （SAMD9L、IFNW1、IFIH1、CCL19和LYZ） 進行qPCR驗證。結果如圖7所示，過表達TRIM39.2導致SAMD9L、IFNW1、IFIH1及CCL19基因的表達量均顯著上調，而LYZ基因的表達量顯著下調。結果顯示這些基因表達趨勢與轉錄組測序結果一致，表明轉錄組測序數據可信。

2.9 TRIM39.2對RIG-I樣受體信號通路相關免疫基因表達水平的影響

KEGG分析結果表明，RIG-I樣受體信號通路是第二富集的信號通路，推測TRIM39.2在RIG-I樣受體信號通路中具有重要的調控作用。因此，又進一步檢測了TRIM39.2過表達對RIG-I樣受體信號通路相關基因表達的影響。結果由圖8可知，與對照組相比，過表達雞TRIM39.2能顯著促進poly（I：C）誘導的MDA5、IFNβ、OASL和MX1的表達水平（Plt;0.05），而對TRIM25、TBK1、IRF7的表達無顯著影響（Pgt;0.05）。

3 討 論

主要組織相容性復合體（MHC）作為一類高度多態的基因家族，在抗原呈遞過程中發揮核心作用，同時還與宿主的免疫應答能力和疾病易感性密切相關^［18］。雞TRIM39.2定位在雞MHC-B基因座^［19］，已有研究發現TRIM39.2的表達可以顯著抑制禽白血病病毒復制，且RING結構域和B-box結構域在抑制禽白血病病毒復制過程中起著重要的作用^［16］。而雞TRIM39.2是否具有免疫調控作用還未證實。本研究通過分析SPF雞不同組織中的TRIM39.2基因表達，結果表明TRIM39.2基因主要在免疫器官中表達。脾臟作為重要的免疫器官，TRIM39.2基因表達量最高，暗示其可能在免疫調節和抗病毒防御等方面起到重要作用。

通過轉錄組測序分析發現，雞巨噬細胞過表達TRIM39.2導致一些與免疫應答和信號傳導相關的信號通路被富集。細胞因子與細胞因子受體相互作用通路是顯著富集的通路，它涉及免疫反應和炎癥過程。例如，TRIM39.2過表達導致趨化因子CCL19和CCL20表達顯著改變，其中CCL19表達量上調，而CCL20表達量下調。這一發現揭示了TRIM39.2基因在調控細胞因子受體相互作用通路中的復雜性，不同趨化因子在特定生理或病理條件下可能扮演著截然不同的角色^［20］。IFNK和IFNW1都是I型干擾素家族的成員，在宿主防御病毒感染中發揮重要作用^［21］。這些結果表明，TRIM39.2過表達導致I型干擾素顯著激活，揭示了其在天然免疫調控中的重要作用。本課題組先前的研究表明，SAMD9L表達能顯著抑制ALV-J復制^［17］，同樣有研究表明TRIM39.2具有抗ALV-J的作用^［16］，其涉及的分子機制或與此密切相關。

RIG-I樣受體是一類模式識別受體（（pattern recognition receptor，PRR），它在抗RNA病毒先天性免疫中發揮重要作用^［22-23］。雞基因組天然缺乏RIG-I基因，因此目前普遍認為另一個識別受體基因IFIH1（又名MDA5）在此通路中承擔更重要的生物學功能^［24］。本研究發現，TRIM39.2過表達導致IFIH1基因顯著上調，同時RIG-I樣受體信號通路顯著被富集。隨后對此通路進行進一步qPCR分析結果表明，TRIM39.2過表達顯著促進MDA5介導的I型干擾素信號通路（胞內poly（I：C）-HMW被MDA5特異性識別），并促進下游抗病毒基因如OASL和MX1的表達顯著升高，對信號傳導分子TRIM25、TBK1、IRF7表達無顯著影響，推測與TRIM25泛素化^［25］、TBK1^［26］和IRF7^［27］磷酸化等修飾有關，需要進一步用Western blot檢測相關表達。

總之，本研究通過解析TRIM39.2組織表達譜并利用過表達檢測其轉錄組表達譜，證明了雞TRIM39.2在天然免疫調控中具有重要作用。本研究結果表明，TRIM39.2過表達正調節RIG-I樣受體通路，暗示了其抗RNA病毒的潛力，同時表明了TRIM39.2抑制ALV-J復制的潛在分子機制，但它如何調控RIG-I樣受體通路仍需進一步明確。

4 結 論

雞TRIM39.2基因在脾臟中表達最高。TRIM39.2基因過表達可促進雞巨噬細胞的轉錄表達過程中細胞因子和信號傳導活性，影響諸多免疫相關基因的表達。尤其，TRIM39.2過表達顯著促進RIG-I樣受體信號激活，為雞TRIM39.2在抗RNA病毒中的應用和天然免疫調節中的作用機制解析提供了科學基礎。

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