3種雞源乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜形成的比較研究

關鍵詞：鼠李糖乳桿菌；戊糖片球菌；口乳桿菌；大腸桿菌；生物被膜形成

細菌生物被膜是細菌黏附于物體表面將自身包裹于分泌的大量多糖、蛋白質和DNA等多聚物質中而形成的復雜膜狀結構，一旦形成就會賦予細菌極強的耐藥性。大腸桿菌可直接在機體組織及器官表面形成生物被膜，提高了其耐藥性和黏附性，甚至能逃避免疫淋巴系統的分辨和攻擊，是導致畜牧業中細菌性疾病最常見的病原菌，給養殖業帶來嚴重的經濟損失。其中，致病性大腸桿菌以生物被膜形式感染尤為常見，細菌耐藥性日益嚴重導致抗生素的療效不斷下降，出現反復感染。

乳酸菌作為一類公認安全的益生菌，是定植在動物消化道內的主要共生菌之一，具有促進動物生長、提高機體免疫力、抑制腸道有害菌生長等特性，目前已在醫藥衛生、食品保健和畜牧獸醫等領域廣泛應用。近年來，乳酸菌對病原菌的抑制作用備受關注，其可以通過改善宿主腸道微生態平衡來增強腸道免疫力并提高健康水平，還能夠預防和治療腹瀉等多種疾病，已成為較為理想的臨床治療方案之一，篩選具有抑菌活性以及耐藥性等功效的菌株是當前畜牧獸醫領域研究的熱點。

前期研究發現，雞腸道乳酸菌是較理想的益生菌來源，能提高畜禽的生長性能，改善免疫功能和雞肉品質．對多種致病菌和霉菌的生長具有明顯的抑制作用，而關于雞源腸道乳酸菌對大腸桿菌生物被膜生成抑制作用的研究較少。本研究在建立大腸桿菌生物被膜模型的基礎上，觀察鼠李糖乳桿菌、戊糖片球菌和口乳桿菌對大腸桿菌生物被膜生成的抑制效果，旨在為探索乳酸菌拮抗大腸桿菌感染機制提供參考資料。

1材料與方法

1.1試驗材料

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus thamnosus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、口乳桿菌（Lactobacillus oris）、大腸桿菌（Escherichia coli）菌種由青島農業大學動物營養代謝病與中毒病實驗室保存。0.9%生理鹽水、草酸銨結晶紫染液、革蘭氏染色液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、LB固體培養基、LB液體培養基、乳酸桿菌固體培養基、乳酸桿菌液體培養基均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2細菌活化

吸取200uL大腸桿菌菌種加入LB液體培養基，吸取200uL戊糖片球菌、鼠李糖乳桿菌或口乳桿菌菌液分別加入乳酸桿菌液體培養基。37℃恒溫搖床內培養24h后，分別涂布到對應固體培養基，37℃恒溫培養箱內培養24h。挑取單個菌落，接種至對應的液體培養基中，37℃恒溫搖床內培養24h，觀察菌落形態。挑取單菌落涂片后進行革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢，確定細菌染色特征是否與對應菌種相符。

1.3細菌生長曲線的測定

按培養液量5%加入菌液至錐形瓶中，37℃恒溫搖床內培養，每隔6h取培養液1mL，加入石英比色皿，用培養液為對照調零，用分光光度計測280nm的OD值，以時間為橫坐標、OD280值為縱坐標，繪制各菌株生長曲線，確定生長平臺期。

1.4種子茵液濃度的測定

將種子菌液用滅菌生理鹽水按10倍梯度稀釋107～108倍，分別取100uL接種至呈液體的相應固體培養基中，混勻冷卻至培養基呈固體，置于37℃恒溫培養箱內培養24～36h。菌落計數后，計算種子菌液細菌濃度。

1.5細菌生物被膜培養

1.5.1置片法將蓋玻片置于5%蛋清生理鹽水中浸潤后，超凈臺中自然干燥，置于6孔培養板中，每孔加入3mL液體培養基。大腸桿菌用LB液體培養基培養，戊糖片球菌等用乳酸桿菌液體培養基培養。每孔加入300uL種子菌液，37℃恒溫培養箱培養，分別在6、12、24h用無菌PBS清洗2次，干燥后甲醇固定5min。用結晶紫染色液或革蘭氏染色液染色10min，沖洗干燥后，用95%乙醇脫色5min，干燥后封片，鏡檢觀察生物被膜生長情況。

1.5.2微板法在96孔培養板中，每孔中加入200uL菌液（108 CFU/mL），37℃孵育12h。吸棄培養液，用無菌PBS緩慢清洗2次，用200uL甲醇固定5min。吸棄甲醇后風干，加入200uL結晶紫染色10min，洗滌干燥后，用95%乙醇脫色5min，在酶標儀590nm波長下測定吸光度值。每個菌種重復4孔，取平均值。未接種菌液微孔加人生理鹽水作為陰性對照。

1.6乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜生成試驗

1.6.1全菌液抑制試驗（置片法）應用置片法在6孔培養板中培養大腸桿菌12h至生物被膜生成，用無菌PBS洗滌2次，加入2.70mL液體培養液和0.30mL乳酸桿菌全菌液，分別在6、12h時各取出兩個玻片，固定、染色及鏡檢方法同1.5.1。

1.6.2全茵液和上清液抑制試驗（微板法）將3種乳酸菌全菌液分別3000r/min離心10min，獲得上清液。在96孔培養板中，每孔中加入200uL大腸桿菌菌液（108 CFU/mL），37℃孵育12h。吸棄上清液后，加入200uL乳酸菌全菌液或上清液，置于37℃恒溫培養箱中培養，分別在6h和12h時測定OD590值，其他處理及檢測方法同1.5.2。

1.7數據統計與分析

應用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行試驗數據統計處理，吸光度值結果以平均數±標準差表示。用One-way ANOVA比較處理間相關指標差異，采用最小顯著極差法（LSD）對差異顯著的數據進行多重比較，Plt;0.05為差異顯著。

2結果與分析

2.1菌種鑒定

如表1所示，大腸桿菌和3種乳酸菌培養后經菌落形態觀察和菌體革蘭氏染色鏡檢分析，確定均符合相應細菌特征，可用于后續試驗。

2.2細菌生長曲線的測定

如圖1所示，4種菌株0D280值均在0～24h內變化顯著，在24～36h內變化減緩，36～48h內變化較小，初步說明大腸桿菌培養24h、3種乳酸菌培養24～36h可達到生長平臺期。

2.3細菌生物被膜形成能力檢測

2.3.1置片法如圖2所示，大腸桿菌培養12h時革蘭氏染色可見菌體密集分布（圖2A），結晶紫染色顯示生物被膜開始形成，培養物連接呈片狀分布（圖2B）；24h時革蘭氏染色可見生物被膜形成明顯（圖2C），結晶紫染色可見交織鏈接的生物被膜骨架（圖2D）。由此確定大腸桿菌生物被膜在培養12h時初步形成，24h時能形成明顯的生物被膜。

3種乳酸菌生物被膜生成染色特征如圖3所示。培養至36h時被膜形成不明顯，也未見明顯的交織鏈接的生物被膜骨架（圖3）。初步確定3種乳酸菌培養36h時生物被膜的生成情況與大腸桿菌不同。

2.3.2微板法如圖4所示，大腸桿菌和3種乳酸菌微板法靜置培養前12h 0D590值逐漸升高，24～36h變化不明顯。其中，大腸桿菌、戊糖片球菌與口乳桿菌在培養6～36h的OD590值變化較小，說明上述3種細菌培養36h內生物被膜生成變化較小：鼠李糖乳桿菌培養6～36h生物被膜的OD590值顯著高于其他3種細菌，說明其生物被膜生成厚度可能更高。

2.4乳酸菌對大腸桿菌生物被膜形成的抑制作用

2.4.1全菌液抑制作用置片法結果大腸桿菌生物被膜培養12h（圖2）加入乳酸菌全菌液作用6h和12h，結果（圖5）顯示，3種乳酸菌均能顯著抑制大腸桿菌生物被膜的生成。作用6h時，鼠李糖乳桿菌組與口乳桿菌組大腸桿菌生物被膜片狀較小，數量較少（圖5A1、C1），戊糖片球菌組大腸桿菌生物被膜呈較大較多的片狀（圖581）；作用12h時，鼠李糖乳桿菌組大腸桿菌生物被膜呈較小的片狀，數量較少（圖5A2），戊糖片球菌組和口乳桿菌組大腸桿菌生物被膜呈較大較多的片狀（圖582、C2）。3種乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜生成的效果排序為鼠李糖乳桿菌gt;口乳桿菌gt;戊糖片球菌。

2.4.2全菌液和上清液抑制作用微板法結果如圖6所示，鼠李糖乳桿菌全菌液組作用6h時OD590值顯著高于大腸桿菌和其他兩種乳酸菌（Plt;0.05），作用12h鼠李糖乳桿菌組OD590值顯著高于大腸桿菌組和戊糖片球菌組（Plt;0.05）（圖6A）。乳酸菌上清液作用6h和12h時，大腸桿菌OD590值均顯著高于3種乳酸菌組（Plt;0.05），作用12 h時鼠李糖乳桿菌組OD590值顯著低于戊糖片球菌組（Plt;0.05）（圖6B）。3種乳酸菌抑制大腸桿菌生物被膜生成的效果表現為鼠李糖乳桿菌gt;口乳桿菌gt;戊糖片球菌。

3討論與結論

多數細菌在自然界和人類生活中以生物被膜形式存在，并黏附在各類有機或無機物表面，生物被膜耐藥性極強，可以在宿主的免疫應答和吞噬作用下保護細菌。致病性大腸桿菌是臨床上常見的多重耐藥細菌，耐藥率呈逐年上升的趨勢，對動物和人類的健康構成重大威脅。根據美國國立衛生研究院統計，大約有65%的微生物感染和80%的慢性感染與生物被膜有關。因此，建立確實可行的細菌生物被膜模型是進行下一步研究的基礎，而置片法和微孔板法是常用的生物被膜研究方法。結晶紫通過離子相互作用與DNA、蛋白質和生物被膜多糖等細菌細胞成分結合。通過結晶紫與黏附在微孔板上的細菌細胞結合，用于研究體外生物被膜的形成，OD值是檢測生物被膜形成能力的指標。置片法發現大腸桿菌可在培養12h時開始形成生物被膜，細菌開始聚集，結晶紫染色后發現生物被膜呈明顯的片狀或團塊狀，24h時形成明顯的膜狀物，發現明顯的網狀結構，特征符合大腸桿菌生物被膜的形態結構；并且微孔板法顯示，大腸桿菌培養24h和36h時0D值變化較小，也說明此時大腸桿菌生物被膜已經形成，可用于后續生物被膜抑制試驗。另外，本研究置片法結果表明，3種乳酸菌單獨培養24h僅見菌體密集，即使培養36h也未見明顯的交織鏈接的生物被膜骨架和膜狀結構等典型的生物被膜結構：而結晶紫染色發現鼠李糖乳桿菌在培養過程中OD值升高明顯，戊糖片球菌與口乳桿菌在培養過程中變化不明顯：綜合置片法和微板法結果，說明3種乳酸菌在現有條件下培養36h內生物被膜形成能力不同，鼠李糖乳桿菌生物被膜形成能力優于戊糖片球菌與口乳桿菌。

乳酸菌在代謝過程中能產生多種有抑菌活性的代謝產物，能抑制腐敗微生物和致病菌生長，有調節微生態平衡，增強宿主腸道抵抗力，預防和治療腹瀉，消除過敏等多種生物學功能。前期研究發現，鼠李糖乳桿菌等乳酸菌對大腸桿菌等病原菌具有較強的抑制作用，但抑制試驗多集中在抑菌濃度、抑菌圈大小、抑菌曲線等方面，可能涉及多種機制，如改變細胞壁和細胞膜的通透性，抑制蛋白質和核酸的合成以及抑制酶活性等，而乳酸菌與細菌生物被膜的相互作用仍需深入研究。本研究通過置片法和微板法探索了3種乳酸菌對大腸桿菌生物被膜形成的抑制作用，其中3種乳酸菌均為革蘭氏陽性菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，因此可利用置片法+革蘭氏染色法更好地顯示乳酸菌對生物被膜生成的抑制作用。本研究置片法結果發現，乳酸菌全菌液均能顯著抑制大腸桿菌生物被膜的生成，其中鼠李糖乳桿菌的抑制效果優于其他兩種乳酸菌：應用微板法測定乳酸菌全菌液和上清液對大腸桿菌生物被膜生成的抑制作用取得了相似的結果。

本研究在建立大腸桿菌生物被膜模型的基礎上，通過置片法和微板法觀察測定了3種乳酸菌對大腸桿菌生物被膜生成的抑制作用，結果發現：（1）大腸桿菌在培養12h時生物被膜呈片狀，24 h時形成明顯的膜狀物和交織鏈接的生物被膜骨架，不同于3種乳酸菌形成的生物被膜；（2）3種乳酸菌均對大腸桿菌生物被膜的形成具有明顯的抑制作用，且抑制效果鼠李糖乳桿菌gt;口乳桿菌gt;戊糖片球菌。