豬卵母細胞玻璃化冷凍損傷的緩解策略

摘 要： 卵母細胞的冷凍保存是人類和動物輔助生殖中長期儲存遺傳資源的重要策略之一。然而，由于卵母細胞的表面積/體積比小、細胞滲透性差，在冷凍過程中極易受到冰晶形成、滲透性休克、氧化應激和冷凍保護劑毒性等損傷，嚴重降低其解凍后的發育能力。與其他動物相比，豬卵母細胞中豐富的脂滴含量降低了其低溫耐受性，冷凍保存難度更大。盡管可以從玻璃化未成熟卵母細胞中獲得活仔豬，但與新鮮卵母細胞相比，玻璃化冷凍卵母細胞的發育能力還有待進一步提升。本文主要從玻璃化冷凍豬卵母細胞的損傷類型、受損機制、緩解冷凍損傷的策略等方面進行綜述，為進一步建立和完善豬卵母細胞玻璃化冷凍保存方案提供參考。

關鍵詞： 豬；卵母細胞；玻璃化冷凍；冷凍損傷

中圖分類號：S814.6"""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0036-09

收稿日期：2024-05-28

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD1200301）

作者簡介：孫雅雯（1999-），女，山東泰安人，碩士生，主要從事動物繁殖研究，E-mail：sunyw0917@163.com

*通信作者：龐云渭，主要從事動物繁殖研究，E-mail：pangyunwei@caas.cn；王 棟，主要從事動物繁殖研究，E-mail：dwangcn2002@vip.sina.com

Strategies for Alleviating Cryoinjury of Porcine Vitrified-Oocytes

SUN" Yawen， CHEN" Siying， LI" Kang， LENG" Xuan， WANG" Dong*， PANG" Yunwei*

（Institute of Animal Sciences， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract： "Cryopreservation of oocytes is one of the important strategies for long-term storage of genetic resources in both humans and animal-assisted reproduction. However， due to the low surface-volume ratio and poor cell permeability， oocytes are more susceptible to cryoinjuries during vitrification， including ice crystals formation， osmotic shock， oxidative stress， and cryoprotectants toxicity， which seriously decreases their developmental ability after thawing. In contrast to other animals， porcine oocyte cryopreservation is more challenging owing to its abundant lipid droplets and poor hypothermia tolerance. Although live piglets have been produced from vitrified immature oocytes， the developmental competence of vitrified-oocytes remains to be further promoted compared with fresh oocytes. This paper mainly reviews the injury types， the mechanisms of damage， as well as the alleviating strategies of porcine vitrified-oocytes. It will provide further reference for establishing and improving the vitrification protocol of porcine oocytes.

Key words： porcine; oocytes; vitrification; cryoinjury

*Corresponding authors：" PANG Yunwei， E-mail： pangyunwei@caas.cn;WANG Dong， E-mail： dwangcn2002@vip.sina.com

卵母細胞冷凍保存技術是胚胎生物工程的重要組成部分。通過冷凍保存卵母細胞，不僅可以在不受時間和空間限制的條件下長期保存珍稀瀕危物種的遺傳資源，還可建立雌性動物基因庫，為體外受精、體細胞核移植、胚胎移植等技術研究提供豐富的卵母細胞資源^［1］。隨著低溫生物學的不斷發展，卵母細胞的冷凍損傷機理不斷被闡明，冷凍保存體系逐步被優化，卵母細胞解凍后發育能力不斷提高。

與牛、羊等反芻動物相比，豬卵母細胞的脂質含量更加豐富，對低溫耐受性更差^［2］。1992年，Rubinsky等^［3］首次采用玻璃化冷凍法冷凍保存豬生發泡（germinal vesicle，GV）期卵母細胞，但解凍后卵母細胞存活率僅為24.5%。在此后的幾十年里，通過對冷凍保護劑、冷凍載體以及解凍程序的不斷優化，豬玻璃化冷凍卵母細胞解凍后存活率顯著提高，但直到2014年才有玻璃化冷凍卵母細胞獲得活仔豬的報道^［4］。目前，豬GV期和第二次減數分裂中期（metaphase II，MII）卵母細胞玻璃化冷凍-解凍后存活率可分別達60%～70%和80%～90%，但與新鮮卵母細胞相比，玻璃化冷凍GV期（孤雌激活：0.41%～12%；體外受精：0.79%～13.5%）、MII期卵母細胞（孤雌激活：3.1%～32.5%；體外受精：2%～9.2%）解凍后發育到囊胚階段的能力依然很低，嚴重阻礙了該項技術的產業化應用。因此，本文從玻璃化冷凍豬卵母細胞的損傷類型、受損機制、緩解冷凍損傷的策略等方面進行綜述，為探尋有效的豬卵母細胞低溫保存方法提供新思路。

1 玻璃化冷凍豬卵母細胞的損傷類型

卵母細胞玻璃化冷凍是指將卵母細胞在含有高濃度冷凍保護劑的冷凍液中短暫處理，快速置換出卵母細胞中的水分，迅速將卵母細胞置于冷凍載體上直接投入液氮的一種超速冷凍方法。相比于程序化冷凍法，玻璃化冷凍法具有降溫速度快、操作簡單、不需尋找最佳冷卻和升溫速率等優點^［5-6］。然而，冷凍和解凍過程中的溫度和滲透壓變化、冷凍保護劑毒性等均會對卵母細胞的超微結構、生理生化及分子水平造成損傷（圖1），降低其解凍后發育能力。

1.1 細胞結構損傷

卵母細胞的表面積與體積比較小，細胞膜滲透性差，在玻璃化冷凍過程中不易充分脫水，造成細胞皺縮、透明帶破裂脫落、卵周隙增大、線粒體分布異常等不同程度的損傷，降低玻璃化冷凍效率^{［ 7］}。研究發現，玻璃化冷凍不僅會造成豬卵丘-卵母細胞間的微絨毛斷裂或消失，破壞間隙連接，影響卵丘-卵母細胞間的通訊^［8］，還會破壞微絲聚合肌動蛋白與游離肌動蛋白的動態平衡，且在解凍后無法恢復^［9］。Lpez等^［9］發現，豬GV期玻璃化冷凍卵母細胞解凍后進行體外受精，早期胚胎肌動蛋白微絲正常分布率顯著低于對照組（67% vs. 29%）。多數經玻璃化冷凍保存的豬MII期卵母細胞，附著于其染色體的紡錘體微管蛋白會部分或完全分解，導致紡錘體紊亂、著絲粒松動、染色體中斷，阻礙減數分裂后期姐妹染色單體向相反兩極的正確分離，最終導致非整倍體的形成^［7，10］。此外，許多研究發現，豬玻璃化冷凍GV期卵母細胞內出現大量空泡，有的空泡會與線粒體形成線粒體-空泡復合體，造成線粒體嵴模糊，電子密度降低^［10-12］。玻璃化冷凍還會造成豬GV期卵母細胞中的大脂滴破碎成許多形狀不規則的小脂滴，破壞其與線粒體的相互作用^{［10，13］}。

1.2 生理生化損傷

玻璃化冷凍過程中，冷凍保護劑暴露、滲透應激以及氧化代謝增加等過程會產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），造成卵母細胞發生脂質過氧化、DNA損傷和蛋白質氧化^［14-15］，這是導致玻璃化冷凍卵母細胞發育受損的主要因素之一。研究人員發現，玻璃化冷凍-解凍卵母細胞谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平降低，H2O2水平增加，表明玻璃化冷凍損害了卵母細胞的抗氧化防御能力^［16］。冷凍保護劑暴露會促使卵母細胞中大量Ca²⁺從內質網釋放到細胞質，沉積于線粒體中，造成線粒體Ca²⁺過載，線粒體通透性轉換孔持續開放，導致線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降和ATP耗竭，加劇ROS產生，并伴隨細胞色素C和促凋亡因子的不斷釋放，最終導致卵母細胞凋亡。Dai等^［17-19］研究發現，玻璃化冷凍豬卵母細胞解凍后，線粒體膜電位和ATP含量降低，ROS水平升高，細胞凋亡相關基因caspase 3、caspase 8、caspase 9和pan caspase表達異常。過量ROS還會破壞內質網的氧化還原穩態，增加蛋白質的錯誤折疊率，引發內質網應激^［20-21］。最新研究報道，玻璃化冷凍顯著下調豬卵母細胞內質網蛋白加工相關因子EDEM2、BAG1、CALR的表達，導致內質網功能異常^［21］。而通過在體外成熟過程中添加抗氧化劑或與新鮮卵母細胞共培養，可部分恢復玻璃化冷凍對卵母細胞造成的非致死性損傷^［22-23］。

1.3 分子水平損傷

卵母細胞的表觀修飾水平和轉錄組譜對玻璃化冷凍誘導的應激非常敏感。有證據表明，玻璃化冷凍-解凍過程會造成卵母細胞DNA甲基化和組蛋白修飾水平異常，損害解凍后卵母細胞的發育能力^［24-25］。Cheng等^［26］研究發現，玻璃化冷凍降低了卵母細胞DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）表達，破壞了囊胚印跡基因H19、Peg3和Snrpn的DNA甲基化修飾，導致基因組穩定性受損，最終誘發細胞死亡。與新鮮組卵母細胞相比，玻璃化冷凍卵母細胞的整體甲基化水平和表觀遺傳重編程基因DNMT1、DNMT3B、HDAC1和SUV39H1的mRNA水平均顯著下調^［27-28］。玻璃化冷凍還會改變豬卵母細胞的H4乙酰化和H3K9甲基化水平，降低其發育能力^［29］。Chen等^［30］研究發現，玻璃化冷凍卵母細胞和早期卵裂胚胎的H3K9me3修飾水平顯著低于對照組，但H3K9的乙酰化水平在早期卵裂胚胎中顯著升高，并且印跡基因PEG10、XIST和KCNQ1O1T在囊胚中的表達上調，這些表觀修飾異常可能是玻璃化冷凍卵母細胞發育能力受損的重要標志^［31］。

玻璃化冷凍造成的卵母細胞損傷還與基因表達異常有關。Jia等^［32］對豬玻璃化冷凍-解凍GV期卵母細胞及其周圍卵丘細胞進行RNA測序分析，發現玻璃化冷凍顯著降低了調控Wnt和MAPK信號通路的WIPI2基因的表達，這可能是冷凍引起卵母細胞質量受損的因素之一。此外，玻璃化冷凍還降低了卵母細胞中參與早期胚胎發育的Mater基因、參與微管結構定位的Hook1基因和紡錘體組裝檢查點相關基因Mps1和Mad1等的表達^［33］。

2 玻璃化冷凍豬卵母細胞的受損機制

玻璃化冷凍卵母細胞的損傷機制主要有以下幾種（圖1）：1）高濃度冷凍保護劑引起細胞脫水導致的滲透損傷，即通常所說“溶液效應”^［34］。在玻璃化冷凍過程中，高濃度的冷凍保護劑使卵母細胞內外形成極大的滲透壓差，導致水分急速從細胞內流出，引起胞質溶液濃度上升，細胞發生皺縮。當滲透速率過快時，卵母細胞發生滲透性休克^［35-36］。這一過程引起卵母細胞透明帶和膜蛋白變性，膜的通透性改變，細胞蛋白合成能力受損^［37］。Rusciano等^［38］研究表明，玻璃化冷凍會改變卵母細胞透明帶中脂質、碳水化合物和蛋白質的結構，誘導蛋白質二級結構從α-螺旋轉變為β-折疊形式，造成透明帶硬化，精子穿透能力下降，降低卵母細胞的發育能力。2）冰晶損傷，包括降溫過程中的冰晶損傷以及解凍過程中的冰晶重結晶損傷。在低溫條件下或冷卻速率過快時，細胞內水分與細胞外冷凍保護劑無法充分置換，細胞內水分不可避免地轉化為冰晶，冰晶形成的尖銳邊緣和生長過程中熱力學變化均會損傷卵母細胞的細胞膜和內質網、線粒體等超微結構，對細胞造成機械損傷^［36］。而在解凍過程中，溫度升高使細胞內冰晶發生重結晶，即小冰晶融合為大冰晶，冰晶的進一步生長會加劇水分流失，促進蛋白質和脂質氧化，對細胞造成致命損傷^［39］。

豬卵母細胞因豐富的甘油三酯儲備，脂肪酸含量較牛、羊等反芻動物更高，這種物種特異性使其對低溫更敏感，在玻璃化冷凍后更易遭受低溫損傷^［40］。低溫損傷是一種不可逆的損傷，主要發生在卵母細胞冷凍過程中的脂質相變溫度下。豬GV期卵母細胞質膜相變溫度為13～20 ℃，而MII期卵母細胞為10 ℃左右^［41］。在此溫度下，脂質從液晶相轉變為凝膠相，膜的正常功能受到影響，玻璃化冷凍效率顯著降低。

3 豬卵母細胞冷凍損傷的緩解策略

3.1 增強滲透調節策略

在低溫脅迫下，自然界中許多生物自身會分泌產生一些能被機體利用的小分子物質，它們無毒且具有良好的生物相容性，通過平衡細胞內外滲透壓，為機體提供冷凍保護^［42］。采用高效無毒、高滲透性和強抑制冰晶能力的新型冷凍保護劑，降低傳統冷凍保護劑的化學毒性，為提高卵母細胞玻璃化冷凍效率提供了新思路。

研究發現，甘氨酸和L-肉堿等都是理想的滲透性冷凍保護劑，能保護細胞膜完整性和穩定亞細胞結構^［43-44］。甘氨酸是一種天然氨基酸，無毒且具有良好的滲透能力，在卵母細胞內可通過特定的運輸系統被吸收，防止細胞的滲透損傷和毒性損傷^［45］。Tang等^［43］在玻璃化冷凍液、解凍液和體外成熟液中分別添加6 mmol·L^-1甘氨酸，發現解凍后卵母細胞存活率和成熟率提高，早期凋亡率降低，皮質顆粒和線粒體正常分布比例升高，ATP含量增加。在高滲環境下，L-肉堿通過主動轉運調節細胞體積，維持細胞結構穩態^［44］，也可作為滲透性冷凍保護劑，降低細胞的滲透損傷。細胞松弛素B是一種細胞滲透性肌動蛋白聚合抑制劑，采用7.5 μg·L^-1細胞松弛素B預處理豬GV期卵母細胞30 min，可降低玻璃化冷凍引起的卵母細胞的細胞骨架異常分布比例，促進皮質顆粒-微絲遷移，解凍后卵母細胞存活率、成熟率和孤雌激活囊胚率顯著提高^［46］。水通道蛋白（aquaporin，AQP）是冷凍卵母細胞時胞內水和胞外冷凍保護劑發生置換的關鍵蛋白，通過在豬卵母細胞中外源表達編碼人AQP3或斑馬魚Aqp3b-T85A突變體蛋白，卵母細胞對乙二醇的滲透性分別比對照組提高6.7倍和12倍，表明在豬卵母細胞中外源表達AQP3可能是減少玻璃化過程中冷凍保護劑誘導的滲透應激的有用策略^［47］。

3.2 抑制冰晶形成策略

受自然界耐寒生物抗凍機制的啟發，一些新型仿生控冰材料的開發和應用為建立高效卵母細胞冷凍保存策略提供了新思路。抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）是一類可抑制冰晶生長的蛋白質，不僅能有效抑制冰晶的形成、生長和重結晶，還能降低溶液冰點，維持細胞膜穩定^［48］。采用含500 ng·mL^-1 AFP Ⅲ的玻璃化冷凍液冷凍保存豬GV期卵母細胞，解凍后卵母細胞ROS水平降低，DNA損傷減輕，體外發育能力明顯改善^［49］。人造冰阻滯劑Supercool X-1000和羧化聚L-賴氨酸均具有類似抗凍蛋白的活性，可有效降低凍融過程中的冰晶重結晶，與傳統冷凍保護劑聯合應用均能顯著提高解凍后卵母細胞的存活和發育能力^［50-52］。納米顆粒不僅可以改變保護液黏度，還能降低冰晶形成面積，采用添加0.05% 納米顆粒的玻璃化冷凍液冷凍保存豬GV期卵母細胞，解凍后卵母細胞存活率顯著提高^［53］。

此外，冰晶的形成和生長與冰晶成核溫度密切相關，控制冰晶成核也能有效降低冰晶損傷^［34］。結晶膽固醇是一種化學冰成核劑，冷凍液中添加結晶膽固醇可顯著升高溶液成核溫度，提高細胞解凍后存活率，增強細胞的蛋白合成與代謝能力^［54］。

3.3 促進脂質重塑策略

脂質重塑是指生物體內脂質的種類、數量和分布在不同生理狀態下發生的改變，這些變化會影響細胞的生理功能。豬卵母細胞含有大量的脂滴，在玻璃化冷凍過程中更易發生脂質相變，導致細胞膜流動性降低、通透性變差，且在解凍后無法恢復^{［13，55］}。研究發現，通過增加不飽和脂質或脂肪酸的含量和比例，縮短脂肪酸鏈長度等脂質重塑策略，可以在低溫下維持細胞膜流動性，增強細胞的抗凍能力^［56-57］。與新鮮卵母細胞相比，玻璃化冷凍卵母細胞中特異性磷脂水平顯著下調，而在玻璃化液中補充聚乙二醇8000（polyethylene glycol 8000，PEG 8000）可增加卵母細胞的磷脂和鞘脂含量，表明PEG 8000可作為膜穩定劑用于卵母細胞的冷凍保存^［58］。Aardema等^［59］比較了不飽和油酸或飽和硬脂酸與胚胎共孵育的玻璃化冷凍效果，發現與不飽和油酸共孵育的胚胎存活率和脂滴含量顯著提高。甲基-β-環糊精能有效調節細胞膜膽固醇含量，在冷凍前將豬GV期卵母細胞與5 mg·mL^-1的膽固醇-甲基-β-環糊精共孵育1 h，卵母細胞線粒體和透明帶的損傷程度降低，解凍后存活率和成熟率顯著提高^［60］。以上研究表明，通過脂質重塑穩定膜組成，改善膜流動性，對增強卵母細胞的低溫耐受性具有重要意義。

此外，在豬卵母細胞體外成熟液中添加毛喉素、L-肉堿、小檗堿等脂質調節劑，能有效降低卵母細胞脂質含量，提高卵母細胞的低溫耐受性，卵母細胞解凍后存活率和發育率、抗應激能力以及線粒體活性等均得到改善^［61-64］。

3.4 降低氧化損傷策略

目前，白藜蘆醇、褪黑素、α-生育酚、蝦青素等外源性抗氧化劑被廣泛用于卵母細胞玻璃化冷凍保存，通過直接或間接清除ROS來降低卵母細胞的氧化損傷^{［23，65-68］}。

多項研究發現，體外成熟液中添加白藜蘆醇顯著提高了豬玻璃化冷凍GV期卵母細胞解凍后的存活率、成熟率及早期胚胎發育率，且能增強卵母細胞線粒體的生物合成能力^{［23，65］}。在玻璃化冷凍液、解凍液和體外成熟液中分別添加2.5 μmol·L^-1蝦青素，解凍后卵母細胞存活率、孤雌激活和體細胞核移植囊胚發育率顯著提高^［68］。在豬玻璃化冷凍MII期卵母細胞解凍后的孵育液中添加線粒體靶向抗氧化劑Mito Q^［66］、α-生育酚^［67］或凋亡抑制劑Z-VAD-FMK^［69］，不僅能提高解凍后卵母細胞的發育能力，還能增強卵母細胞線粒體自噬能力，維持線粒體穩態，降低早期凋亡細胞比例。此外，聯合應用甘氨酸和褪黑素能同時減輕玻璃化冷凍和解凍引起的豬GV期卵母細胞的滲透和氧化應激，進一步增強其解凍后的發育能力^［43］。

3.5 工程化策略

玻璃化冷凍前的預處理時長、冷凍-解凍過程中冷凍保護劑的添加和脫除等均會對卵母細胞造成不可逆的損傷，影響其后續發育能力^{［34，36］}。各種先進的工程化策略的蓬勃發展為抑制冰晶形成、提高冷凍保存效率提供了新的途徑。微流體技術是利用微米級的微通道精確控制和操縱亞微米結構流體的技術，采用微流體裝置實現冷凍保護劑的添加和脫除，可大幅提高豬MII期卵母細胞玻璃化冷凍效率^［70-71］。還有研究發現，將微流控裝置與Cryotop載體搭配，可進一步提升卵母細胞的冷凍保存效果，有效減少卵母細胞的早期凋亡率和胞內ROS水平，降低線粒體損傷，提高卵母細胞的凍后質量^［72］。

受食品加工應用中高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）技術的啟發，在體外環境下，采用亞致死劑量的HHP處理配子和胚胎以提高其存活能力，增強應激耐受性，為哺乳動物細胞和組織的冷凍保存提供了一種全新的技術策略^［73］。Du等^［74］用20 Mpa的HHP對豬MII期卵母細胞進行預處理，恢復130 min后對卵母細胞進行玻璃化冷凍，發現HHP處理顯著提高了解凍后卵母細胞的孤雌發育能力。

各種緩解玻璃化冷凍卵母細胞損傷策略的優、缺點如表1所示。

4 總結與展望

豬卵母細胞的玻璃化冷凍保存技術在過去幾十年取得了重要進展，但由于豬卵母細胞對低溫極其敏感，目前尚未建立完善的冷凍保存方案。隨著拉曼光譜、透射電鏡以及蛋白質組學、轉錄組學、單細胞組學等新技術的發展和應用，深入解析豬卵母細胞的冷凍損傷機制，尋找損傷靶點，能夠為進一步開發豬卵母細胞冷凍保存技術提供理論依據。此外，采用具有良好生物相容性的高效仿生控冰材料替代傳統冷凍保護劑，并結合新型工程化策略，如微流體技術、納米級冷凍保護劑封裝技術、胞內冷凍保護劑遞送技術等，降低冷凍過程中的冰晶損傷和滲透應激，對建立完善高效的豬卵母細胞玻璃化冷凍保存體系具有重要意義。

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