基于轉錄組學分析多發性硬化相關的鐵死亡基因及其免疫浸潤

摘 要：目的 通過轉錄組學分析探討多發性硬化（MS）中鐵死亡基因免疫浸潤及綜合網絡調控。方法 采用轉錄組學分析方法鑒定MS中相關鐵死亡基因表達，通過GO和KEGG進行富集分析。運用LASSO和SVM-RFE算法識別MS中的關鍵鐵死亡基因，采用ROC曲線分析評價其診斷效能。構建MS小鼠模型通過qRT-PCR驗證其表達。CIBERSORT算法探索關鍵鐵死亡基因與免疫細胞浸潤的相關性。利用在線數據庫和Cytoscape分別預測候選小分子化合物/藥物、轉錄因子和miRNA。結果 篩選出MS中39個為鐵死亡基因，與氧化應激相關。確定了BRD7、MTDH和SMAD7為MS關鍵鐵死亡基因，三者的診斷效能高，在MS小鼠模型中表達均較對照組升高；且與免疫浸潤高度相關。 結論 MS中鐵死亡基因BRD7、MTDH及SMAD7與免疫浸潤密切相關。

關鍵詞：多發性硬化；鐵死亡；轉錄組學分析；免疫浸潤

中圖分類號：R744.51 " " " " " " 文獻標志碼：A 文章編號：1671-0142（2024）06-0070-05

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統的進行性自身免疫相關的炎性脫髓鞘疾病，其以炎性反應、軸突損傷、脫髓鞘、神經元死亡和血-腦屏障破壞為特征[1-3]。MS好發于29～39歲，女性更為多見，中國整體人群MS發病率為0.235/10萬人年，復發率及致殘率高，于2018年被列入中國《第一批罕見病目錄》[4]。

目前，MS的發病機制尚未闡明。Luoqian等學者發現，鐵死亡可刺激MS小鼠模型即實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠的脫髓鞘和炎癥改變[5]。此外，Rayatpour等學者在局灶性脫髓鞘模型中發現鐵死亡基因表達升高[6]。誘導鐵死亡的因素可能促進MS的進展，但機制尚未明確。因此，靶向鐵死亡的治療靶點可能逆轉MS的進展[6]，探索MS的鐵死亡基因及其網絡調控特征，有助于闡明鐵死亡在MS中的致病機制，為MS的治療尋找潛在藥物靶點。

本研究利用轉錄組學方法分析基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中關于MS患者腦組織樣本的基因芯片數據集，探討MS相關差異表達鐵死亡基因的生物學功能、免疫浸潤情況，為MS的發病機制和診治研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 轉錄組學數據預處理及鐵死亡基因集獲取 在GEO數據庫中，篩選并下載GSE131282的基因表達譜芯片作為訓練集，其中包含來自63例MS患者的142個腦組織樣本和來自14例對照者的42個腦組織。同時下載GSE135511芯片作為驗證集。使用RStudio軟件（版本4.1.2）對數據進行預處理。同時，從FerrDb V2數據庫下載鐵死亡基因集。

1.2 DEG分析 “limma”軟件包篩選GSE131282中收集的MS患者和對照組的皮質樣本中的差異表達基因，差異基因的篩選標準為：矯正后Plt;0.05和基因表達 Log 倍數變化（Log fold change，LogFC）絕對值gt;0.585。使用“ggplot2”和“pheatmap”R軟件包可視化差異基因。

1.3 鐵死亡相關基因的鑒定和富集分析 從FerrDb V2數據庫中下載人的鐵死亡基因集。利用MS的差異表達基因與鐵死亡基因集取交集，獲得MS中相關鐵死亡基因。本研究通過David在線數據庫中GO（Gene Ontology）及KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析探索MS相關鐵死亡基因的功能及通路網絡。Plt;0.05表示差異具有統計學意義。R軟件中“ggplot2”包用于可視化富集分析結果。

1.4 基于機器學習算法篩選MS關鍵的鐵死亡基因 為了獲取關鍵的MS鐵死亡基因，本研究使用R中的“glmnet”和“mlbench”和“caret”包進行LASSO（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）和SVM-RFE（Support Vector Machine-Recursive Feature Elimination）分別從MS相關鐵死亡基因中篩選特征基因，并將此兩種算法得到的基因取交集后作為MS的關鍵鐵死亡基因。

1.5 MS關鍵鐵死亡基因的診斷效能評估 本研究利用受試者工作特征曲線（Receiver Operating Characteristic Curve，ROC）評估GSE131282基因表達譜芯片篩選的MS關鍵鐵死亡基因的診斷性能，利用ROC曲線下面積（Area Under Curve，AUC）值衡量關鍵鐵死亡基因診斷MS的效果。此外，在GSE135511集中驗證關鍵鐵死亡基因的診斷價值。

1.6 MS動物模型構建及關鍵鐵死亡基因表達驗證 為在MS動物模型中驗證關鍵鐵死亡基因的表達量，本研究根據已有文獻的方法構建EAE模型[7]。所有動物實驗符合ARRIVE指南并通過江蘇瀚江生物科技有限公司倫理委員會審核批準（批準文號：HJSW-24070201）。動物接受12 小時晝夜節律循環周期光照、恒溫恒濕飼養，食用標準嚙齒類動物滅菌后墊料、飼料及水。

免疫后21天收集腦組織進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測。使用RNA提取試劑盒（M5105，NCM， 中國），提取腦組織RNA，并用cDNA合成試劑盒（R333，Vazyme，中國）進行cDNA合成。采用qPCR試劑盒SYBR Green Master Mix（AG11733，AG，中國）對基因表達量進行定量，采用2-ΔΔCt法計算表達水平。β-actin作為內參基因。引物序列見表1。

1.7 關鍵MS鐵死亡基因與免疫細胞浸潤的相關性分析 本研究使用CIBERSORT算法評估MS腦組織的免疫浸潤，在R軟件中進行Spearman等級相關分析，探討關鍵MS鐵死亡基因與浸潤性免疫細胞之間的相關性，使用“ggplot2”包進行可視化。

1.8 統計分析 表達譜芯片數據集采用RStudio（4.1.2）進行分析，差異采用Wilcoxon檢驗進行組間分析，數據以不少于三次獨立實驗的平均值±平均值的標準誤差（SEM）表示。數據的正態性采用Shapiro-Wilk檢驗，兩組間比較采用Prism 9.0軟件中的非配對雙側t檢驗進行驗證。采用Spearman相關性分析統計基因與免疫細胞浸潤相關性。矯正后P值lt;0.05時，均認為有統計學意義。

2 結果

2.1 MS中差異表達基因鑒定 差異分析鑒定出3438個矯正后Plt;0.05且LogFC絕對值gt;0.585的差異表達基因。

2.2 MS鐵死亡相關基因及其富集途徑的鑒定" 將MS的差異基因與DEGs和FerrDb數據庫中的鐵死亡基因相交取交集（圖1A），得到39個MS鐵死亡相關基因。GO富集分析中生物過程（biological process，BP）功能富集顯示，MS鐵死亡相關基因主要富集在響應化學應激、氧化應激、細胞凋亡過程中；細胞成分（cell component，CC）分析表明，MS鐵死亡相關基因與過氧化物酶體、微體、自噬小體等顯著相關，且參與了多個分子功能（molecular function，MF）過程，包括雙鏈RNA結合、黃素腺嘌呤二核苷酸結合和轉錄調節抑制劑活性等（圖1B）。KEGG分析顯示，MS的鐵死亡相關基因不僅在自噬、凋亡中富集，也在脂質代謝和動脈粥樣硬化及神經退行性病變等途徑中富集（圖1C）。

2.3 基于機器學習算法篩選MS的關鍵鐵死亡基因 LASSO回歸分析從39個MS鐵死亡相關基因中篩選出9個特征基因（圖2A，B），SVM-RFE算法識別出了5個特征基因（圖2C），取交集篩選出三個重疊的基因作為MS的關鍵鐵死亡基因： BRD7、MTDH和SMAD7（圖2D）。

2.4 BRD7、MTDH及SMAD7的診斷性能評估 為了評估BRD7、MTDH和SMAD7的診斷價值，本研究通過ROC曲線計算其AUC值，三者的AUC值分別為： BRD7（0.992，95% CI：0.98～1.00）、MTDH（0.991，95% CI：0.977～1.00）和SMAD7（0.970，95% CI：0.937～1.00）。聯合BRD7、MTDH和SMAD7進行ROC曲線得到AUC值為1.00，在驗證集GSE135511中聯合BRD7、MTDH和SMAD7進行ROC曲線得到AUC值為0.815，分析提示BRD7、MTDH和SMAD7能夠準確診斷MS。

2.5 通過在體內實驗驗證BRD7、MTDH及SMAD7的表達 通過qRT-PCR檢測EAE小鼠模型中MS關鍵鐵死亡基因的表達。結果表明，與對照組相比，EAE小鼠腦組織中BRD7、MTDH及SMAD7表達明顯升高（圖3）。

2.6 BRD7、MTDH及SMAD7與免疫浸潤細胞的相關性分析 BRD7、MTDH及SMAD7均與幼稚B細胞、靜息肥大細胞、活化的NK細胞和激活的記憶CD4+ T細胞呈正相關。同時，它們與靜息的NK細胞、活化的肥大細胞、中性粒細胞和巨噬細胞M1/M2呈負相關（圖4A，B，C）。

3 討論

MS是一種累積中樞神經系統的自身免疫性致殘性疾病，其在異常的細胞及體液免疫作用下形成神經炎癥及神經退行性病變[8，9]，其發病機制尚未闡明，即使經過規范DMT治療，大部分患者的殘疾功能障礙仍呈緩慢進行性加重。隨著研究的不斷深入，研究者們認為鐵死亡可能參與MS的神經退行性改變，但具體機制仍未闡明。目前利用轉錄組學分析鐵死亡相關基因表達的研究較少[10]，因此，挖掘潛在的MS鐵死亡相關基因，可能為未來MS的治療提供新的方向。

本研究篩選出MS中39個異常表達的鐵死亡相關基因，富集分析發現MS中鐵死亡在響應化學應激和氧化應激等富集。有研究發現，在活躍的MS病變中，氧化的DNA和磷脂在脫髓鞘軸突、少突膠質細胞和神經元中積累，即氧化應激參與了MS的發生[11]。鐵死亡受鐵穩態、氧化應激、能量代謝調控[6，12]，當鐵依賴的活性氧積累和脂質過氧化，最終導致程序性細胞死亡[13，14]。根據進一步的KEGG分析，除了自噬和凋亡外，MS鐵死亡基因還在脂質和動脈粥樣硬化途徑、神經退行性變途徑中富集。該分析結果與既往研究結果一致，鐵死亡與其他形式的細胞死亡有關，如細胞凋亡和自噬[15]。MS鐵死亡基因的富集與動脈粥樣硬化等重疊交叉，進一步提示鐵死亡的一些潛在的關鍵分子和途徑參與MS的發生發展。

利用LASSO和SVM-RFE兩種基于機器學習算法，在MS中發現了三個關鍵的差異表達的鐵死亡基因：BRD7、MTDH和SMAD7，三者的AUC均大于0.90，提示三者對MS的診斷價值高。含溴結構域的蛋白質7（Bromodomain-containing proteins 7，BRD7）是識別乙?；嚢彼岬牡鞍踪|家族中密切相關的成員。BRD7的下調參與了多種疾病的病理生理特性[16]。Zhang等證實了BRD7通過線粒體鐵代謝途徑介導鐵死亡[17]。異粘蛋白（Metadherin，TDH）通過介導腫瘤的起始、進展、轉移和治療耐藥性參與多種類型癌癥的發展[18]。在MTDH調控的背景下，GPx4和SLC3A2表達下調，細胞內谷胱甘肽表達降低，增強癌細胞對鐵死亡的敏感性[19]。在MS的體外和體內研究中均發現，在靜脈注射潑尼松龍后SMAD7下調[20]。SMAD7是一種有效的肝素抑制劑，抑制肝素可破壞鐵的穩態。Peng等人研究發現，阿托伐他汀誘導的SMAD7下調可抑制鐵死亡，改善缺血再灌注損傷[21]。綜上，僅有SMAD7在MS中報道過，且其與BRD7和MTDH在MS中的鐵死亡作用尚需探索。

最近，Luoqian等學者首次揭示了MS中T細胞活化與鐵死亡相關[5]。然而MS中免疫細胞和鐵死亡的關系復雜，仍需大量基礎研究。本研究發現BRD7、MTDH及SMAD7均與幼稚B細胞、靜息肥大細胞、活化的NK細胞和激活的記憶CD4+ T細胞呈正相關。同時，它們與靜息的NK細胞、活化的肥大細胞、中性粒細胞和巨噬細胞M1/M2呈負相關。當免疫細胞影響鐵代謝或釋放細胞因子引起鐵死亡時，鐵死亡也可能反過來調節免疫細胞的激活和死亡。綜上，MS中BRD7、MTDH及SMAD7的基因介導的相關鐵死亡可能引起免疫細胞調控網絡的免疫擾動[22]；也可能是MS中促炎和抗炎機制的失衡與免疫失調促發了鐵死亡相關基因尤其是BRD7、MTDH及SMAD7的差異表達，即鐵死亡-免疫浸潤的交互作用參與MS的發病。

然而，本研究也存在局限性。首先，缺乏足夠的患者及動物的樣本量驗證鐵死亡相關基因的表達、免疫浸潤情況及其調控網絡。再者，未深入探索MS關鍵鐵死亡基因的具體致病機制。

4 結論

基于轉錄組學分析方法及機器學習方法，在MS中發現了與免疫細胞浸潤密切相關的鐵死亡相關基因BRD7、MTDH及SMAD7，為探索鐵死亡-免疫浸潤參與MS慢性炎性脫髓鞘、神經退行性變及免疫失調提供科學依據，并為MS的發病機制和治療策略提供一個新的綜合視角。

參考文獻：

[1]Bar-Or A， Li R. Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis： interactions， checks， and balances[J]. The Lancet Neurology， 2021， 20（6）： 470-83.

[2]Mapunda J A， Tibar H， Regragui W， et al. How Does the Immune System Enter the Brain？ [J]. Frontiers in immunology， 2022， 13.

[3]Correale J， Gaitán M I， Ysrraelit M C， et al. Progressive multiple sclerosis： from pathogenic mechanisms to treatment [J]. Brain：a journal of neurology， 2017， 140（3）： 527-46.

[4]中華醫學會神經病學分會神經免疫學組.多發性硬化診斷與治療中國指南（2023版）[J]. 中華神經科雜志， 2024， 57（1）： 10-23.

[5]Luoqian J， Yang W， Ding X， et al. Ferroptosis promotes T-cell activation-induced neurodegeneration in multiple sclerosis [J]. Cellular amp; molecular immunology， 2022，19（8）： 913-24.

[6]Rayatpour A， Foolad F， Heibatollahi M， et al. Ferroptosis inhibition by deferiprone， attenuates myelin damage and promotes neuroprotection in demyelinated optic nerve [J]. Scientific reports， 2022， 12（1）： 19630.

[7]Zhang S，Ma Y，Luo X，et al.Integrated Analysis of Immune Infiltration and Hub Pyroptosis-Related Genes for Multiple Sclerosis[J].Journal of inflammation reasearch，2023（16）：4043-59.

[8]Kuhlmann T， Moccia M， Coetzee T， et al. Multiple sclerosis progression： time for a new mechanism-driven framework [J]. The Lancet Neurology， 2023， 22（1）： 78-88.

[9]Thompson A J， Baranzini S E， Geurts J， et al. Multiple sclerosis[J].Lancet（London，England），2018，391（10130）：

1622-36.

[10]Sun Y， Xia X， Basnet D， et al. Mechanisms of Ferroptosis and Emerging Links to the Pathology of Neurodegenerative Diseases [J]. Frontiers in aging neuroscience，2022，14： 904152.

[11]Haider L， Fischer M T， Frischer J M， et al. Oxidative damage in multiple sclerosis lesions [J]. Brain： a journal of neurology， 2011， 134（Pt 7）： 1914-24.

[12]Jiang X， Stockwell B R， Conrad M. Ferroptosis： mechanisms， biology and role in disease [J]. Nature reviews Molecular cell biology， 2021， 22（4）： 266-82.

[13]Stockwell B R. Ferroptosis turns 10： Emerging mechanisms， physiological functions， and therapeutic applications [J]. Cell， 2022， 185（14）： 2401-21.

[14]Ajoolabady A， Aslkhodapasandhokmabad H， Libby P， et al. Ferritinophagy and ferroptosis in the management of metabolic diseases [J]. Trends in endocrinology and metabolism： TEM， 2021， 32（7）： 444-62.

[15]Liu X， Tuerxun H， Li Y， et al. Ferroptosis： Reviewing CRC with the Third Eye [J]. Journal of inflammation research， 2022，（15）： 6801-12.

[16]Park S W， Lee J M. Emerging Roles of BRD7 in Pathophysiology [J]. International journal of molecular sciences， 2020， 21（19）：7127.

[17]Zhang Z， Guo M， Shen M， et al. The BRD7-P53-SLC25A28 axis regulates ferroptosis in hepatic stellate cells [J]. Redox biology， 2020，（36）： 101619.

[18]Shen M， Wei Y， Kim H， et al. Small-molecule inhibitors that disrupt the MTDH-SND1 complex suppress breast cancer progression and metastasis [J]. Nature cancer，2022，3（1）： 43-59.

[19]Bi J， Yang S， Li L， et al. Metadherin enhances vulnerability of cancer cells to ferroptosis [J]. Cell death amp; disease， 2019，10（10）： 682.

[20]De Andres C， García M I， Goicoechea H， et al. Genes differentially expressed by methylprednisolone in vivo in CD4 T lymphocytes from multiple sclerosis patients： potential biomarkers [J]. The pharmacogenomics journal，2018，18（1）： 98-105.

[21]Peng Y， Liao B， Zhou Y， et al. Atorvastatin Inhibits Ferroptosis of H9C2 Cells by regulatingSMAD7/Hepcidin Expression to Improve Ischemia-Reperfusion Injury [J]. Cardiology research and practice， 2022， 2022： 3972829.

[22]Hohlfeld R. Multiple sclerosis meets systems immunology[J]. The Lancet Neurology，2021，20（11）： 887-8.

（責任編輯 楊荔晴）

Transcriptomic Analysis of Ferroptosis-Related Gene and Immune Infiltration in Multiple Sclerosis

ZHANG Shao-ru， ZHENG Zhi-peng， SHA Min， LU Hui-min

（The Affiliated Taizhou People's Hospital of Nanjing Medical University， Taizhou Jiangsu 225300， China）

Abstract： Objective To investigate the immune infiltration and integrated network regulation of multiple sclerosis （MS） by transcriptomic analysis. Methods The differentially expressed ferroptosis-related genes of MS was identified and the enrichment analysis was performed by GO and KEGG. LASSO and SVM-RFE algorithms were used to identify key ferroptosis-related genes in MS. ROC curve analysis was generated to test the predictive value of the key ferroptosis-related genes in MS. MS mouse model was constructed to verify their expression by qRT-PCR. The CIBERSORT algorithm explored the correlation of key ferroptosis-related genes and immune cell infiltration. Online databases and Cytoscape were applied respectively to predict candidate small molecule compounds / drugs， transcription factors and miRNA. Results 39 ferroptosis-related genes of MS were selected and they were found associating with oxidative stress. BRD7， MTDH and SMAD7 were identified as the ferroptosis-related genes of MS. These three genes had high diagnostic efficacy and were all increased in the MS mouse model compared with in the control group. Besides， they were highly associated with immune infiltration. Conclusion BRD7， MTDH and SMAD7 were closely related with immune infiltration.

Key words： multiple sclerosis; ferroptosis; transcriptomic analysis;immune infiltration