基于液相色譜-質譜/質譜聯用技術的獸藥殘留檢測方法優化研究

摘 要：本文采用液相色譜-質譜/質譜聯用技術檢測水產品中的磺胺類獸藥殘留。結果表明，在2～800 ng·mL-1的線性范圍下，5種磺胺類獸藥的相關系數均大于0.99，說明方程的線性關系良好；5種磺胺類獸藥的方法檢出限為0.002～0.120 μg·kg-1，定量限為0.012～0.370 μg·kg-1；在25 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-1的加標水平下，5種磺胺類獸藥在水產品中的平均回收率為58.10%～124.37%，相對標準偏差為5.63%～15.03%。

關鍵詞：獸藥殘留檢測；液相色譜；質譜聯用技術；流動相參數

Optimization of Veterinary Drug Residue Detection Method Based on Liquid Chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry

LIN Yang

（Shenzhen Zhongjian Joint Testing Co.， Ltd.， Shenzhen 518000， China）

Abstract： This article uses liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry to detect residues of sulfonamide veterinary drugs in aquatic products. The results showed that within the linear range from 2 ng·mL-1 to 800 ng·mL-1， the correlation coefficients of the five sulfonamide veterinary drugs were all greater than 0.99， indicating a good linear relationship of the equation; the detection limit of five sulfonamide veterinary drugs rang from

0.002 μg·kg-1 to 0.120 μ g·kg-1， and the quantification limit range from 0.012 μg·kg-1 to 0.370 μg·kg-1; at spiked levels of 25 μg·kg-1， 50 μg·kg-1， and 100 μg·kg-1， the average recovery rates of five sulfonamide veterinary drugs in aquatic products was 58.10% to 124.37%， with a relative standard deviation of 5.63% to 15.03%.

Keywords： veterinary drug residue detection; liquid chromatography; mass spectrometry combined technology; mobile phase parameters

隨著食品生產規模的擴大，食品安全問題成為當前消費者關注的重點[1]。磺胺類藥物屬于水產品中常用獸藥成分之一，人體若攝入過量，可能導致泌尿系統受到影響，造成泌尿系統結石或堵塞，同時該成分會使人體產生過敏反應，刺激機體生成抗體[2]。為了解磺胺類獸藥成分在水產品中的殘留問題，早期研究采用免疫分析法檢測獸藥殘留量，但免疫分析法需要確定檢測獸藥的種類，通過抗原抗體結合識別的方法定量檢測殘留成分，對于多種獸藥成分的檢測效率不佳。氣相色譜方法對于多種成分的檢測效果較好，但該方法對于沸點較高的成分需要以衍生化產物形式檢測，衍生化成分可能導致檢測存在假陽性問題[3]。為了兼顧獸藥殘留檢測的精度和廣度，本文提出了基于液相色譜-質譜-質譜聯用技術的獸藥殘留檢測方法，通過優化磺胺類獸藥成分的檢測參數與試劑條件得到一種檢測精度較高的水產品獸藥殘留檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

鯽魚、沼蝦、黃鱔和河蟹，均購自成都水產農貿市場。甲醇、乙腈和甲酸，色譜純，德國Merck公司；正己烷、乙酸乙酯、甲醇和乙腈，分析純，國藥集團；磺胺嘧啶（98.0%）、磺胺異惡唑（98.0%）、磺胺二甲基嘧啶（99.0%）、磺胺多辛（97.0%）、磺胺5-甲氧嘧啶（99.0%），德國Sigma公司。4000 Q-Trap質譜儀，Applied Biosystems；HZT-A500電子天平，Mettler toledo；5810R離心機，Eppendorf；Acquity UPLC I-Class液相色譜儀、Waters Oasis HLB固相萃取裝置，Waters；N-EVAP 112氮吹儀，Organomation。

1.2 樣品前處理

①樣品預處理。分別將水產品（鯽魚、沼蝦、黃鱔和河蟹）分為3個樣品組，每個樣品組至少選取

3個個體進行等質量取樣，取樣部位為內臟組織、肌肉組織及外表皮組織。所取樣品裝入滅菌樣品管中冷凍保存，待檢測前取出。②混合渦旋。準確稱取一定量的待測樣品，加入對應比例的緩沖溶液進行混合渦旋。③萃取。萃取過程加入萃取劑提取樣品，先用渦旋儀振蕩1 min，再用超聲儀處理8 min。④凈化。待測樣品在4 ℃條件下離心，10 000 r·min-1，5 min。經過樣品預處理、混合渦旋、萃取和凈化等操作提取樣本內容，待上機檢測。

1.3 標準溶液的配制

①儲備液的配制。分別稱取5種磺胺類標準品各10 mg，用甲醇定容至10 mL，得儲備液的濃度為1 mg·mL-1，在-18 ℃下避光保存。②工作液的配制。以空白樣品進行樣品預處理獲取空白基質溶液，用空白基質溶液稀釋儲備液，配制標準系列工作液的濃度梯度為2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、400 ng·mL-1和800 ng·mL-1。

1.4 提取過程優化

①提取試劑的優化。分別選擇甲醇、乙酸乙酯和乙腈為提取試劑，通過加標實驗檢測提取效果。②填料的優化。為了優化獸藥的檢測效果，分別以常規填料與多壁碳納米填料為柱填充，檢測樣品回收率，確定納米填料的吸附效果。③淋洗液甲醇濃度及洗脫液甲醇用量的優化。分別研究不同甲醇濃度（5%、10%、15%）和不同甲醇體積（4 mL、6 mL、8 mL和10 mL）對檢測回收率的影響。

1.5 儀器條件

（1）色譜條件。BEHC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μL）；流動相A相為5 mmol·L-1濃度的乙酸銨溶液-0.10%濃度甲醇；B相為甲醇；測試柱溫為30 ℃；樣品進液流速為0.6 mL·min-1，進液量體積為5 μL；樣品檢測溫度為10 ℃。

（2）質譜條件。母離子（m/z）的掃描范圍為50～600，子離子（m/z）的檢測范圍為50～400[4-5]；質譜檢測采用多反應監測掃描模式；毛細管電壓為4.0 kV；脫溶劑氣流速為800 L·h-1，溫度為450 ℃；錐孔氣流速和電壓為30 L·h-1、40 V。

2 結果與分析

2.1 提取過程優化

①提取試劑的優化。乙酸乙酯的樣品平均回收率為45.26%～62.38%，乙腈的樣品平均回收率為67.44%～81.45%，而甲醇的樣品平均回收率為81.3%～96.8%，相較于乙酸乙酯和乙腈的提取效果更好，因此最終選用甲醇為提取溶劑。②填料的優化。常規填料的樣品平均回收率為47.15%，多壁碳納米填料的樣品平均回收率為89.42%，因此采用多壁碳納米作為實驗填料。③淋洗液甲醇濃度及洗脫液甲醇用量的優化。當甲醇濃度為5%時，大部分磺胺類物質的洗脫效率較低，平均回收率僅有30.15%～53.64%；當甲醇濃度為10%時，平均回收率為62.41%～85.15%；當甲醇濃度為15%時，平均回收率為61.33%～82.07%。8 mL甲醇用量的平均回收率為92.15%，4 mL、6 mL、10 mL甲醇用量的平均回收率分別為78.42%、84.04%、86.12%。根據綜合洗脫效果選擇10%的甲醇水溶液為淋洗液，洗脫過程的甲醇用量為8 mL。

2.2 獸藥殘留的線性方程、方法檢出限與定量限

以標準品的濃度（x）為橫軸，以標準品的檢測峰面積與內標峰面積比值為縱軸（y），繪制標準曲線。由表1可知，相關系數均大于0.99，說明線性關系良好；磺胺類獸藥的方法檢出限為0.002～

0.120 μg·kg-1，定量限為0.012～0.370 μg·kg-1。

2.3 磺胺類獸藥的回收率與精密度

在空白基質中，分別添加5種磺胺類獸藥標準品（濃度分別為25 μg·kg-1、50 μg·kg-1、100 μg·kg-13個梯度），重復測定5次。由表2可知，5種磺胺類獸藥的平均回收率為58.10%～124.37%，相對標準偏差為5.63%～15.03%，其中磺胺多辛在加標濃度為25 μg·kg-1時的回收率略低，可能是由于磺胺多辛的回收難度較高，而低加標濃度下易受到基質效應影響，導致測定回收率偏低。水產樣品中5種獸藥成分的檢測精密度存在差異，磺胺異惡唑獸藥成分在加標濃度為25 μg·kg-1和磺胺二甲基嘧啶獸藥成分在加標濃度為50 μg·kg-1時的相對標準偏差數據都偏高，可能是由于低加標濃度下，獸藥成分測定值受到基質的影響，導致存在結果偏差，其他獸藥成分的檢測相對偏差都在10%的范圍內，說明研究方法可以用于水產品中磺胺類獸藥的檢測。

2.4 水產品獸藥殘留檢測

為了評估本方法的實際檢測效果，抽樣選取水產品進行獸藥殘留的檢測，每組檢測的樣品數量不低于3個個體，得到5種磺胺類獸藥成分的檢測數據如圖1所示。圖1中顯示SDZ和SMD兩種獸藥成分在樣品中的檢出率較高。其他磺胺類獸藥成分的殘留量較低，符合檢測標準。水產品檢測結果中，沼蝦和鯽魚中的磺胺類獸藥成分的殘留量較低，黃鱔與河蟹中的磺胺類獸藥成分檢測量明顯超出殘留量要求。因此監管部門可以根據檢測結果監管水產用藥，規范養殖用藥標準，確保食品安全。

3 結論

本方法對于5種磺胺類獸藥在水產品中的平均回收率為58.10%～124.37%，不同加標濃度下的獸藥檢測相對標準偏差為5.63%～15.03%，說明研究方法能用來檢測磺胺類獸藥在水產品中的殘留量。

參考文獻

[1]張微，肖曼，吳丹，等.固相萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產養殖“非藥品”投入品中37種禁限獸藥[J].分析測試學報，2022，41（12）：1751-1757.

[2]吳雙敏，李龍，侯仁，等.獸藥小分子與生物識別元件相互作用研究進展[J].中國畜牧獸醫，2022，49（2）：

755-764.

[3]葉倩，朱富偉，王剛，等.牛奶中14種除草劑殘留的氣相色譜-串聯質譜檢測方法開發[J].農藥學學報，2022，24（2）：404-410.

[4]張申平，周靜，杜茹蕓，等.高分辨質譜在食品農藥殘留檢測中的研究進展[J].分析測試學報，2023，42（4）：

502-509.

[5]萬建春，韓穎，馬欣欣，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬尿中12種禁用獸藥殘留[J].色譜，2024，42（5）：474-480.