花生冠腐病病原菌的分離鑒定及生物學特性研究

摘要為減少冠腐病對花生生產(chǎn)帶來的損失，從安徽省不同花生產(chǎn)區(qū)采集冠腐病病株分離病原菌，對其進行致病性測定、形態(tài)鑒定和分子生物學鑒定，并對其生物學特征進行研究，室內(nèi)篩選抑菌效果較好的化學藥劑。結(jié)果表明，引起安徽省花生冠腐病的病原菌為黑曲霉（Aspergillusniger），該菌的致死溫度為59℃（15min），在pH7的PDA培養(yǎng)基上生長最快。藥劑篩選結(jié)果表明，50%多菌靈可濕性粉劑和43%戊唑醇懸浮劑效果最好；75%百菌清可濕性粉劑次之；其次是70%代森錳鋅可濕性粉劑；3%甲霜惡霉靈水劑與對照無明顯差異。

關(guān)鍵詞花生冠腐??；黑曲霉；分離鑒定；抑菌作用

中圖分類號S435.652"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2025）01-0133-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2025.01.027

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

IsolationandIdentificationofthePathogenofPeanutCrownRotandItsBiologicalCharacterisiticsResearch

ZHUXiao-feng，WANGSong，JIANGTaoetal

（CropResearchInstitute，AnhuiAcademyofAgriculturalSciences/AnhuiKeyLaboratoryofCropQualityImprovement，Hefei，Anhui230031）

AbstractToreducethelosscausedbypeanutcrownrotonpeanutproduction，thepeanutcrownrotdiseaseplantswerecollectedfromdifferentpeanutgrowingareasinAnhuiProvince.Thepathogenwasisolated，andthepathogenicity，morphologyandmolecularbiologyofpathogenswereidentified.Anditsbiologicalcharacteristicswerestudied，chemicalagentswithbetterantibacterialeffectsindoorswerescreened.TheresultsconfirmedthatthepathogenofpeanutcrownrotinAnhuiProvincewas"Aspergillusniger，whichhadalethaltemperatureof59℃（15min），andthefastestgrowinginthemediumofpH7.Thedrugscreeningresultsindicatedthat50%carbendazimWPand43%tebuconazoleSChadthebestinhibitoryeffect;75%chlorothalonilWPfollowed;nextwas70%mancozebWP;3%metalaxyl-hymexazolAChadnosignificantdifferencefromtheCK.

KeywordsPeanutcrownrot;Aspergillusniger;Isolationandidentification;Fungistaticaction

基金項目財政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-13-合肥綜合試驗站）；安徽省油料作物產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系。

作者簡介朱曉峰（1989—），女，安徽無為人，助理研究員，博士，從事花生抗病遺傳育種研究。*通信作者，研究員，碩士，從事花生種質(zhì)資源鑒定和創(chuàng)新研究。

花生（ Arachis hypogasa "L.）是我國主要的油料和經(jīng)濟作物。近年在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來越受到重視，種植面積逐年增長，2021年全國花生種植面積超過48萬hm 總產(chǎn)超過1 830萬t，再創(chuàng)歷史新高（2022年國家統(tǒng)計局數(shù)據(jù)）?；ㄉ诟。╬eanut crown rot disease）是危害花生主要土傳病害之一，多在花生出苗至團棵期發(fā)生，成株期較少，是花生苗期的主要病害。該病害影響范圍廣泛，在我國花生各產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，對我國很多花生產(chǎn)區(qū)均存在潛在的威脅，尤其在山東、河南、江西、山西、福建等省已有大面積發(fā)生^［1-4］。冠腐病在花生上的危害最早于1926年被Jochem^［5］首次報道?；ㄉ诟∈且环N世界性的土傳病害，印度和美國每年因冠腐病造成的花生產(chǎn)量損失均在5%左右，嚴重的可達40%^［6］。目前已知引起花生冠腐病的病原菌主要是黑曲霉^［5-9］，但不同地理區(qū)域花生冠腐病的病原菌是否存在差異還有待研究。冠腐病在國內(nèi)花生上危害較小，一般不造成大的經(jīng)濟損失，國內(nèi)學者并未進行系統(tǒng)的研究。近年來，受農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、秸稈還田等因素影響，該病害發(fā)生明顯有加重的趨勢，才逐漸受到國內(nèi)學者的重視。

冠腐病在安徽省花生主產(chǎn)區(qū)固鎮(zhèn)、泗縣、肥東等地常有發(fā)生。安徽省夏花生苗期常出現(xiàn)高溫高濕天氣，適合冠腐病發(fā)生。一旦發(fā)病，會造成植株枯萎、缺苗斷壟的現(xiàn)象，嚴重影響花生的產(chǎn)量和品質(zhì)。為明確安徽省花生冠腐病的病原菌，筆者對安徽省花生產(chǎn)區(qū)的冠腐病株進行多年多點采樣，并進行分離鑒定，經(jīng)過形態(tài)學及分子鑒定，證實該病害病原菌為黑曲霉（Aspergillusniger）。同時，為篩選防治花生冠腐病的藥劑，選擇5種常用的殺菌劑進行室內(nèi)藥劑對比試驗，篩選出效果最好的殺菌劑，進而為花生冠腐病的有效防治提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試樣品：2019—2021年花生生育期間，從安徽省固鎮(zhèn)縣、泗縣、肥東縣等不同花生產(chǎn)區(qū)采集冠腐病典型病株。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基、花生秸稈培養(yǎng)基、大豆培養(yǎng)基、麥粒培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的具體制作方法參照張建航等^［10］。

供試藥劑：75%百菌清可濕粉劑、50%多菌靈可濕粉劑、70%代森錳鋅可濕粉劑、3%甲霜惡霉靈水劑、43%戊唑醇懸浮劑。

1.2病原菌的分離與純化

取病株莖基部的病部組織，采用組織分離法，將其切成大小2mm×2mm的小組織塊，表面消毒后，置于PDA培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)2～3d，在單菌落邊緣挑取菌絲，轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)接純化3～4次。純化后的病原菌4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病原菌的鑒定

1.3.1病原菌的形態(tài)鑒定。

取純化后的病原菌菌絲約6mm置于PDA平板中央，倒置培養(yǎng)7d左右，每天肉眼觀察菌落形態(tài)特征和大小，并待孢子產(chǎn)生后，挑取少量菌絲體制片，在顯微鏡下觀察分生孢子形態(tài)。

1.3.2病原菌的ITS鑒定。

取50～100mg的菌絲，使用真菌DNA提取試劑盒提取菌絲總DNA，試劑盒從生工生物（上海）股份有限公司購買。引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對病原菌DNA進行PCR擴增。10μL反應體系：2×Taq"PCRMasterMix5μL，10μmol/L上、下游引物ITS1和ITS4各0.4μL，DNA模板1μL（約100ng），加入滅菌的ddH2O6.7μL。PCR擴增程序：95℃變性5min；94℃變性35s，55℃退火55s，72℃延伸1min，此過程共36個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，72℃補充延伸10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物送至生工生物（上海）股份有限公司測序。在NCBI網(wǎng)站上利用BLAST搜索同源序列，并與已知序列進行序列比對與分析。

1.4致病性測定

以YH1、1016、9102這3個品種為試驗材料，催芽后先孢子懸浮液侵染種子，然后再以麥粒為接種體，對病原菌進行致病性測定。純化后的菌絲在PDA培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)7d左右，用無菌水洗下病原菌孢子，制成濃度1.0×106個/mL的孢子懸浮液，3個供試花生品種的種子置于孢子懸浮液中30℃侵染過夜后，分別種于無菌土中。待花生子葉剛長開時，在花生基部用無菌刀切約4mm2的小口，將接種過菌絲的麥粒均勻埋在植株莖稈與土層交界處四周，以正常生長不作任何處理的花生植株為對照。觀察接種后的發(fā)病植株與田間癥狀是否表現(xiàn)一致，從發(fā)病植株的莖基部分離病原菌，與接種菌進行對比。

1.5生物學性狀研究

1.5.1病原菌在不同培養(yǎng)基中的生長情況。

將菌絲分別轉(zhuǎn)接于PDA、麥粒、大豆和花生秸稈制成的4個培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3d，每種培養(yǎng)基設(shè)3個重復，每天觀察菌絲生長情況，記錄菌落的直徑大小。

1.5.2病原菌在不同pHPDA平板中的生長情況。

共設(shè)8個不同pH（pH5～1梯度為1）的PDA培養(yǎng)基處理，將菌絲分別接種于不同處理的培養(yǎng)基上，每個處理3次重復，30℃培養(yǎng)3d，每天記錄菌落的直徑。

1.5.3不同溫度處理對菌絲生長的影響。

共設(shè)50～64℃（每處理差1℃）15個處理，將大小一致、直徑2mm的菌絲塊分別放入加過100μL無菌ddH2O的離心管中，每處理3次重復，共45管，分別恒溫水浴15min后，接種于PDA平板上，30℃培養(yǎng)，第2天記錄菌落直徑。

1.65種化學試劑的抑菌作用

藥劑配制：75%百菌清可濕粉劑配成濃度1.43g/L，即75%百菌清可濕粉劑0.1g用70mL無菌水溶解；50%多菌靈可濕粉劑0.1g對無菌水50mL溶解；70%代森錳鋅可濕粉劑0.1g用80mL無菌水溶解；3%甲霜惡霉靈水劑1500倍液，即3%甲霜惡霉靈水劑1mL對無菌水至1500mL；43%戊唑醇懸浮劑3500倍液，即43%戊唑醇懸浮劑100μL對無菌水至350mL。

藥劑處理：在無菌操作臺上，每種藥劑用移液槍分別取200μL，使用涂抹棒將藥劑均勻地涂布在PDA平板上，然后將菌絲轉(zhuǎn)接到中央，以涂抹200μL滅菌水的培養(yǎng)基為對照，每處理4次重復，30℃培養(yǎng)3d，每天記錄菌落的擴展直徑。

2結(jié)果與分析

2.1花生冠腐病田間發(fā)病癥狀

2019—2021年花生生育期間，對安徽省花生產(chǎn)區(qū)冠腐病田間發(fā)病情況調(diào)查表明，該病害主要危害花生植株根頸部（圖1A）。出苗前發(fā)病時，種仁腐爛，病部長出松軟的黑色霉狀物；出苗后發(fā)病時，病原先侵染幼苗的子葉和胚軸，然后侵染莖基部，被侵染組織四周被黑色的孢子所覆蓋。隨著病情加重，病斑逐漸擴大，整個根頸區(qū)變成黑褐色并潰爛，最后幼苗枯萎死亡（圖1B、C）。

2.2病原菌的形態(tài)學鑒定

菌落在PDA培養(yǎng)基上呈圓形，四周呈黃色。菌絲初為白色絨毛狀，后期上面長滿黑色的分生孢子，4～5d長滿直徑9cm的培養(yǎng)皿（圖2A、B）。待培養(yǎng)7d左右，光學顯微鏡下觀察，頂囊球形或近球形，黃褐色或褐黑色，直徑700～800μm；分生孢子梗長短不一，最長為3000μm，最短僅250μm，直徑15～25μm。小分生孢子呈球形，直徑4～5μm（圖2C）。根據(jù)上述病原菌菌落形態(tài)學特征，將所分離的病原菌初步鑒定為曲霉屬Aspergillus。

2.3病原菌的ITS鑒定

PCR擴增得到一條599bp的清晰條帶（圖3）。在NCBI上采用BLAST同源性比對，結(jié)果該序列與黑曲霉菌Aspergillusniger"ITS1基因序列（GenBank登錄號：LC105682.1）相似度均達100%。根據(jù)上述分子生物學鑒定結(jié)果，并結(jié)合菌落平板生長和顯微菌絲體形態(tài)觀察結(jié)果，將該病原菌鑒定為黑曲霉Aspergillusniger。

2.4病原菌致病性

在接種病原菌7d后，3個花生品種豫花9326、白沙1016、遠雜9102均出現(xiàn)不同程度的病癥，莖基部被侵染的組織呈水侵狀，淡褐色，覆蓋大量的黑色孢子，葉片失水萎蔫，發(fā)病較重的12d后病株枯死，而對照植株無任何癥狀（圖4）。

2.5病原菌的生物學特征

2.5.1病原菌在不同培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)。

菌絲在花生秸稈和PDA培養(yǎng)基上生長很快，與大豆和麥粒培養(yǎng)基上菌絲的生長速度存在明顯差異（圖5）。花生秸稈培養(yǎng)基上生長速度最快，麥粒培養(yǎng)基上病原菌生長速度最慢。

2.5.2病原菌在不同pH的PDA平板中的生長表現(xiàn)。

病原菌在pH7的PDA培養(yǎng)基上菌落擴展速度最快，pH為6時生長速度較pH7時稍慢，當pH為5和1即較酸性或者較堿性時，菌落生長速度最慢（圖6）。菌落在pH5的PDA培養(yǎng)基上，第一天生長速度最快，之后一直緩慢生長。菌絲生長速度存在差異，培養(yǎng)3d后，pH7與pH5、pH11、pH12存在明顯差異，與pH6、pH8、pH9之間無明顯差異。

2.5.3菌絲的致死溫度。

將經(jīng)過15個溫度處理（每個處理水浴加熱15min）的所有菌絲塊，置于PDA平板上暗培養(yǎng)2d后，51℃菌絲擴展最快，57℃菌絲生長速度最慢（圖7），當水浴溫度達到或高于59℃時，菌絲不生長，推斷該菌在59℃處理后會致死。

2.65種藥劑的室內(nèi)抑菌效果

75%百菌清可濕粉劑等5種藥劑處理后，50%多菌靈可濕粉劑和43%戊唑醇懸浮劑處理后菌落幾乎不生長，與對照存在顯著差異，抑菌效果最好；75%百菌清可濕粉劑處理效果次之；其次是70%代森錳鋅可濕粉劑，處理后第1天和第2天有抑制效果，第3天菌落生長直徑與對照無明顯差別；3%甲霜惡霉靈水劑處理后，菌落生長速度與對照無明顯差異，第3天后菌落生長速度較對照更快，抑菌效果差（圖8）。

3結(jié)論與討論

黑曲霉（Aspergillusniger）為子囊菌亞門、絲孢目、叢梗孢科、半知菌曲霉屬真菌，廣泛分布于世界各地的糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中，寄主范圍較廣，容易造成水稻、水果等糧食和食品發(fā)霉腐爛，除能引起曲霉病外，也能產(chǎn)生黑曲霉毒

素^［11］。 對黑曲霉報道較多的是作為重要的發(fā)酵工業(yè)菌種，如用于飼用苧麻木質(zhì)纖維素生物降解^［12］、玉米秸稈發(fā)酵^［13］等。國外已報道的引起花生冠腐病的病原菌為黑曲霉菌（ Aspergillus niger ）^{［5-6，8-9，14］}，對于花生冠腐病病原菌的系統(tǒng)研究，國內(nèi)學者研究較少，李楊等^［7］、張霞等^［15］也認為花生冠腐病是由黑曲霉（ Aspergillus niger ）引起，但對于花生冠腐病病原菌的鑒定多基于形態(tài)學。該研究通過對病原菌的形態(tài)學觀察和分子鑒定方法，明確安徽省花生冠腐病病原菌為黑曲霉菌（ Aspergillus niger ）。

花生冠腐病是花生苗期最常見的土傳病害之一，防治花生土傳病害最經(jīng)濟有效的方法是選用抗病花生品種和藥劑拌種。目前，對花生病害的防治多為化學藥劑拌種。該研究選擇5種常規(guī)的化學藥劑，通過測定藥劑對菌絲生長速度，明確5種不同殺菌劑對病原菌的抑制效果。為有效防治花生冠腐病，還需在此基礎(chǔ)上，進一步對病原菌的遺傳特性、致病機理進行深入研究，篩選田間防治藥劑，以期減輕花生冠腐病帶來的危害。通過對花生冠腐病病原菌的研究，可以為我國花生冠腐病的有效防控提供借鑒。

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