工程化的PMN-MDSCs來源外泌體在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠中的應(yīng)用

［摘要］ 目的： 使用電穿孔方法對多形核髓源性抑制細(xì)胞（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells，PMN-MDSCs）來源的外泌體（exosomes，Ex）進(jìn)行工程化改造，觀察其對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型小鼠疾病進(jìn)程的干預(yù)作用。方法： 構(gòu)建CIA模型小鼠，磁珠分選PMN-MDSCs，運(yùn)用超濾技術(shù)聯(lián)合試劑沉淀法制備培養(yǎng)上清液中的PMN-Ex，免疫印跡法檢測Ex標(biāo)志性蛋白。使用電穿孔技術(shù)對PMN-Ex進(jìn)行改造并設(shè)置分組，包括未處理的PMN-Ex組，電轉(zhuǎn)miR-93-5p mimics NC組（miR-93-5p mimics NC組）以及電轉(zhuǎn)miR-93-5p mimics組（miR-93-5p mimics組）。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-93-5p的裝載效率。流式細(xì)胞術(shù)檢測改造后的Ex對Th17細(xì)胞分化的影響。將不同組別的PMN-Ex尾靜脈注射到CIA小鼠體內(nèi)，分別觀察足趾外觀情況、足趾HE染色切片情況，測定小鼠的平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（mean arthritic index，MAI）、腘窩淋巴結(jié)Th17的比例、血清IL-17A水平，以此判斷不同組別PMN-Ex對CIA小鼠的干預(yù)作用。結(jié)果： PMN-MDSCs被成功分選并制備了PMN-Ex。熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-93-5p mimics組中miR-93-5p的表達(dá)水平明顯高于miR-93-5p mimics NC組。相比miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組處理的小鼠足趾紅腫輕微，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)較完整；MAI、腘窩淋巴結(jié)Th17細(xì)胞比例以及血清IL-17A水平明顯降低。結(jié)論： 使用miR-93-5p mimics工程化改造后的PMN-Ex可以更有效地延緩CIA小鼠的疾病進(jìn)程。

［關(guān)鍵詞］ 膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；髓源性抑制細(xì)胞；外泌體；miR-93-5p

［中圖分類號］ R392.9" ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A" ［文章編號］ 1671-7783（2025）01-0001-07

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y240130

［引用格式］陳玉梅， 戴錦東， 張一珂， 等. 工程化的PMN-MDSCs來源外泌體在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎小鼠中的應(yīng)用［J］. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2025， 35（1）： 1-7.

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目（82202001）；儀征市衛(wèi)生健康委2024年度醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（Yxh2024-2-19）

［作者簡介］陳玉梅（1972—），女，主任技師，主要從事自身免疫性疾病的檢驗(yàn)指標(biāo)研究；朱棟煒（通訊作者），副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： 1000005601@ujs.edu.cn；朱成棟（通訊作者），副主任醫(yī)師，E-mail： dongdong801208@163.com

Engineered PMN-MDSCs-derived exosomes delay the progression of collagen-induced arthritis in mice

CHEN Yumei¹ ， DAI Jindong² ， ZHANG Yike² ， LI Zelan² ， ZHU Dongwei² ， ZHU Chengdong³

（1. Department of Laboratory Medicine， Yizheng People′s "Hospital， Yizheng Jiangsu 211400; 2. School of Medicine， Jiangsu University， Jiangsu Key Laboratory of Laboratory Medicine， Zhenjiang Jiangsu 212013; 3. Department of Orthopedics， Yizheng People′s "Hospital， Yizheng Jiangsu 211400， China）

［Abstract］ Objective： To make engineered exosomes （Ex） derived from polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells （PMN-MDSCs） by electroporation， and evaluate the intervention effect on the progression of collagen-induced arthritis （CIA） mice model. Methods： Firstly， PMN-MDSCs were selected using magnetic beads from CIA mice， and PMN-Ex were prepared in the culture supernatant using ultrafiltration technology combined with reagent precipitation method. The surface marker proteins were detected by Western blotting. The PMN-Ex were modified by electroporation technology. The loading efficiency of miR-93-5p in PMN-Ex was detected by fluorescence quantitative PCR. The modified PMN-Ex were added to regulate the differentiation of Th17 cells. After injecting different PMN-Ex into the CIA mice， the appearance of the toes， the HE staining section of the toes， the mean arthritis index （MAI）， the proportion of Th17， and serum IL-17A level in mice were observed. Results： PMN-Ex were prepared successfully. The fluorescence quantitative PCR results showed that the expression level of miR-93-5p in PMN-Ex in the experimental group was significantly higher than that in the negative control group. Compared to the negative control group， the mice treated in the experimental group had mild toe redness and swelling and more complete joint structure. In addition， the proportion of Th17 cells in popliteal lymph node， and serum IL-17A level were significantly reduced. Conclusion： The miR-93-5p mimics-engineered PMN-Ex can alleviate the development of CIA mice more effectively.

［Key words］ collagen-induced arthritis; myeloid-derived suppressor cell; exosomes; miR-93-5p

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病^［1］ ，全球患病率約1%，我國患病率約0.5%，總患病人群大約500萬人，通常40～60歲開始發(fā)病^［2-3］ ，女性患RA的風(fēng)險(xiǎn)是男性的2～3倍^［4］ 。研究表明，RA患者的血清和關(guān)節(jié)滑液中均表達(dá)高水平的IL-17，并且患者外周血中Th17細(xì)胞數(shù)量增多^［5］ 。膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠是研究RA的重要模型，1977年Trentham等^［6］ 通過皮內(nèi)免疫誘導(dǎo)構(gòu)建CIA模型，該模型的表型在臨床特征、病理變化和免疫學(xué)方面與RA十分相似。小鼠品系DBA/1（H-2q）有較高的CIA發(fā)病率，在關(guān)節(jié)病理變化方面與人類RA更為相似^［7］ 。

本課題組針對RA的治療進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多形核髓源性抑制細(xì)胞（polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cells，PMN-MDSCs）來源的外泌體（exosomes，Ex）可以通過miR-29a-3p和miR-93-5p分別靶向T盒子轉(zhuǎn)錄因子TBX21（T-bet）和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），從而抑制Th1和Th17細(xì)胞分化，減弱CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀^［8］ ；另一項(xiàng)研究表明，PMN-Ex能夠通過其內(nèi)容物前列腺素E2增強(qiáng)IL-10⁺ "B細(xì)胞數(shù)量，從而改善CIA小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀^［9］ 。本研究試圖通過工程化改造PMN-Ex，以此增強(qiáng)PMN-Ex延緩CIA小鼠疾病進(jìn)程的作用。據(jù)資料顯示，工程化改造Ex包括表面改造和內(nèi)容物負(fù)載^［10］ 。目前關(guān)于MDSC-Ex的內(nèi)容物負(fù)載方式主要采取轉(zhuǎn)染母細(xì)胞的方式進(jìn)行，本課題組利用miR-29a-3p mimics轉(zhuǎn)染PMN-MDSCs^［8］ ，分離發(fā)現(xiàn)PMN-Ex內(nèi)的miR-29a-3p表達(dá)也增加，進(jìn)而研究PMN-Ex對初始CD4⁺ "T細(xì)胞分化的影響。電穿法是利用電場作用于懸浮在液體中的Ex，瞬間高強(qiáng)度電場產(chǎn)生的電脈沖能穿透Ex的薄膜，在薄膜上形成暫時(shí)的小孔，使藥物或類似物質(zhì)能夠從小孔中向Ex內(nèi)擴(kuò)散^［11-12］ 。電穿孔技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是沒有添加任何化學(xué)藥劑，在加載DNA和RNA等親水藥物時(shí)非常有效^［13］ 。Bai等^［14］ 將人工合成的siRNA通過電穿孔技術(shù)裝載進(jìn)靶向腫瘤歸巢穿膜肽（tLyp-1）的Ex內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此Ex轉(zhuǎn)染肺癌和腫瘤干細(xì)胞的效率較高。本研究擬對PMN-Ex進(jìn)行電穿法改造，并探究其對CIA小鼠疾病進(jìn)程的影響，從而為RA的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MDSCs磁珠分選試劑盒（德國美天旎公司）；新生小牛血清、DMEM、RPMI-1640、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；Ex分選試劑盒（美國SBI公司）；miR-93-5p mimics、mimics-NC（廣州銳博生物科技有限公司）；兔抗小鼠鈣黏蛋白（Calnexin）、CD63、CD9單克隆抗體（英國Abcam公司）；牛二型膠原、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（美國Sigma公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman公司）；培養(yǎng)箱（上海力康公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國GE公司）。

1.2 建立CIA小鼠模型

DBA/1J小鼠購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司，6～8周齡，體重18～22 g。第1天，小鼠尾靜脈注射0.1 mL濃度為2 mg/mL的牛二型膠原和同體積的弗氏完全佐劑的混合液；第21天，小鼠尾靜脈注射0.1 mL濃度為2 mg/mL的牛二型膠原和同樣體積的弗氏不完全佐劑的混合液，實(shí)驗(yàn)期間定期觀察小鼠的足趾，并拍照記錄。

1.3 磁珠分選PMN-MDSCs并測定其純度

摘取CIA小鼠的脾臟，將其研磨成細(xì)胞懸液，然后從MDSCs磁珠分選試劑盒中選擇FcR阻斷試劑、抗Ly-6G生物素和抗生物素磁珠加入細(xì)胞懸液，在冰盒中孵育后，將磁珠分選柱裝在分選器上，用PBS洗柱，重復(fù)3次，最后獲得的細(xì)胞懸液即為PMN-MDSCs，采用流式細(xì)胞儀對分選出的細(xì)胞進(jìn)行純度檢測。

1.4 PMN-Ex的提取和蛋白濃度測定

將PMN-MDSCs用RPMI-1640培養(yǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 h后收集上清液，在超濾管中進(jìn)行超濾，獲得濃縮液，然后用快速提取試劑盒提取Ex，PBS重懸Ex，于-80 ℃保存；再用等體積的裂解液（RIPA∶ PMSF=250∶1）裂解Ex，采用BCA法測定Ex裂解上清液中的蛋白濃度。

1.5 免疫印跡法檢測PMN-Ex的特異性蛋白

使用等體積的裂解液（RIPA∶PMSF=250∶1）裂 解Ex，冰上放置10 min并振蕩。4 ℃、12 000× "g ，離心15 min，吸取上清液，按體積比3∶1加 入4×SDS-PAGE混勻后，沸水煮10 min。常溫14 000× g 離心10 min，吸取上清液分裝于EP管內(nèi)，備用；將制備的樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，BSA封閉1 h，將兔抗小鼠Calnexin、CD63單克隆抗體、CD9單克隆抗體，完全覆蓋PVDF膜，4 ℃孵育12 h。第2天，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體覆蓋PVDF膜，室溫孵育2 h后 ，用ECL顯色曝光，在凝膠成像系統(tǒng)下分析條帶。

1.6 工程化改造Ex

用電穿儀制備工程化的Ex，利用瞬時(shí)電場在Ex膜上穿孔，使外源性的miR-93-5p mimics進(jìn)入PMN-Ex中，達(dá)到過表達(dá)miR-93-5p的目的。實(shí)驗(yàn)分為未處理的PMN-Ex組、miR-93-5p mimics NC組 和miR-93-5p mimics組。miR-93-5p mimics、mimics NC粉末用 ddH2O溶解（終濃度1 μg/μL），將電極杯及專用長頭吸管置于超凈臺中紫外滅菌30 min以上；每個(gè)組別均含有20 μg/μL的PMN-Ex，其中miR-93-5p mimics組和miR-93-5p mimics NC組分別加入5 μL的miR-93-5p mimics和mimics NC，混勻后加入電極杯內(nèi)；電穿參數(shù)設(shè)置：111 V電轉(zhuǎn)3.0 ms，間歇10.0 ms，25 V電轉(zhuǎn)10.0 ms，間歇50.0 ms，循環(huán)10次；最后將電穿好的PMN-Ex 37 ℃水浴1 h，使膜孔完全閉合。加入200 μL PBS后用100 kD超濾離心管洗滌，去除游離在Ex外部的miRNA；濾菌器除菌后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 檢測改造后的Ex裝載效率

用Trizol法提取各組Ex的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Toyobo公司）對相關(guān)miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測miR-93-5p的表達(dá)，PCR采用2720熱循環(huán)儀（美國ThermoFisher公司）進(jìn)行，使用Bio-Rad SYBR green mix進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，最后用ΔΔCt法對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.8 改造后的Ex體外對Th17細(xì)胞分化的影響

建立初始T細(xì)胞到Th17細(xì)胞的分化體系，使用CD4⁺ "T細(xì)胞分離試劑盒（德國美天旎公司）分離小鼠CD4⁺ "T細(xì)胞。在24孔板中預(yù)涂抗CD3單抗（2 μg/mL），每孔接種1×10⁶ 個(gè)細(xì)胞，每個(gè)孔內(nèi)加入相應(yīng)濃度的細(xì)胞因子：抗CD28單抗（2 μg/mL），TGF-β（5 ng/mL），IL-6（30 μg/mL），抗IL-4單抗（5 μg/mL） ，抗IFN-γ單抗（5 μg/mL）和IL-23（30 ng/mL） 。用含15%胎牛血清（經(jīng)過100 000× g 離心16 h處理）、pH 7.2～7.4的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2 "條件下培養(yǎng)72 h。在Th17細(xì)胞分化體系中加入各組Ex，檢測Th17細(xì)胞比例和IL-17A水平。

1.9 動物實(shí)驗(yàn)分組

分別在免疫的第18和24天進(jìn)行小鼠尾靜脈注射，每組6只。① PBS組：注射100 μL的PBS；② 未 處理的PMN-Ex組：注射100 μL用PBS溶解的未作處理的PMN-Ex；③ miR-93-5p mimics NC組：注射100 μL用PBS溶解的miR-93-5p mimics NC組的PMN-Ex；④ miR-93-5p mimics組：注射100 μL用PBS溶解的miR-93-5p mimics組的PMN-Ex。

1.10 小鼠疾病進(jìn)程評價(jià)和足趾切片病理學(xué)觀察

在免疫21 d后，每3 d觀察小鼠關(guān)節(jié)狀況（4只爪子關(guān)節(jié)炎得分之和）：0分，無紅腫；1分，關(guān)節(jié)發(fā)紅但無腫脹；2分，局限于足趾或踝關(guān)節(jié)的輕度紅腫；3分 ，足趾至踝關(guān)節(jié)的輕度紅腫；4分，嚴(yán)重的關(guān)節(jié)腫脹和運(yùn)動障礙。平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)（mean arthritic index，MAI）=每組關(guān)節(jié)炎得分之和/小鼠總數(shù)。于免疫后第42天，取每只小鼠具有代表性的前爪和后爪，將其分別置于10%福爾馬林中；用石蠟包埋，切片4 μm，HE染色，顯微鏡下觀察，拍照記錄。評估關(guān)節(jié)間隙大小、骨質(zhì)破壞程度和浸潤性淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.11 各組模型小鼠腘窩淋巴結(jié)中Th17細(xì)胞和血清IL-17A水平檢測

在免疫小鼠第42天，摘取小鼠兩側(cè)腘窩淋巴結(jié)，研磨制備單細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4單克隆抗體，在24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)5 h后用流體細(xì)胞儀檢測并分析數(shù)據(jù)。收集各組小鼠的眼球血，至1.5 mL的EP管中，37 ℃金屬浴30 min，離心后吸取上層血清，用IL-17A檢測試劑盒（上海碧云天公司）進(jìn)行檢測，測量光密度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析樣本IL-17A的含量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用兩樣本 t 檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用Turkey檢驗(yàn)。 P lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PMN-Ex的提取與鑒定

PMN-MDSCs為CD11b和Ly-6G雙陽性細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀測定磁珠分選的PMN-MDSCs，結(jié)果顯示PMN-MDSCs的純度達(dá)到90%以上（圖1A）。通過超濾法制備PMN-MDSCs培養(yǎng)上清液中的Ex，透射電鏡觀察結(jié)果顯示（圖1B），具有典型的茶托樣結(jié)構(gòu)。NTA粒徑分析結(jié)果顯示（圖1C），PMN-Ex的直徑為50～120 nm。免疫印跡法檢測結(jié)果顯示（圖1D），PMN-Ex高表達(dá)CD9、CD63、CD81和HSP60分子，不表達(dá)Calnexin蛋白和GAPDH蛋白。

2.2 工程化改造PMN-Ex的裝載效率

利用電穿孔技術(shù)制備工程化的Ex，結(jié)果顯示，miR-93-5p mimics組PMN-Ex中miR-93-5p的表達(dá)水平明顯高于miR-93-5p mimics NC組，并且相比于miR-93-5p mimics細(xì)胞轉(zhuǎn)染組，miR-93-5p mimics組的miR-93-5p水平顯著升高（圖2），表明相比干細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，電穿孔技術(shù)能有效地將miR-93-5p mimics裝載進(jìn)Ex內(nèi)。

2.3 改造后的Ex對Th17細(xì)胞分化的影響

在Th17細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系中，加入不同組別的PMN-Ex，流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞的比例（圖3A）。未處理的PMN-Ex組和miR-93-5p mimics NC組沒有明顯差異，相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組Th17細(xì)胞的比例明顯降低（圖3B）。

2.4 各組小鼠關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)程

使用不同組別的PMN-Ex處理CIA小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PBS組小鼠的MAI水平最高，未處理的PMN-Ex組與miR-93-5p mimics NC組相比，MAI無明顯差異；而與miR-93-5p mimics NC組相比，miR-93-5p mimics組小鼠MAI水平則明顯下降（ P lt;0.05），見圖4。

2.5 各組小鼠足趾外觀及關(guān)節(jié)活動情況

在免疫第42天對CIA模型小鼠進(jìn)行拍照，發(fā)現(xiàn)PBS組的小鼠足趾嚴(yán)重紅腫，miR-93-5p mimics NC組和未處理的PMN-Ex組內(nèi)小鼠足趾輕微紅腫，miR-93-5p mimics組小鼠的足趾外觀幾乎沒有紅腫（圖5） 。

2.6 各組小鼠足趾切片HE染色情況

對各組別PMN-Ex處理后的CIA小鼠足趾進(jìn)行切片及HE染色，結(jié)果顯示，PBS組小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)遭到破壞，關(guān)節(jié)腔縮小，并可見大量炎性細(xì)胞浸潤。未處理的PMN-Ex組和miR-93-5p mimics NC組小鼠足趾關(guān)節(jié)顯示淋巴細(xì)胞浸潤較少，關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)相對完整。相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組小鼠的足趾關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)更為完整，保護(hù)作用更強(qiáng)（圖6）。

2.7 各處理組小鼠腘窩淋巴結(jié)中的Th17細(xì)胞比例

流式細(xì)胞儀檢測各處理組小鼠腘窩淋巴結(jié)內(nèi)Th17細(xì)胞的比例（圖7A），未處理的PMN-Ex組與miR-93-5p mimics NC組比較，小鼠腘窩淋巴結(jié)內(nèi)Th17細(xì)胞的比例無明顯差異；而相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics組小鼠腘窩淋巴結(jié)內(nèi)Th17細(xì)胞的比例明顯下降（ P lt;0.01），見圖7B。

2.8 各處理組小鼠血清IL-17A的水平

ELISA測定各處理組小鼠血清中IL-17A水平，結(jié)果顯示，未處理的PMN-Ex組與miR-93-5p mimics NC組比較，小鼠血清IL-17A水平無明顯差異；而相較于miR-93-5p mimics NC組，miR-93-5p mimics處理組小鼠血清IL-17A水平明顯下降（ P lt;0.01），見圖8。

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，其主要特點(diǎn)是免疫功能紊亂^［15］ 。目前對RA的治療主要是對癥治療，即控制疾病的發(fā)展，緩解關(guān)節(jié)疼痛感，維持受累關(guān)節(jié)的功能，盡可能減少對骨的破壞，然而非靶向性療法不可避免地會對RA患者產(chǎn)生顯著的不良反應(yīng)，也會誘發(fā)系統(tǒng)性并發(fā)癥，并且非靶向性療法的價(jià)格昂貴^{［5，16］} 。因此，找到一種更安全有效的治療方式顯得格外重要。

Ex屬于內(nèi)源性囊泡，包裹各種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸，并能將其裝載的物質(zhì)運(yùn)輸至受體細(xì)胞而發(fā)揮生物學(xué)作用，它可以通過生物屏障，具有低免疫原性和低毒性的特點(diǎn)，在機(jī)體內(nèi)難以被降解或清除^［17］ 。相對其來源細(xì)胞，利用Ex調(diào)節(jié)受體細(xì)胞生物學(xué)功能來治療疾病具有很大優(yōu)勢^［18-19］ 。研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性斑禿（alopecia areata，AA）小鼠模型中，使用MDSC-Ex治療AA小鼠后，MDSC-Ex主要被Treg細(xì)胞攝取，隨后Treg細(xì)胞比例大幅增加，輔助性T細(xì)胞則減少，淋巴細(xì)胞凋亡增加，小鼠斑禿癥狀得到明顯改善^［20］ 。但是，天然Ex在體內(nèi)沒有足夠的靶向性，很容易被機(jī)體清除，或者被其他非目的細(xì)胞吸收，并且Ex與細(xì)胞膜的相互作用使得Ex的半衰期縮短，這也會使Ex的治療效果大打折扣^［21］ 。為了增強(qiáng)Ex在靶向治療疾病方面的效果，越來越多的研究開始著手改造Ex，一般將改造后的Ex稱為工程化Ex。目前，對于工程化改造Ex的研究主要集中在來源于間充質(zhì)干細(xì)胞和免疫細(xì)胞的Ex，對于MDSCs來源Ex的改造研究較少。因此本實(shí)驗(yàn)試圖對MDSCs-Ex進(jìn)行內(nèi)容物的裝載，即主要聚焦于篩選Ex內(nèi)有效“貨物”，進(jìn)而采取不同的方法將有效的“貨物”裝載入Ex內(nèi)。miR-93-5p作為一種微小RNA，在多種疾病中通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用，例如直接靶向基因、調(diào)節(jié)信號通路、影響細(xì)胞行為等。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，裝載外源性miR-93-5p可以靶向初始T細(xì)胞內(nèi)的STAT3，從而抑制Th17細(xì)胞的分化，因此本研究通過工程化改造PMN-Ex，將miR-93-5p裝載到PMN-Ex中，觀察其對CIA模型小鼠疾病進(jìn)程的干預(yù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)工程化改造的PMN-Ex在CIA小鼠體內(nèi)展現(xiàn)了強(qiáng)大的免疫抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明工程化的PMN-Ex可以顯著降低小鼠腘窩淋巴結(jié)中Th17的比例以及降低血清IL-17A的水平，并且延緩小鼠的疾病進(jìn)程。

下一步的研究可以從三方面進(jìn)行，第一，增加更多有效內(nèi)容物的裝載，如課題組前期發(fā)現(xiàn)的miR-29a-3p，并且可以拓寬對有效內(nèi)容物的尋找，比如有效的蛋白質(zhì)和其他非編碼RNA成分。第二，可以著手對PMN-Ex進(jìn)行表面改造，使其可以靶向重要的目的細(xì)胞，進(jìn)而增加目的細(xì)胞對Ex的攝取，進(jìn)一步提高Ex的干預(yù)作用。第三，從Ex的來源考慮，目前通過細(xì)胞分泌Ex這種方法來獲取Ex的量還太有限，可以考慮用納米材料取代囊泡結(jié)構(gòu)，包裹已知的有效成分，從而達(dá)到批量、大量生產(chǎn)的條件，為Ex的臨床生物治療提供可行性方案。此外，PMN-Ex也被證實(shí)對CIA等其他自身免疫性疾病模型小鼠具有重要的免疫抑制作用^［22］ ，所以對PMN-Ex進(jìn)行工程化改造將大有可為，有望為治療自身免疫性疾病提供新的方法。

［參考文獻(xiàn)］

［1］ 賈 筠， 杜望磊， 肖廣智， 等. 血清外泌體源性microRNA對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷意義［J］. 局解手術(shù)學(xué)雜志， 2023， 32（2）： 160-164.

［2］ Yang "W， Xu Y， Lin J， et al. Regional and national burden of rheumatoid arthritis， and attributable risk factors from 1990 to 2019： update from the global burden of disease 2019 study［J］. Clin Exp Rheumatol， 2023， 41（7）： 1516-1527.

［3］ Zou "W， Fang Y， Xu D. Increasing global burden of rheumatoid arthritis： an epidemiological analysis from 1990 to 2019［J］. Arch Med Sci， 2023， 19（4）： 1037-1048.

［4］ Smolen "JS， Aletaha D， McInnes IB. Rheumatoidarthritis［J］. Lancet， 2016， 388（10055）： 2023-2038.

［5］ Zhao "R， Zhang YW， Yao JY， et al. Genetic association between interleukin-17 and susceptibility to rheumatoid arthritis［J］. BMC Med Genomics， 2023， 16（1）： 277-290.

［6］ Trentham "DE， Townes AS， Kang AH. Autoimmunity to type Ⅱ collagen an experimental model of arthritis［J］. J Exp Med， 1977， 146（3）： 857-868.

［7］ Miyoshi "M， Liu S. Collagen-induced arthritis models［J］. Methods Mol Biol， 2018， 1868： 3-7.

［8］ Zhu "D， Tian J， Wu X， et al. G-MDSC-derived exosomes attenuate collagen-induced arthritis by impairing Th1 and Th17 cell responses［J］. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis， 2019， 1865（12）： 165540-165551.

［9］ Wu "X， Zhu D， Tian J， et al. Granulocytic myeloid-derived suppressor cell exosomal prostaglandin E2 ameliorates collagen-induced arthritis by enhancing IL-10⁺ "B Cells［J］. Front Immunol， 2020， 11： 588500.

［10］ Nawaz "M. Extracelluar vesicle-mediated transport of non-coding RNAs between stem cells and cancer cells： implications in tumor progression and therapeutic resistance［J］. Stem Cell Investig， 2017， 4： 83-102.

［11］ Kooijmans "S， Stremersch S， Braeckmans K， et al. Electroporation-induced siRNA precipitation obscures the efficiency of siRNA loading into extracelluar vesicles［J］. J Control Release， 2013， 172（1）： 229-238.

［12］ Wang "C， Xu M， Fan Q， et al. Therapeutic potential of exosome-based personalized delivery platform in chronic inflammatory diseases［J］. Asian J Pharm Sci， 2023， 18（1）： "100772-100784.

［13］ Wang "J， Zheng Y， Zhao M. Exosome-based cancer therapy： implication for targeting cancer stem cells［J］. Front Pharmacol， 2016， 7： 533-545.

［14］ Bai "J， Duan J， Liu R， et al. Engineered targeting tLyp-1 exosomes as gene therapy vectors for efficient delivery of siRNA into lung cancer cells［J］. Asian J Pharm Sci， 2020， 15（4）： 461-471.

［15］ Wang "Q， Sun X. Recent advances in nanomedicines for the treatment of rheumatoid arthritis［J］. Biomater Sci， 2017， 5（8）： 1407-1420.

［16］ Elron-Gross "I， Glucksam Y， Margalit R. Liposomal dexame- thasone-diclofenac combinations for local osteoarthritis treatment［J］. Int J Pharm， 2009， 376（1/2）： 84-91.

［17］ Fang "Y， Ni J， Wang YS， et al. Exosomes as biomarkers and therapeutic delivery for autoimmune diseases： opportunities and challenges［J］. Autoimmun Rev， 2023， 22（3）： 103260.

［18］ Hejrati "A， Hasani B， Esmaili M， et al. Role of exosome in autoimmunity， with a particular emphasis on rheumatoid arthritis［J］. Int J Rheum Dis， 2021， 24（2）： 159-169.

［19］ Lai "JJ， Chau ZL， Chen SY， et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development［J］. Adv Sci （Weinh）， 2022， 9（15）： "e2103222.

［20］ Zller "M， Zhao K， Kutlu N， et al. Immunoregulatory effects of myeloid-derived suppressor cell exosomes in mouse model of autoimmune alopecia areata［J］. Front Immunol， 2018， 9： 1279-1293.

［21］ Nakase "I， Noguchi K， Fujii I， et al. Vectorization of biomacromolecules into cells using extracellular vesicles with enhanced internalization induced by macropinocytosis［J］. Sci Rep， 2016， 6： 34937-34949.

［22］ Wang "Y， Tian J， Tang X， et al. Exosomes released by granulocytic myeloid-derived suppressor cells attenuate DSS-induced colitis in mice［J］. Oncotarget， 2016， 7（13）： "15356-15368.

［收稿日期］ 2024-08-06" ［編輯］ 郭 欣