粗穗披堿草1H1S染色體特異熒光原位雜交標記開發

關鍵詞：米日穗披堿草：1HtS染色體：探針：熒光原位雜交標記

銹病和白粉病是小麥的主要病害，嚴重影響小麥產量。小麥近緣物種含有眾多抗小麥病害優異基因，導入這些抗性基因是改良小麥的重要手段。粗穗披堿草（Elymus trachycaulus，2n=4x=28，基因組為S S H H）高抗小麥白粉病、葉銹病、稈銹病、大麥黃矮病和梭條花葉病等病害。研究發現，雖然小麥一粗穗披堿草羅伯遜易位系1HtS.1BL喪失了白粉病抗性，但因粗穗披堿草1HtS染色體臂上含有抗葉銹病基因Lr55和一個暫未命名的抗條銹病基因，該易位系目前仍然對09-9-1441-1、09-9-1426-1、09-7-922-1、09-7-949-1和09-9-1505-1等葉銹菌混合生理小種以及CY32、CY33、CY34和Su-4等條銹菌混合生理小種表現為近免疫，仍是改良小麥的優異基因源。前期，我們團隊開發了粗穗披堿草IHtS特異的部分分子標記：Gill B S團隊建立了粗穗披堿草1HtS細胞學標記。然而，相對于精確鑒定小麥一粗穗披堿草lHtS染色體小片段易位系易位斷點的需求，這些分子標記和細胞學標記的數量還遠遠不能滿足材料精準鑒定需求。因此，非常有必要繼續開發粗穗披堿草1HtS細胞學標記及DNA標記。

細胞學標記是鑒定小麥背景中外源染色質的有效手段，已被廣泛用于外源染色質的鑒定。早期的細胞學標記主要根據染色體的大小、隨體的有無、長短臂的比值等核型特征來鑒定外源染色體；其后，依據C帶、N帶、Q帶和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等技術建立的細胞學標記先后發展起來，其中FISH技術是目前最常用的小麥外源染色質鑒定手段。依據探針的不同，原位雜交可分成三種類型：第一類是以基因組總DNA為探針的基因組原位雜交：第二類是以重復DNA序列為探針的原位雜交：第三類是以單拷貝DNA序列作為探針的原位雜交技術。隨著實驗技術的改進，非變性熒光原位雜交技術（non-denaturingFISH，ND-FISH）由于其簡便易操作和經濟高效的優點已被廣泛用于小麥族物種染色質鑒定，而針對物種特異染色體片段開發的寡核苷酸探針以及合成的串聯重復序列探針在ND-FISH分析中應用廣泛。

為了獲得小麥一粗穗披堿草1HtS小片段易位系，我們利用中國春ph1b基因突變體與粗穗披堿草1HtS.1BL易位系進行了雜交回交，已經獲得了大量后代材料。為了開發用于鑒定小麥一粗穗披堿草1HtS染色體小片段易位系的FISH標記，本研究利用小麥及其近緣種探針以及利用生物信息學開發的小麥1BS染色體新探針對中國春一粗穗披堿草1HtS．1BL羅伯遜易位系和對照中國春進行ND-FISH分析，建立能夠覆蓋粗穗披堿草1HtS染色體的FISH標記，以期為后續小麥一粗穗披堿草1HtS抗病小片段易位篩選和鑒定提供新的檢測方法。

1材料與方法

1.1供試材料

中國春一粗穗披堿草1HtS．1BL羅伯遜易位系（TA5072），由美國堪薩斯州立大學BerndFriebe教授惠贈。中國春（Chinese Spring，CS），由電子科技大學楊足君教授提供。

1.2實驗方法

1.2.1探針設計與合成實驗所用探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo -pTa535-1由成都瑞信生物公司合成，序列同文獻。根據前人研究合成小麥及其近緣種探針21個，由寧波康貝生化有限公司合成。

在IWGSC網站（https：//iwgsc. nal. usda. gov）下載中國春的參考基因組序列，將1BS染色體上的序列按50bp窗口依次截取，然后用BLASTN軟件將這些序列與IBS染色體全序列進行比對。按照在IBS染色體上的拷貝數從多到少的順序對這些序列進行排序，選取并合成拷貝數最高的前61個序列作為探針，編號為B1-B61，由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

根據生物信息學分析結果選“ATC-GATCGATCGATCG”為種子序列，按每次1bp對種子序列向前滑動，每次滑動窗口選取3個堿基，重復8次這3個堿基的為一條選定序列，總共獲得60條序列。用bowtie軟件將這些序列與1B染色體全序列進行比對，剔除已發表的，最終得到40條新序列，將其分別編號為B62-B85、B87-B90、B92-B101、B105和B108，送北京擎科生物科技股份有限公司合成探針備用。

1.2.2根尖處理和原位雜交根尖處理方法參考文獻[31]：將種子置于鋪有濾紙且濕潤的培養皿中，放人22℃恒溫光照培養箱中：待種子萌動后，將培養皿轉到4℃冰箱中放置24h，之后再次放入22℃恒溫光照培養箱中培養：待種子根尖長至2～3cm時，剪下根尖，放入離心管中，用一氧化二氮氣體處理2h，向離心管（置于冰水混合物中）中加入500uL 90%乙酸，8～10min后用吸管吸掉乙酸，并用ddH20沖洗兩遍，然后用刀片切下根尖分生組織部分，用1%果膠酶Y23（YakultPharmaceutical Tokyo）和2%纖維素酶R-10的酶解液（稱量0.1g果膠酶和0.2g纖維素酶，加入2mL 5x檸檬酸緩沖液，再分多次加入8mL滅菌ddH20，搖晃使固體完全溶解、溶液透亮）37℃酶解1h，用70%乙醇沖洗根尖兩遍，隨后用解剖針將根尖搗碎，4000r/min離心2min，倒掉70%乙醇，最后加入30uL冰醋酸滴片備用。

FISH方法參見文獻[30]：先用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo -pTa535-1對供試材料TA5072和CS的染色體制片進行雙色FISH分析，照相后洗脫FISH信號，再用試驗探針對Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1雜交的同——細胞進行FISH分析并照相，比對TA5072和CS的FISH信號，獲得TA5072中IHtS．1BL易位染色體的雜交信號。

2結果與分析

2.1 122個探針在IHtS染色體上的信號檢測

ND- FISH結果顯示，小麥及其近緣種的21個（不含Oligo-pSc119.2-1和Oligo -pTa535-1）探針中，僅Oligo-HvT01、Oligo-713、Oligo-H12-404三個（14.29%）探針在粗穗披堿草IHtS染色體上有明顯雜交信號。根據IBS染色體序列設計合成的61個探針中，僅B14和B24兩個（3.28%）探針在粗穗披堿草1HtS染色體上有雜交信號。根據j堿基重復序列合成的40個探針中，B62、B64和B66等3 1個（77.50%）探針在粗穗披堿草1HtS染色體有明顯雜交信號。綜上，本研究合成的122個探針中共有36個（29.51%）在粗穗披堿草1HtS染色體上有雜交信號，列于表1，其中33個（27.05%）為新開發探針。

2.2 36個探針在1HtS染色體上的信號分布類型

首先，利用寡聚核苷酸探針Oligo-pSc119.2-1和Oligo-pTa535-1對TA5072和CS進行雙色FISH分析，鑒定出1HtS.IBL染色體；其后，洗脫掉FISH信號，再利用新合成的探針對二者進行FISH分析。結果表明，根據探針在粗穗披堿草1HtS染色體上的分布位置及信號強弱（圖1），可將36個探針的雜交信號分為五種類型（表1、圖2）。第1類探針信號只分布在染色體1HtS的末端，1HtS其他位置沒有信號，僅包括1個探針，即Oligo-HvT01。第Ⅱ類探針信號覆蓋染色體1HtS的3/4．該類探針包括Oligo-713和Oligo-H12-404。第Ⅲ類探針信號覆蓋染色體1HtS的絕大部分，包括B74、B76、B77共3個探針。第Ⅳ類探針包括B14、B24和B64等12個探針，信號僅分布在著絲粒處。第V類探針信號分布在著絲粒和近著絲粒處，包括B62、B66等18個探針。

3討論與結論

目前，ND-FISH已經被廣泛用于小麥近緣屬物種染色質鑒定研究。Tang等開發的探針Oligo-HvTOI可以有效鑒定大麥染色體；Fu等設計開發的探針Oligo-1162、Oligo-pSc200和Oli-go-pSc250可有效區分小麥背景中的黑麥染色體；Yu等根據Liu等開發的LTR pDbH12探針開發了寡核苷酸探針Oligo-pDb12H，用其替代LTR pDbH12可使實驗操作更加簡單快捷；Wang等利用寡核苷酸探針Oligo -pDb12H和Oligo-B11建立了簇毛麥2Vb染色體的最新FISH核型：Xi等根據已發表的特異重復序列合成寡核苷酸探針Oligo-B11和Oligo-pThp3.93，可以代替GISH（基因組原位雜交）區分部分長穗偃麥草、中間偃麥草和十倍體長穗偃麥草。然而，目前未發現利用寡核苷酸探針建立披堿草染色體FISH標記的報道。本研究利用122個合成的寡核苷酸探針對TA5072和CS進行FISH分析，發現Oligo-HvT01、Oligo-713和Oligo-H12-404等36個探針在1HtS染色體上有信號，建立了檢測小麥背景中粗穗披堿草1HtS染色體的FISH標記。

前人研究發現，探針Oligo-HvT01在大麥染色體短臂末端均有雜交信號。本研究也發現探針Oligo-HvTO1雜交信號分布在粗穗披堿草短臂1HtS末端，說明此探針是大麥和粗穗披堿草染色體短臂末端共有特異序列。探針Oligo-k566和Oligo-713雜交信號分布在簇毛麥2Vh染色體的短臂近著絲粒處和長臂近著絲粒處。探針Oligo-H12-404可雜交簇毛麥、大麥和偃麥草JS等染色體，在粗穗披堿草1HtS著絲粒處也有強雜交信號，因此，Oligo-H12-404探針可能是小麥近緣物種著絲粒處共有特異序列。Bards-ley等根據SSR重復序列（AAC）、（ACG）和（CGT）在小麥和一些外緣物種中的雜交位置，判定這些序列是C帶的主要組成部分；同樣的，Gong等發現（GAA）重復序列是單芒山羊草N染色體的C帶主要組成部分。Cuadrado等發現（AC）、（AAC）s和（AAG）s等序列是大麥染色體著絲粒處、近著絲粒處和染色體臂近末端處重要序列組成部分。本研究開發的40個簡單三堿基重復序列探針中的B74等33個探針能夠雜交粗穗披堿草1HtS染色體不同部位，說明這些探針序列是1HtS染色體的異染色質組成部分，這為后續研究粗穗披堿草異染色質組成、類型和進化奠定了基礎。

綜上，本研究新開發的探針可以完全覆蓋粗穗披堿草1HtS染色體，為后續篩選和鑒定小麥一粗穗披堿草染色體1HtS小片段易位系提供了新的檢測方法。