3D細胞培養技術及其在毛囊發育研究中的應用

摘 要： 羊毛是重要的畜牧產品，由毛囊發育而來。毛囊是皮膚組織衍生的微器官，由毛囊干細胞、毛乳頭、毛母質、外根鞘和內根鞘等20多種細胞組成，結構及細胞間通訊復雜。因此，提高羊毛產量和品質的前提是充分了解各種細胞相互作用下的毛囊發育特征。目前，細胞培養技術主要分為2D細胞培養和3D細胞培養。傳統的2D細胞培養技術培養毛囊相關細胞時，與體內生長狀況差距較大，毛發誘導能力逐漸喪失。3D細胞培養是將細胞在模擬組織和器官特異性的3D結構中進行培養，通過模擬天然環境，允許細胞聚集成為一定的形態，并且促進細胞-細胞的交流、細胞-細胞外基質的交流，從而恢復一定的在體功能，彌補了傳統2D細胞培養的缺陷。本文簡單介紹了3D細胞培養模型及種類、構建方法及在毛囊發育和生命科學相關研究中的應用，并展望了3D細胞培養技術在毛囊發育研究和其它領域的發展前景。

關鍵詞： 3D細胞培養；毛囊；細胞外基質

中圖分類號：S852.2"""" 文獻標志碼：A""""" 文章編號： 0366-6964（2025）01-0015-11

收稿日期：2024-06-24

基金項目：國家自然科學基金（022304370026）

作者簡介：孔 辰（1999-），男，河南周口人，碩士，主要從事動物遺傳與育種研究，E-mail：15836923037@163.com

*通信作者：蔡 蓓，主要從事羊的遺傳育種及毛囊發育生物學研究，E-mail：caibei1115@163.com

3D Cell Culture Technology and Its Application in Wool Follicle Development Study

KONG" Chen， TIAN" Yun， GAO" Hongrui， CAI" Bei*

（Key Laboratory of Ruminant Molecular and Cellular Breeding of Ningxia Hui Autonomous Region， College

of Animal Science and Technology， Ningxia University， Yinchuan 75002 China）

Abstract： "Wool is an important livestock product that develops from wool follicles. wool follicles is a micro-organ derived from the skin tissue， which consists of more than 20 types of cells， including hair follicle stem cells， dermal papillae， hair matrices， outer root sheaths and inner heel sheaths， with complex structure and intercellular communication.

Therefore， in order to improve wool yield and quality， comprehensive understanding of the developmental characteristics of hair follicles under various cell interactions was needed in advance.

Currently， cell culture techniques are mainly categorized into 2D cell culture and 3D cell culture. Conventional 2D cell culture techniques for culturing wool follicle-associated cells are characterized by a large gap with in vivo growth conditions and a gradual loss of hair-inducing ability. 3D cell culture is the cultivation of cells in 3D structures that mimic the specificity of tissues and organs. By mimicking the natural environment， it allows cells to aggregate into a certain morphology and facilitates cell-cell communication， as well as cell-extracellular matrix communication， thus restoring a certain in vivo function， which makes up for the shortcomings of traditional 2D cell culture. This paper briefly introduces 3D cell culture models and types， construction methods， applications in various cell and wool follicle development studies， and looks forward to the development of 3D cell culture technology in hair follicle development studies and other fields.

Key words： 3D cell culture; wool follicles; extracellular matrix

*Corresponding author：" CAI Bei，E-mail：caibei1115@163.com

羊毛是羊養殖產業中的重要經濟產品，其發源于皮膚組織衍生的微器官——毛囊。毛囊是由上皮和間充質細胞相互作用形成的微器官，包含多種細胞種類和活性成分，具有復雜、精細的結構^［1］。目前，毛囊發育研究中常采用普通的2D技術培養毛囊相關細胞。在傳統2D培養中，毛囊相關細胞僅在單層細胞培養物表面生長，由于細胞承受了高度不自然的幾何和機械約束，其轉錄表達譜因受環境干擾而發生顯著改變，喪失誘導能力^［2］。與之相比，在三維層面培養細胞（three dimensional cell culture，3D），為細胞創造了類似于體內的微環境，使其恢復自然情況下的部分特征^［2］。例如，在3D條件下培養的毛乳頭細胞（dermal papilla cells，DPCs），其完整的真皮轉錄組特征得到部分恢復，表現出自然條件下皮膚誘導毛囊發生的能力^［3］。因此，在毛囊形態發生發育研究中使用3D細胞培養技術，能夠促進各種細胞的相互作用及信號分子的調控機制，進而揭示羊毛發育生長的機理，調控羊毛的生長發育。本文介紹了3D培養技術，概述了3D培養技術在研究毛囊形態發生和周期生長中的應用概況，為3D細胞培養技術應用于毛囊生長發育研究提供依據。

1 3D細胞培養模型研究進展

3D細胞培養被定義為在具有模擬組織和器官特異性的3D結構中培養細胞^［4］，允許細胞在三維空間生長并與周圍的細胞環境相互作用。該技術的開發彌補了2D培養技術中細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）難以互作的缺陷。

1.1 3D細胞培養模型

3D細胞培養技術開發和應用的一個重要的基礎是ECM^［5］。ECM主要是由各種細胞外分泌蛋白（如膠原蛋白、彈性蛋白、層黏連蛋白和糖胺聚糖等）以及細胞結合因子（如CD44和整合素等）組成的復雜網絡結構^［6］，其不僅為細胞的生長提供重要的結構支撐，并且參與調控許多細胞的生長過程，通過協調細胞的生長、存活、遷移、分化、穩態、黏附從而指導組織的形態發生^［7-9］。Berger等^［10］構建了用于研究體內腫瘤微環境的高通量微流控3D仿生系統，利用海藻酸鹽或海藻酸鹽-海藻酸鹽硫酸鹽水凝膠作為ECM模擬物，為乳腺腫瘤細胞提供類似于體內的腫瘤微環境，成功模擬體內環境，形成了大型乳腺腫瘤細胞來源的囊泡。3D細胞培養技術通過體外重建ECM，為組織細胞模擬體內環境，從而誘導細胞形成類似于體內組織結構的3D組織。

3D細胞培養技術允許細胞復雜形態的發展，因此基因表達情況更接近體內^［11］，且具有組織特異性^［12］，能更真實的代表體內組織，從而獲得與體內相關的生理數據。3D細胞培養與2D的差異主要體現在細胞形態、遷移以及基因表達（表1）。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種體細胞，來源于骨髓、臍帶、脂肪等組織，具有巨大的細胞治療潛力^［13］，但其分裂次數有限，一旦達到最大分裂次數，就會經歷復制性衰老，導致細胞凋亡^［14］。Krasnova等^［15］利用懸滴法構建了3D-MSC球體，衰老的MSC通過3D培養后失去衰老標志物，具有早期MSC表型。Hasan等^［16］利用聚二甲基硅氧烷創建了包含神經元自組裝層的3D培養物，這種3D結構具有自發的神經活動，類似于發育皮層中的活動，且與2D培養物相比，3D培養物對藥物的反應更接近體內數據。因此，3D培養技術作為體內和體外連接的橋梁，具有強大的優勢，既可在體外模擬體內微環境，還能直接觀測細胞的生長狀態，為揭示細胞發育成組織和器官的分子機制提供一定的研究方法。

1.2 3D培養模型的類型及構建方法

各類細胞在體內所處的環境存在差異性，細胞周圍的ECM成分各不相同，目前沒有單一的3D培養技術可滿足所有的細胞培養需求。因此，每一種細胞進行3D培養均需根據細胞的理化性質、ECM的組分、滿足細胞生存的生物支架材料和反應器構建最適宜的3D培養系統。目前，3D培養模型主要可以分為兩類，一類是基于支架或基質材料構建的有支架3D培養模型，另一類是無支架3D培養模型。

1.2.1 有支架的3D培養模型

基于支架技術的3D培養是利用天然或人工合成的聚合物模擬各種體內ECM環境條件使細胞生長和增殖^［17］，其培養模式如圖1。這些支架對化學成分、孔隙度、機械特性有一定的要求，允許細胞存在異質性^［18］，有利于細胞-細胞、細胞-ECM的交流^［19］，促進細胞增殖、遷移、分化、黏附，在體外形成類似于體內結構和功能的球狀體或類器官^［20］。天然的支架材料包括海藻酸鹽^［21］、瓊脂^［22］、明膠^［23］、層黏連蛋白^［24］、膠原蛋白^［25］、絲素蛋白^［26］等，這類材料與細胞的生物相容性好，通過提供體內基質分泌更多的生長因子和信號分子調節細胞行為^［27］。Long等^［28］利用海藻酸鹽和殼聚糖與大鼠肝細胞BRL-3A制備微膠囊細胞，以絲素蛋白凝膠作為支架材料形成凝膠-細胞微膠囊復合物，這種復合物在微重力環境培養下可增強細胞增殖，在組織構建領域具有一定的潛力。Hu等^［29］利用基質膠（Matrix Gel，MG）作為支架材料構建了小鼠原代肝細胞長期3D類器官培養系統，該類器官可以從單個肝細胞建立，保留了關鍵功能、形態和基因表達特征。

天然的支架材料生物相容性雖然優異，但存在一些局限性，如批次之間存在差異致使純度不一樣，可重復性差，且可能攜帶病原體，滅菌困難等。因此，研究人員開發出了熱解碳^［30］、聚乙烯醇^［31］、羥基磷灰石^［32］、聚己內酯^［33］、聚乙二醇^［34］、聚-N-異丙基丙烯酰胺^［35］、聚氨酯^［36］等人工合成聚合物作為支架使用，這些材料在可控性方面要優于天然材料，其參數受控可隨意調節，但同樣缺乏天然材料的生物相容性。Dosh等^［37］以海藻酸鹽、N-異丙基丙烯酰胺（l-pNIPAM）和l-pNIPAM-co-DMAc水凝膠3種材料作為支架，將人腸道細胞系Caco-2和HT29-MTX細胞分別懸浮在水凝膠內或分層在水凝膠之上進行靜態或動態培養，結果表明，在動態分層培養下，l-pNIPAM水凝膠支架支持兩種細胞的生長且可以誘導形成腸絨毛狀結構，為研究腸道疾病和藥物測試提供了可替代的體外模型。目前，有支架的3D培養系統所使用的材料是人工合成和天然材料組成的復合物，合成聚合物可以調整細胞的黏附性，增強細胞的鋪展、增殖、分化和遷移能力，彌補了天然聚合物的可控性不足以及人工合成材料缺乏生物相容性的缺點。

1.2.2 無支架的3D培養模型

無支架技術主要基于某些細胞具有的自聚集能力^［38］，通過使用特定的細胞板或具有低附著力的材料促使細胞發揮聚集能力，形成球狀聚集體，細胞球狀體的大小通過細胞接種量和液滴體積進行控制^［39］。無支架產生3D培養物的方法主要有超低附著（ultra low attachment，ULA）板或涂有親水性帶中性電荷的聚合物、顆粒培養法、懸掛掉落法、磁懸浮法、生物反應器等（圖2），不同的方法產生不同的3D培養物。Malho等^［40］將4種細胞經2D培養后制成細胞懸液接種在96孔ULA板里構建了MCF7、MDA-MB-231、SKBR3和MCF12A四種乳腺細胞系的細胞多聚體（multicellular aggregates，MCA），結果發現MCF7和MDA-MB-231形成的MCA緊湊，呈現出較小的區域占比，具有更多的細胞黏連和凋亡/壞死核心，而MCF12A和SKBR3形成的MCA松散且更扁平，區域占比較大，增殖細胞和凋亡細胞分布更加隨機，其中，MCAF7 MCAs具有腺體乳腺分化特征。

顆粒培養法是最簡單的3D培養系統之一，其將細胞懸浮液經離心濃縮到試管底部，再將形成的顆粒球懸浮在培養基中，主要是增大細胞間黏附，最大限度提高球狀體的形成^［41］。Grigull等^［42］將人骨關節炎（osteoarthritis，OA）和非OA軟骨細胞形成的高細胞密度沉淀在聚苯乙烯、細菌纖維素水凝膠中培養，發現這兩種細胞的基因表達變化模式在3種培養系統中的反應是相似的，都保留了表達軟骨生成標志基因COL2A1的潛力，但是沉淀培養COL2A1/COL1A1的比率更高，在ECM沉積物、去分化標志物方面更加優異，強調了顆粒培養在體外維持軟骨細胞生成軟骨有更大的潛力。

懸掛掉落法則是將細胞經2D培養后，制成細胞懸液，將一定量的細胞接種在迷你托盤中的液滴培養基中，然后將托盤倒置，利用重力和表面張力使細胞在液滴中形成3D細胞聚集體^［43］。可以通過液滴的大小和細胞懸液的濃度控制球狀體的大小。Gupta等^［44］將20 μL含有SiHa宮頸癌細胞的細胞培養基液滴移至培養皿的蓋子上，孵育4 d，建立了3D SiHa腫瘤球體，為藥物遞送提供了一個體外模型。

磁懸浮法是將細胞與磁性納米顆粒混合，使細胞內化，在外加磁場的作用下，磁力、重力、浮力達到平衡，細胞懸浮在培養基中，促進細胞的組裝和交流，從而使細胞形成聚集體^［45］。Adine等^［46］創建了一種磁性3D打印生物系統用于生成唾液腺（salivary gland， SG）類器官。將人牙髓干細胞與金、氧化鐵和聚-l-賴氨酸組成的磁性納米顆粒混合，使牙髓干細胞磁化，利用溫和磁力構建3D球狀體，之后用成纖維生長因子10完成了SG上皮的分化，概括了SG上皮形態發生和神經發生的過程。

生物反應器有旋轉瓶和旋轉壁容器兩種系統。旋轉瓶系統是一個圓柱形玻璃器皿，內有葉輪，通過電機驅動。將細胞置于有培養基的旋轉瓶中，通過葉輪轉動防止細胞黏附在底部。但該系統會產生流體剪切力從而對細胞產生一定的有害影響，需要調整好合適的轉速^［47］。旋轉壁容器是圓柱形玻璃容器在一個軸或多個軸上旋轉，細胞培養物可以和容器同步旋轉，在容器內部模擬微重力并產生低剪切力，細胞懸浮相互聚集產生球狀體^［48］。Qian等^［49］基于標準12孔板設計了SpinΩ設備，并利用該設備建立了從人類誘導多能干細胞生成前腦、中腦、下丘腦三種類器官，為探究腦類疾病提供一種研究模型。

無支架3D培養技術主要是基于細胞本身具有聚集性的特點，通過各種方式約束其與培養板黏附，使細胞互相聚集黏附從而形成球狀體或類器官。

微流控是一種通過對流體流量高度控制操縱流體的技術，其具有高度可控的特點，依附支架或由細胞聚集形成的球狀體或類器官都可以通過設置參數精確控制微環境，如控制營養物質和氧氣的流動以達到引入特定分子梯度的目的，從而滿足試驗的特定要求。Shin和Kim^［50］構建了一種基于聚二甲硅氧烷的多孔膜制成的微流體腸道芯片和Transwell插入的混合芯片培養Caco-2或腸道類器官上皮細胞并誘導其3D形態發生，結果表明在5 d內控制基底外側液體流動來去除或最低限度維持基底外側室區中的Wnt拮抗劑水平能夠實現功能性腸道微結構的體外重建。微流控技術的高度可控性，為體外模擬體內微環境提供了可能性。微流控技術與3D細胞培養的結合無疑為研究細胞的生理特點、形態發生和器官發育提供了有力的技術支撐。

3D細胞培養技術并沒有統一的、程序化的步驟，其實現的方式是多種多樣的。除了依賴支架或細胞本身的聚集特點外，其與微流控技術結合制造微流控芯片或結合多種學科形成的3D生物打印技術等在生命科學研究中顯示出巨大的潛力。無支架和有支架的培養系統相差甚遠，兩者各有優勢和局限（表2），研究中可根據目標進行選擇。無支架培養系統更適合培養一些簡單的球狀體，其所需的材料以及操作方法與基于支架的培養系統相比更加簡便且一般實驗室即可進行操作。有支架培養系統，可以培養更加復雜的3D細胞模型，這些支架代替體內的ECM起結構支撐以及與細胞交流的作用，促進組織的生成，從而形成類器官。

1.3 3D細胞培養技術的應用

近年來，3D細胞培養技術發展迅速，在腫瘤細胞、干細胞等細胞中應用廣泛。研究表明，利用3D培養技術產生的類腫瘤能夠重建腫瘤的重要特征，如腫瘤微環境、細胞間和細胞-ECM的相互作用等，進而深入研究癌癥的發生、進展、耐藥復發等機制^［51］。目前，3D細胞培養技術已成功用于乳腺癌^［52］、結腸癌^［53］、皮膚癌^［54］、巨噬細胞^［55］等腫瘤相關細胞的建模。這些模型的構建對于藥物研發、評估藥物治療效果、開發個性化治療和免疫治療具有重要意義。干細胞是一類具有強大分化潛力的細胞。研究人員利用3D細胞培養技術培養干細胞構建了腦類器官^［56］、脂肪組織類器官^［57］、骨類器官^［58］、毛囊類器官^［59］等用于疾病模型、組織發育機制的研究或代替細胞和組織移植的來源^［60］。細胞外囊泡是干細胞通過旁分泌產生的脂質雙層顆粒，是干細胞療法的替代品之一^［61］。利用3D細胞培養技術培養干細胞對提高細胞外囊泡的產量、活性和含量具有促進作用，從而提高治療效果^［62］。3D細胞培養技術在畜牧領域的應用主要體現在脂肪沉積、干細胞分化及體外消化器官研究等方面。Xiang等^［63］基于3D細胞培養技術開發的豬胚胎干細胞到豬胚細胞的兩步分化策略，實現了早期胚胎發生的體外建模，對畜禽的育種具有指導意義。Diez等^［64］利用脫細胞脂肪組織支架研究了奶牛皮下脂肪組織和內臟脂肪組織的成脂能力，結果表明皮下脂肪組織的成脂能力高于內臟脂肪組織，且這種差異是ECM微環境不同造成的。瘤胃是反芻動物的重要消化器官，瘤胃微生物群以短鏈脂肪酸的形式為反芻動物提供70%發酵所需的能量。Xu等^［65］以綿羊瘤胃上皮細胞建立的瘤胃上皮類器官不但能夠表達瘤胃細胞的特異性基因，而且可以攝取脂肪酸產生2D培養物，因此利用這種體外系統可以代替實驗動物的使用。綜上，3D細胞培養技術在研究細胞串擾、組織發育、疾病發生、藥物開發、藥效評估、再生醫學以及減少實驗動物的使用等方面極具發展潛力。

2 毛囊的生物學特征

2.1 毛囊的生成

毛囊的形成始于胎兒的皮膚發育階段，隨表皮的生成而發生，其發育涉及外胚層和中胚層的相互作用^［66］。首先，表皮細胞接受來自間充質細胞（真皮細胞）的“第一真皮信號”，使上皮增厚形成毛發基板^［67］；然后，毛發基板向間充質細胞發出“第一上皮信號”促進DPC在毛發基板下凝聚。在這個過程中，Wnt/β-catenin和EDA/EDAR/NF-κB信號傳導對于基板的命運至關重要，Zhang等^［68］表明真皮細胞中Wnt/β-catenin活性的模式化需要上皮細胞的β-catenin，且EDA/EDAR/NF-κB信號傳導可以完善Wnt/β-catenin活性的模式，并在基板發育的后期保持這種活性。當毛發基板和DPC完成后，DPC向基板發出“第二真皮信號”使基板細胞增殖內陷形成毛囊初始結構^［69］。在這個過程中，基板細胞在完全形成的毛囊中可以產生至少8種不同的細胞類型，以及提供毛囊再生的原料——干細胞^［70］。毛囊形態發生取決于上皮（表皮干細胞）和毛發誘導間充質（真皮細胞）的分子通信^［71］。

2.2 毛囊的周期性循環

毛囊是一個動態的微型器官，其形態結構復雜且呈現周期性的退化和再生。在此過程中，根據毛囊的形態變化，將其分為生長期、退行期、休止期3個階段^［67］。在毛囊的生長期階段，DPC與毛囊干細胞（hair follicle stem cell，HFSC）相互作用，快速增殖，形態和體積變大。HFSC分化的毛基質角質形成細胞密集增殖，向皮下組織和毛囊頂部遷移，分化為毛干和內根鞘細胞^［70］。研究發現，毛囊細胞在生長期階段具有高度異質性，由20多種不同的亞群細胞組成^［69］。毛囊經歷生長期成熟后進入退化期。在退化期階段，毛球部快速退化，球部基質細胞、內根鞘和外根鞘角質形成細胞凋亡，毛干停止生長^［72］。最終，HFSC遷移到隆突外部的外根鞘層并恢復靜止狀態，毛乳頭細胞凝聚并向上移動到隆起的下方區域，毛囊萎縮，進入休止期。休止期是毛囊生物活性最弱的時期，毛干在此期脫落，調控毛囊周期的相關的因子開始表達，為進入下一個生長期做準備。Wnt和BMP是毛囊周期性生長的關鍵信號通路。研究發現，BMP2和BMP4在休止期的表達量高于生長期，促進毛囊生長期轉化為退行期，抑制休止期向生長期轉化^［73］。當BMP拮抗劑抑制上皮細胞和真皮細胞之間的BMP信號時，Wnt信號通路激活，休止期向生長期轉變，毛囊再生過程啟動^［74］。

2.3 毛囊生物學研究進展

目前，毛囊生物學研究在毛囊干細胞、細胞間互作、體外毛囊培養、移植毛囊相關細胞誘導產生毛發、毛囊相關信號通路等方面均取得了一定的成果。HFSC對維持毛囊穩態具有重要作用。Disabled 2（Dab2）是一種銜接蛋白，在HFSC中高表達。Roy等^［75］發現Dab2敲除小鼠由于HFSC活化紊亂表現出毛囊周期延遲。Yusupova等^［76］通過耗竭促Bax凋亡蛋白使HFSC增加，進而促進了毛囊再生。HFSC位于毛囊的隆突部，具有獨特的生態位，這種生態位對維持和調節HFSC的功能極其重要。DPCs位于隆突底部與HFSC直接接觸，調控HFSC的激活、增殖和分化。Zhou等^［77］將DPCs產生的外泌體注射入不同循環階段的毛囊中，結果發現注射外泌體后的小鼠毛囊加速進入并延長了生長期。Yan等^［78］將HFSC與DPC共培養，發現共培養誘導了HFSCs的分化，且HFSCs表面附有DPC來源的外泌體，進一步對其和DPCs進行高通量測序，結果顯示有111個差異表達miRNAs，其中前34個差異表達miRNAs的預測靶基因通過參與細胞信號轉導調節HFSC的增殖和分化。Martino等^［79］發現真皮鞘細胞通過收縮產生機械力使得DPC和HFSC接近，促進毛囊進入休止期。Lee等^［80］使用人類多能干細胞構建了帶有毛發的皮膚類器官培養方法，通過逐步調節TGF-β和FGF信號通路，在球型細胞聚集體中共同誘導顱上皮細胞和神經嵴細胞，經4～5個月的培養觀察到了帶有毛發的囊狀皮膚類器官。Yoon等^［81］使用Wnt激活劑對離體毛囊進行處理，發現其可以增加離體毛囊的毛發長度。毛囊是由多種細胞組成的微型器官，在單一細胞上的研究難以展現出毛囊的整體特征，因此，多細胞間互作在研究毛囊生物學研究中尤為重要。

不難看出，毛囊的形成和周期性生長是由多種細胞互相作用的結果。基于此，3D培養技術為體外研究體內毛囊中關鍵細胞群的功能提供了一種新的模型，并表現出巨大潛力。

3 3D細胞培養技術在毛囊生物學研究中的應用

目前，3D培養技術在毛囊的研究中的應用逐漸廣泛。毛乳頭細胞是毛囊的信號中心，對于毛發再生和毛囊周期性生長具有重要作用，毛乳頭細胞發揮誘導能力需要一定的形態支持^［3］。Kang等^［82］將懸滴法培養的3D毛乳頭細胞球體與新生小鼠表皮細胞混合后觀察到了毛囊的形成。Higgins等^［83］使用ULA培養的毛乳頭細胞球形成了多細胞球體的毛乳頭細胞，完整的轉錄特征部分恢復，與胞外基質合成有關的蛋白顯著高表達，且誘導能力再生。Tan等^［84］利用ULA培養的上皮角質形成細胞（keratinocytes，KC）和DPCs生成了異質型的KC-DP球體，該球體具有毛乳頭細胞的誘導能力及表達毛囊譜系基因的能力。Liu等^［85］利用MG包裹毛乳頭細胞構建了MG 3-D培養模型并與上皮細胞共培養優化為仿生系統以模擬體內DPCs的微環境，結果表明，DPCs的誘導能力進一步恢復，可促進毛囊的重建和毛發的生長。這些系統的建立為毛囊組織工程的大規模應用提供一個可能。

毛囊再生的另一種技術是3D生物打印技術，該技術結合3D培養技術可以構建體內毛囊所處的復雜微環境，以實現毛發的體外生長。Kang等^［86］將成纖維細胞、臍靜脈內皮細胞、DPCs和表皮細胞分別封裝在明膠/海藻酸鹽混合物中并利用3D打印平臺打印不同層的復合物支架，結果表明，該支架有合適的細胞相容性，促進了DPCs的增殖，恢復了相關的毛囊誘導基因，DPCs與表皮細胞在體外成功組裝成未成熟的毛囊，為體外建立毛囊模型提供了一種方法。

毛囊是由多種細胞群構成的微器官，不同細胞群互相串擾形成復雜的分子網絡，同時ECM調控著毛囊周期性生長。2D層次的培養無法展現毛囊的功能特征，因此，3D細胞培養技術的出現，為研究毛囊周期性生長提供了新的方法。3D培養技術的應用為研究毛囊提供了新平臺。

4 總結與展望

毛囊是哺乳動物皮膚的附屬微器官，由20余種細胞類型構成，各種細胞形態、細胞-細胞、細胞與ECM之間的交流對于毛囊的發育和再生具有重要意義。3D培養技術允許細胞向任意方向生長，并通過模擬天然微環境，促使細胞恢復部分在體內的生理特點。目前，通過多種3D細胞培養技術來構建毛囊的體外模型，從單一的球狀體到3D打印形成的類器官，為重現毛囊各細胞類型在體內的基因表達提供了可能，促進各類型細胞功能的挖掘；將3D細胞培養技術與3D打印技術和實現活細胞三維成像的共聚焦顯微鏡技術聯合應用，將為深入研究毛囊周期性生長的機制提供更加有效的方式，為羊毛生長的人工調控提供新的思路；將干細胞生成的腦類器官作為人工智能系統的組件生成的類器官智能（organoid intelligence，OI）為闡明神經生理學的機制和開發生物計算機提供了條件。這種3D細胞培養技術和人工智能系統結合生成的OI在生物醫學和計算機領域有極大的應用潛力；在3D細胞培養技術的基礎上將細胞與刺激響應的材料結合進一步升級為4D細胞培養技術，其增加的時間維度對體內細胞生物學過程的模擬度更高，從而深入理解細胞生物學，為疾病研究、藥物篩選、組織工程等領域提供更有效的工具和方法。綜上，可以預見3D細胞培養技術在細胞生物學、組織工程、疾病建模、藥物開發和藥效評估等領域有著巨大的發展前景。

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