奶酪攝入量與骨關節炎關聯性的雙樣本孟德爾研究

Associations of cheese intake with osteoarthritis：a Mendelian randomization study

Abstract" Objective：Using Mendelian randomization method，explore the causal relationship between cheese intake and the risk of osteoarthritis.Methods：Data from gene-wide association studies were used for analysis.The exposure factor was cheese intake，and the outcome variable was osteoarthritis.Mendelian randomization（MR） analysis was performed by IVW method，MR-Egger method and weighted median，and pleiotropy test，heterogeneity test and sensitivity analysis were performed.Results：The results of IVW and weighted median showed that cheese intake was a protective factor for osteoarthritis，and there was a negative causal association between them（Plt;0.05）.The MR-Egger regression showed no statistically significant association between cheese intake and osteoarthritis（P=0.335）.The results were tested for no heterogeneity or pleiotropy，and sensitivity analyses did not identify SNPs that significantly changed the overall causal relationship.Conclusion：Cheese intake is causally related to osteoarthritis.

Keywords" cheese intake； osteoarthritis； Mendelian randomization

摘要" 目的：采用孟德爾隨機化的方法，探討奶酪攝入量與骨關節炎發生風險的關聯性。方法：采用全基因組關聯分析數據進行研究，暴露因素為奶酪攝入量，結局變量為骨關節炎。采用逆方差加權法（IVW）法、加權中位數法、MR?Egger法進行孟德爾隨機化分析，并進行多效性分析、異質性檢驗、敏感性分析。結果：IVW法和加權中位數法結果顯示，奶酪攝入量為骨關節炎發病的保護因素，二者之間存在負向因果關聯（Plt;0.05）。MR?Egger回歸結果顯示，奶酪攝入量與骨關節炎發病關聯無統計學意義（P=0.335）。研究結果經檢驗不存在異質性和多效性，敏感性分析未發現導致總體因果關系發生顯著變化的單核苷酸多態性位點。結論：奶酪攝入量與骨關節炎發生風險存在因果關系。

關鍵詞" 奶酪攝入量；骨關節炎；孟德爾隨機化

doi：10.12102/j.issn.1009-6493.2024.19.006

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種以關節炎癥、疼痛、軟骨退化為主要病變的慢性退化性關節疾病[1]，是全球導致骨關節疼痛、殘疾的主要原因之一[2]。隨著骨關節炎的慢性、長期發展，病人出現的關節疼痛、僵硬、腫脹等癥狀，可能會影響病人的身體和心理健康，為病人帶來高額的經濟負擔[3]，降低其生活質量[4]。既往研究表明，奶酪作為一種發酵的全脂乳制品，其攝入量與2型糖尿病[5]、缺血性心臟病[6]、高血壓[7]等發病呈負相關。同樣，Denissen等[8]納入3 451名荷蘭人的觀察性研究發現，奶酪攝入量的增加與膝關節骨關節炎的發生呈負相關，但由于該研究為觀察性研究，樣本量較小，且可能存在選擇偏倚，需要慎重解釋結果。與此相反，一項納入2 481名美國人群的前瞻性研究結果顯示，高奶酪攝入的女性可能會增加骨關節炎進展[9]，這些結果的差異可能是由于其他乳制品攝入或飲食結構不同帶來的影響。同時，既往研究缺乏涉及奶酪攝入量與骨關節炎的隨機對照試驗研究，二者的關聯性仍存在一定的質疑與爭議。孟德爾隨機化研究是流行病學中廣泛用于評估暴露因素與臨床疾病之間潛在因果關系的重要方法，其以遺傳變異為工具[10]，以大樣本的全基因組關聯分析（genome?wide association study，GWAS）中的單核苷酸多態性位點（single nucleotide polymorphism，SNP）為基礎[11]，由于等位基因隨機分配到個體中是在疾病發生之前，可使混雜因素的影響達到最小化[12]，減少因果估計值的偏倚。因此，本研究通過孟德爾隨機化的方法，探討奶酪攝入量與骨關節炎發生風險的潛在關聯性，以期為奶酪攝入量與骨關節炎之間發生、發展的關聯性提供理論依據。

1" 資料與方法

1.1 研究設計

本研究以GWAS中的SNP為基礎，采用雙樣本孟德爾隨機化分析方法，評估奶酪攝入量與骨關節炎之間的關聯性和因果關系，并采用敏感性分析對結果的可靠性進行了檢驗。本研究中孟德爾隨機化結果的有效性涉及3個關鍵假設：1）SNP與奶酪攝入量密切相關；2）SNP與已知的“暴露?結局”關聯的混雜因素不相關；3）SNP僅通過奶酪攝入量影響骨關節炎，不與骨關節炎直接相關。具體流程見圖1。

1.2 資料來源

本研究中的暴露因素為奶酪攝入量，通過公開數據庫獲得數據，其數據來源于英國生物銀行（UKBB），該數據庫中統計的樣本量已超過50萬人。本研究通過MR?Base平臺獲取了英國生物樣本庫中關于奶酪攝入量（ID：UKB?B?1 489）的數據，研究對象包括451 486例歐洲人群，SNP數量為9 851 867個。此外，骨關節炎（ID：ebi?a?GCST005811）的數據來自IEU OpenGWAS project數據庫，研究對象包括63 556例歐洲人群病例和50 898例對照，SNP數量為15 870 475個。本研究所涉及的數據均來源于公共數據庫，因此不涉及倫理審查問題。

1.3 工具變量

首先，考慮到孟德爾隨機化的第1個關鍵假設，即SNP必須與奶酪攝入量密切相關，在全基因組水平上篩選了與骨關節炎顯著相關的SNP（Plt;5×10-8，R2lt;0.001，window=10 000 kb）。其次，為了滿足孟德爾隨機化第2個關鍵假設，即SNP與已知的“暴露?結局”關聯的混雜因素不相關，選擇在Phenoscanner數據庫中查詢，以確保篩選后的SNP與已知的混雜因素不相關。最后，采用異質性檢驗剔除具有顯著異質性的SNP，得到與骨關節炎顯著相關的SNP作為本研究的工具變量。同時，為了判斷選擇的工具變量是否存在弱工具變量偏倚，需要進行F統計量的計算評估，計算公式[12]為F=R2（N-2）/（1-R2），N為暴露因素GWAS的樣本量，R2為工具變量解釋暴露因素變異的程度，其詳細計算公式如下，R2=[2×EAF×（1-EAF）×beta2]/[2×EAF×（1-EAF）×beta2+2×EAF×（1-EAF）×N×SE（beta）2]，EAF為效應等位基因頻率，beta為SNP對骨關節炎的效應值，SE（beta）為遺傳效應的標準誤差，若Fgt;10則說明存在弱工具變量偏倚的可能性較小[13]。

1.4 孟德爾隨機化分析

采用逆方差加權法（inverse variance weighted，IVW）、加權中位數法（weighted median）、MR?Egger回歸法（MR?Egger regression）進行雙樣本的孟德爾隨機化研究分析。如果所有的遺傳變異都滿足工具變量假設，此時IVW法是因果效應的適當估計，可用作主要分析結果[14]。但是IVW法存在一定多效性偏倚的影響，因此，需要進行敏感性檢驗來判斷結果的有效性。使用加權中位數法分析時，當工具變量對遺傳變異貢獻權重超過50%時，分析具有可信性[15]。當工具變量與結局的直接效應獨立于工具變量與暴露因素的關聯效應（instrument strength independent of direct effect，InSIDE）的假設滿足時，MR?Egger法可作為強效的評價工具，產生的非零截距可以用于評價多效性[16]。對于3種孟德爾隨機化的統計值，本研究選取IVW法為主要結果。

1.5 敏感性分析

采用Cochran Q檢驗、MR?Egger法、留一法（leave?one?out）檢驗工具變量間是否存在異質性，評估結果的敏感性。Cochran Q檢驗可用于判斷所選工具變量間是否存在異質性。MR?Egger法參考截距項，作為是否存在水平多效性的依據，當截距接近零時，所得結果和IVW法相似；若截距項與零間隔較大，則表明工具變量間有存在水平多效性的可能[17]。留一法指逐一剔除單個SNP并計算剩余SNP的合并效應，用于判斷結局是否受到單個SNP不成比例的影響[18]。

2" 結果

2.1 工具變量的篩選及弱工具變量偏倚的判斷

最終篩選出62個與奶酪攝入量有關的SNP作為工具變量，所選SNP互相獨立且顯著相關（R2lt;0.001，Plt;5×10-8）。同時，經計算所選SNP的F值均gt;10，表明不存在弱工具變量偏倚，結果較可靠。

2.2 雙樣本孟德爾隨機化分析結果

通過雙樣本孟德爾隨機化得出所選SNP對骨關節炎的影響，IVW法結果顯示，奶酪攝入量為骨關節炎發病的保護因素，二者之間存在負向因果關聯，奶酪攝入量的增加可減少骨關節炎的發病風險（β=-0.560，SE=0.146，Plt;0.001）。加權中位數法結果與之相似（β=-0.468，SE=0.191，P=0.014）。MR?Egger回歸結果顯示，奶酪攝入量與骨關節炎發病關聯無統計學意義（β=-0.594，SE=0.611，P=0.335）。詳見圖2。各種孟德爾隨機化分析方法得到的因果效應方向見圖3。

2.3 敏感性分析

2.3.1 水平多效性檢驗

使用MR?Egger法的截距項進行評估，P=0.955，表明工具變量之間不存在水平多效性，所選工具變量是可靠的。

2.3.2 異質性檢驗

Cochran Q檢驗結果顯示，P=0.061，表明所選工具變量間不存在異質性。同時，所選的SNP的漏斗圖顯示，該研究的因果效應分布是基本對稱的，不存在偏倚，見圖4。

2.3.3 留一法敏感性分析

使用留一法敏感性分析法對結果進行分析，逐個剔除所選SNP并觀察對總體因果關系的影響，結果顯示，未發現導致總體因果關系發生顯著變化的SNP位點，見圖5。

3" 討論

本研究采用了雙樣本孟德爾隨機化研究，對奶酪攝入量與骨關節炎發生風險之間的因果關系進行了系統、全面的評估，結果顯示，在歐洲人群中，奶酪攝入量與骨關節炎發生風險之間呈負相關，奶酪攝入是骨關節炎的保護因素。

本研究與既往觀察性研究的結果是一致的，即奶酪攝入的增加能降低膝關節骨關節炎的發生風險。例如，Denissen等[8]納入3 010名40～75歲的歐洲群體，探討乳制品消費與膝關節骨關節炎發生、發展的關系，結果顯示二者之間存在負相關關系。然而，Ka?ar等[19]納入655名土耳其人進行橫斷面研究，結果表明，牛奶可降低骨關節炎的發生率，但奶酪攝入與骨關節炎間未發現關聯，這可能與研究對象與歐洲人群奶酪攝入量及種類具有一定的差異，且研究并未糾正潛在的重要混雜因素有關。綜上所述，奶酪攝入量與骨關節炎存在某種關聯。本研究通過孟德爾隨機化方法證明增加奶酪攝入可降低骨關節炎風險。既往研究表明，奶酪中的益生菌能降低炎癥、提高免疫力等[20]。同時，奶酪中含有豐富蛋白質，包括酪蛋白和乳鐵蛋白等[21]，這些蛋白質對減輕炎癥具有正向作用[22]。因此，奶酪對骨關節炎的影響不僅僅是單一成分的作用，而是多種有益成分的共同作用。孟德爾隨機化具有獨有的特征，包括顯著的因果相關性、混雜因素的干預少、能直接觀察暴露因素、不具有反向因果關系、研究設計更接近于隨機分配等[23]，使本研究結果免于混雜因素或其他偏倚的影響，代表奶酪攝入量與骨關節炎之間具有關聯性。同時，本研究采用3種統計方法進行孟德爾隨機化分析，2種方法的結果趨于一致，因此推斷結果較穩定。同時，本研究也存在一定的局限性。首先，盡管本研究經多效性檢驗未發現多效性效應的證據，同樣在敏感性分析中顯示有類似的結果，但在孟德爾隨機化研究中，很難完全排除潛在多效性影響；其次，本研究涉及的遺傳數據僅包括歐洲人群，這可能影響研究結果向其他種族、國家人群的推廣，畢竟奶酪的成分中含有乳糖，亞洲東部人群對乳糖的代謝能力與歐洲人群間存在一定的差異[24]；最后，本研究的數據僅關注了奶酪攝入量，未注意其他飲食的攝入，也不清楚攝入奶酪的類型及持續時間，使研究具有一定的局限性。

4" 小結

綜上所述，本研究采用雙樣本孟德爾隨機化方法分析發現，奶酪攝入量與骨關節炎發生風險之間存在因果負相關。奶酪的攝入可能會為未來骨關節炎的預防和管理開辟新的途徑。

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