石斑魚中丁香酚殘留量的檢測方法及消解規律研究

摘 要：目的：建立氣相色譜串聯三重四極桿質譜測定石斑魚中丁香酚殘留量的方法，并對丁香酚在石斑魚內的消解規律進行研究。方法：樣品經乙酸乙酯提取，DB-5毛細管柱分離，在多反應監測模式下，外標法定量。結果：丁香酚在10～200 ng·mL-1濃度范圍內線性關系良好，線性系數大于0.999 0；檢出限和定量限分別為5 μg·kg-1和10 μg·kg-1；添加濃度為10～100 μg·kg-1時，平均加標回收率在99.3%～111.4%，相對標準偏差在1.12%～7.54%。結論：本方法前處理操作簡單，靈敏度高，重現性好，適用于石斑魚中丁香酚殘留量的檢測。丁香酚在石斑魚中前3 d消除較快，隨著時間的推移，消除速率趨于平緩。

關鍵詞：石斑魚；檢測方法；消除規律

Study on the Detection Method and Elimination Pattern of Residual Eugenol in Grouper

WANG Anwei1， WU Lili2， LIU Tianmi1*， LIN Yi1， LAI Changsheng1

（1.Testing Center of Aquatic Product Quality Safety of Hainan Province， Haikou 570206， China; 2.Hainan Technician College Food Department， Haikou 570206， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of eugenol residues in grouper by gas chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry and to study the digestion law of eugenol in grouper. Method： The samples were extracted with ethyl acetate and separated on a DB-5 capillary column. The samples were quantified by external standard method in multiple reaction monitoring mode. Result： Eugenol had good linear relationship in the concentration range of 10～200 ng·mL-1， with a linear coefficient greater than 0.999 0. The limits of detection and quantification were 5 μg·kg-1 and 10 μg·kg-1， respectively. When the concentration was 10～

100 μg·kg-1， the average spike recovery was 99.3%～111.4%， and the relative standard deviation was 1.12%～

7.54%. Conclusion： This method has simple pretreatment operation， high sensitivity and good reproducibility， and is suitable for the detection of eugenol residues in grouper. Eugenol was eliminated rapidly in grouper within the first

3 days， and the elimination rate tended to be slow over time.

Keywords： grouper; detection method; elimination pattern

丁香酚作為一種麻醉劑，對淡水魚、海蝦等鮮活水產品具有非常好的麻醉效果，常應用于水產品收買、貯存和運送環節[1-5]。但長期食用含丁香酚的水產品可能對人體健康構成潛在的風險，因此美國已將其列入第3類致癌物[6]。

目前，測定水產品中丁香酚殘留量的方法有高效液相色譜法（High-Performance Liquid Chromatography，HPLC）[7-9]、氣相色譜法（Gas Chromatography，GC）[10-11]、氣相色譜-串聯質譜法（Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，GC-MS/MS）[12-16]、液相色譜-串聯質譜法[17-18]等。本研究旨在開發一種以渦旋振蕩提取結合低溫高速離心的凈化方式，通過樣品前處理、色譜和質譜條件的優化，建立一種檢測石斑魚中丁香酚殘留量的GC-MS/MS檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用石斑魚，均購自海口市農貿市場；乙酸乙酯（色譜純），德國默克公司；有機相針式濾器（尼龍，0.22 μm），上海安譜實驗科技股份有限公司；丁香酚標準溶液（1 000 μg·mL-1），天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000D氣相色譜質譜聯用儀，安捷倫公司；AutoVAP S60全自動高通量透明可視化多樣品自動濃縮儀，美國ATR公司；RechBio-GLF三維研磨離心冷凍一體機，上海瑞茋生物科技有限公司；DL-6000B離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備

對石斑魚進行去鱗后，取其肌肉或可食用部分進行均質處理。準確稱取2.0 g（精確至0.002 g）均質后的樣品，置于50 mL離心管中。加入3 mL乙酸乙酯，渦旋混合10 min，以6 000 r·min-1冷凍離心10 min，取上清液1 mL經0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，待測。

1.3.2 標準溶液配制

取1 mg·mL-1的丁香酚標準溶液，用乙酸乙酯稀釋成濃度為1 000 ng·mL-1的標準儲備液。分別量取濃度為1 000 ng·mL-1的丁香酚標準儲備液10 μL、20 μL、40 μL、100 μL、200 μL于1 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度線，得到所需系列標準使用液。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

HP-5MS石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm），高純He（≥99.999%）；流速：1.0 mL·mL-1；進樣體積：2 μL；不分流模式進樣；進樣口溫度：260 ℃；柱溫箱溫度：80 ℃；升溫過程：80 ℃停留2 min，以40 ℃·min-1上升到250 ℃，保留5.75 min。

1.4.2 質譜條件

電子轟擊離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；輔助加熱：280℃；隔墊吹掃流量：3.0 mL·mL-1；分流口吹掃流量：10 mL·mL-1；溶劑延遲：3.75 min；增益因子：1.0；檢測模式：多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。化合物監測參數見表1。

1.5 石斑魚中丁香酚消解規律研究

對石斑魚空白樣品進行低濃度（20 μg·kg-1）、中濃度（50 μg·kg-1）、高濃度（100 μg·kg-1）加標，每個濃度平行加標6次；分別在5 ℃和-18 ℃狀態下放置0 d、1 d、3 d、6 d、10 d、16 d進行測定，取6個平行數據的平均值，計算回收率。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

分別用甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷4種有機溶劑進行提取，對其應用效果進行比較。結果顯示，用正己烷提取時，回收率較低；用甲醇和乙腈提取時，石斑魚肉樣品易結塊，提取液雜質較多不利于后期凈化，基線較高，色譜峰有拖尾，回收率起伏較大；用乙酸乙酯提取時，峰形比較理想，無雜質峰干擾，回收率好。因此，選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。提取液經300 mg/3 mL的固相萃取柱（C18）凈化后，峰形與用乙酸乙酯提取相比并沒有得到顯著改善，且用外標法定量時回收率顯著降低。故經綜合考慮，用乙酸乙酯提取后直接上機進行檢測。

2.2 質譜條件優化

將濃度為100 ng·mL-1的丁香酚標準溶液自動進樣，分別在選擇離子監測和多反應監測模式下進行質譜掃描。結果顯示，在多反應監測模式下丁香酚信號較強，故選擇多反應監測模式。分別設定母離子的碰撞能為5 eV、10 eV、15 eV、30 eV、40 eV進行掃描，結果顯示離子對的碰撞能在10 eV時信號最優，故離子對的碰撞能設定為10 eV。

2.3 方法檢出限、定量限及線性范圍

采用儀器自帶的數據處理軟件對采集的丁香酚質譜數據進行處理，得到標準曲線、色譜圖及總離子流圖，見圖1、圖2、圖3。在10～200 ng·mL-1濃度范圍內，線性方程為y=184.171 295x-55.745 702（r2＝0.999 9），線性符合要求；按照3倍信噪比、10倍信噪比濃度計算得到檢出限和定量限分別為5 μg·kg-1和10 μg·kg-1。

2.4 基質效應評價

本研究采用提取后基質匹配添加法評價基質效應（Matrix Effect，ME）。結果顯示，ME值為99.8%，表明選用的樣品制備條件滿足水產品丁香酚殘留檢測的需要，對檢測結果的準確性影響比較小，定量過程不需要基質加標工作曲線進行校正。

2.5 回收率與精密度

根據本研究實驗方法，對空白石斑魚基質進行加標，測定丁香酚添加濃度為10 μg·kg-1、20 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1的回收率和相對標準偏差，每個水平做6次重復試驗，外標法計算，結果見表2。回收率為99.3%～111.4%，相對標準偏差為1.12%～7.54%，說明方法的準確度和精密度良好。

2.6 實際樣品測定

本研究從海南省海口市、瓊海市、萬寧市的農貿市場和石斑魚收購點抽取石斑魚100份，采用本方法進行檢測。結果顯示，有29份石斑魚樣品檢出丁香酚成分，檢出率為29%，含量在11.2～3 520.7 μg·kg-1。

3 石斑魚中丁香酚消解規律

如圖4所示，在5 ℃環境下，低、中、高濃度在第3天的回收率分別為62.0%、36.1%、43.0%；在20 μg·kg-1時，第6天檢測值低于檢出限；在50 μg·kg-1時，第10天檢測值低于檢出限；在100 μg·kg-1時，第16天檢測值回收率為30%。在-18 ℃環境狀態下，低、中、高濃度在第3天的回收率分別為62.0%、59.6%、56.5%；在20 μg·kg-1時，第10天檢測值低于檢出限；在50 μg·kg-1時，第16天檢測回收率為33.5%；在100 μg·kg-1時，第16天檢測值回收率為37.3%。

綜上，不同濃度、不同溫度狀態下石斑魚中丁香酚回收率隨著時間的延長逐漸降低，降低速率也逐漸趨于緩慢；回收率在5 ℃環境狀態下降低幅度比在-18 ℃環境狀態下大。由此可見，丁香酚消解速率隨溫度的降低而減慢。同一溫度下，在前3 d內丁香酚消解的速度很快，隨著時間的推移，消解的速率變緩。

4 結論

本研究建立了一種石斑魚中丁香酚殘留量的檢測方法，該方法前處理簡單、快速，準確度和精密度良好，檢出限較低，基本滿足對石斑魚中丁香酚殘留量的快速檢測。丁香酚在石斑魚中殘留量隨著時間推移，其含量急劇下降，在5 ℃環境狀態下回收率降低速率比在-18 ℃環境狀態下更快，3 d后下降速率趨于平緩，在添加濃度為100 μg·kg-1時，16 d后依然能檢出丁香酚。

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