HPLC-ICP-MS在食品硒形態分析中的應用研究

摘 要：富硒食品的開發為人們補硒提供了有效途徑，而準確測定食品中硒形態及其含量是評價富硒食品生物功能和安全性的關鍵。本文系統闡述高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）應用于食品硒形態分析中的研究進展，以期為開發高效、便捷、推廣性強的硒形態分析方法提供參考。

關鍵詞：食品；硒形態；高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（HPLC-ICP-MS）

Research on the the Application of HPLC-ICP-MS in the Morphological Analysis of Selenium in Food

Abstract： The development of selenium-enrich foods provides an effective way for people to supplement selenium， and the accurate determination of selenium form and content in food is the key to evaluate the biological function and safety of selenium-rich foods. In this paper， the research progress of the application of high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry （HPLC-ICP-MS） in the morphological analysis of selenium in food is systematically reviewed， in order to provide reference for the development of an efficient， convenient and widely used method for selenium morphology analysis.

Keywords： food; form of selenium; high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry （HPLC-ICP-MS）

硒是人和動物生命活動中必需的微量元素，是谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶等的活性成分，在調節機體免疫力、清除自由基、防癌抗癌、保護肝臟等方面發揮著重要作用[1]。人體長期硒攝入不足會導致機體免疫力下降，誘發克山病、大骨節病、癌癥和糖尿病等多種疾病[2]。中國營養學會推薦正常成人的硒攝入量為60～250 μg·d-1[3]。然而，我國居民人均硒攝入量不足40 μg·d-1[4]。富硒食品的開發為人們補硒提供了便捷有效的途徑。硒在食品中分為無機硒和有機硒兩類，無機硒包括硒酸根、亞硒酸根和單質硒，有機硒包括硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸、硒代乙硫氨酸和硒脲等小分子硒化物以及硒蛋白、硒多糖等。有機硒生物活性高、安全無毒，是人體補充硒的主要來源。因此，全面、準確分析食品中硒的賦存形態，對于富硒食品的開發和人們科學補硒具有重要意義。

1 食品中硒形態的測定

硒的賦存形態及其含量在很大程度上決定著富硒食品的營養價值和安全性。食品基質復雜，硒形態種類多樣且總體上含量較低，而且不同硒形態之間極易發生轉化，導致食品中硒形態的分析具有一定挑戰性，至今尚未形成同時測定食品中多種硒形態的國家標準。

食品中硒形態的檢測分析主要包括待測樣品中硒化合物的提取、不同硒形態的分離富集以及各組分的定性定量檢測等環節。色譜分離與光譜/質譜檢測技術聯用，已成為硒形態研究的常用手段，如高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜（High Performance Liquid Chromatography-Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry，HPLC-ICP-MS）聯用技術、高效液相色譜-氫化物發生-原子熒光光譜（High Performance Liquid Chromatography-Hydride Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HPLC-HG-AFS）聯用技術等[5]。其中，HPLC-ICP-MS檢出限較低、分離能力較好以及靈敏度較高，是現階段硒形態分析中應用最廣泛的方法。例如，梁志森等[6]采用HPLC-ICP-MS測定植物性富硒食品中硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、L-硒甲基硒代半胱氨酸、L-硒代蛋氨酸、甲基亞硒酸及硒代乙硫氨酸7種硒形態的含量；孟莉等[7]采用HPLC-ICP-MS研究谷類食品中硒代胱氨酸、亞硒酸根、硒代蛋氨酸和硒酸根4種硒形態；李乾玉[8]采用HPLC-ICP-MS研究畜肉中硒酸根、亞硒酸根、硒代胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸5種硒形態。

2 食品中硒形態提取方法研究

采用高效的前處理方法提取食品中與大分子物質結合的硒，是硒形態定量分析的前提。常用的提取方法有水提法、緩沖鹽（Tris-HCl）提取法、酸提法、堿提法和酶提法。其中，酶提法因反應條件溫和、硒化合物的結構不易被破壞，在食品中硒形態的提取方面應用最為廣泛[9-11]。采用酶提法時，需要優化酶的種類、用量、酶解時間、溶液pH值等條件。常用于硒形態提取的酶主要有蛋白酶XIV、蛋白酶K、胰蛋白酶、纖維素酶等，多種酶混合使用已成為硒形態提取的一種趨勢[12]。為兼顧硒形態的提取效率和穩定性，提取時間大多都控制在3 h以內[13]。另外，超聲、微波等常用的輔助提取技術，在提高硒形態提取率、縮短提取時間方面有積極的作用[9]。

3 HPLC-ICP-MS應用于硒形態檢測的研究

儀器條件（色譜條件和ICP-MS工作條件）決定了所建立方法的精密度、準確性和檢測效率。因此，采用HPLC-ICP-MS測定硒形態時，需要綜合考慮色譜條件和ICP-MS工作條件的優化。

3.1 色譜條件的優化

采用HPLC-ICP-MS對硒元素形態進行分析時，色譜條件的優化主要涉及色譜柱的選擇、流動相的組成及濃度、洗脫方式、流動相流速等方面。

3.1.1 色譜柱的選擇

常用的色譜柱主要分為陰離子交換色譜柱和反相色譜柱。Hamilton PRP-X100陰離子交換色譜柱能夠有效分離5種硒形態，特別適用于無機硒和小分子硒代氨基酸的分離，分離度較好，峰形對稱，是目前硒形態分析最常用的色譜柱。但通常使用該色譜柱時個別硒形態出峰時間較長，靈敏度低，色譜柱的使用壽命易受到影響[14]。反相色譜柱可分離的硒形態種類更多，且分析時間短、峰形尖銳、靈敏度高，對大分子有機硒化合物分離效果較好，其在硒形態分析中的應用日益受到關注[15-16]。常用的反相色譜柱有安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱、Athena C18柱、Hypersil GOLD C8柱等，其中以ZORBAX SB-Aq C18柱應用最為廣泛。盧鑫等[9]比較了Hamilton PRP-X100柱和C18色譜柱對5種硒代氨基酸的分離能力，結果顯示C18色譜柱能夠完全分離5種硒代氨基酸，且峰形較好。陸奕娜等[17]對比了Hamilton PRP-X100陰離子分析柱、安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱、安捷倫TC-C18柱等6種色譜柱對硒形態的分離效果，結果顯示Hamilton PRP-X100柱能分離出5種硒形態，安捷倫ZORBAX SB-Aq C18柱能有效分離出7種硒形態，其他4種色譜柱均出現色譜峰重疊的現象。

3.1.2 流動相的選擇

采用Hamilton PRP-X100陰離子柱進行硒形態分離時，流動相常選擇磷酸鹽或檸檬酸。檸檬酸能夠增加色譜柱與硒化合物之間的作用力，從而增強分離效果、降低檢出限[18]。磷酸鹽具有較好的緩沖效果，能夠改善峰形、提高定量分析的準確性。采用反相色譜柱進行硒形態分離時，所用流動相主體為高水相，同時會加入緩沖液、離子對試劑和少量的極性有機溶劑，以改善不同硒形態的分離效果。常用的離子對試劑有烷基磺酸鹽類、四丁基銨鹽類和七氟丁酸等全氟羧酸類。少量的甲醇等有機溶劑能夠提高流動相的洗脫能力，增強檢測器的信號強度。現有研究中流動相以檸檬酸+己烷磺酸鈉+甲醇、磷酸氫二銨+四丁基溴化銨+甲醇兩種組合最為常見[13，19]。張珂等[20]以ZORBAX SB -Aq C18柱為分離色譜柱，以加入己烷磺酸鈉的檸檬酸體系為流動相，發現所測硒形態可以在8 min內有效分離，且各硒形態具有較高的靈敏度。王賢波等[11]研究發現，在磷酸氫二銨體系中加入0%～2.0%的甲醇能夠明顯增加硒形態的信號強度，且信號強度隨著甲醇濃度的升高而增大。

3.1.3 流動相的濃度

流動相的濃度與色譜分離效果和保留時間密切相關。流動相濃度越大，保留時間越短；但流動相濃度過大時，會導致硒形態分離不徹底，色譜峰重疊。盧鑫等[9]研究發現，當磷酸氫二銨溶液（pH值為6.5）為25 mmol·L-1時，5種硒代氨基酸分離效果較好且分析時間較短。姚真真等[21]研究發現，當檸檬酸濃度為5 mmol·L-1時，5種硒形態在15 min內能夠較好地分離；增加檸檬酸濃度，保留時間縮短，但峰形有重疊和拖尾現象。

3.1.4 流動相pH值

流動相的pH值對色譜峰的峰形、檢測靈敏度、保留時間影響較大。流動相的pH值不僅決定著硒在流動相中的不同離子形態，還會影響檸檬酸的質子化反應，改變不同形態硒與流動相之間的相互作用。李乾玉等[8]研究發現，以10 mmol·L-1檸檬酸及5 mmol·L-1己烷磺酸鈉（含1%甲醇）為流動相，在pH值為4.0時分離畜肉中的5種硒形態效果較好。李倩等[10]以25 mmol·L-1的檸檬酸為流動相，對比不同pH值對硒形態的分離效果，發現pH值為6.0時各硒形態分離度最好。

3.1.5 流動相流速

流動相的流速主要影響出峰時間和峰形。流速較小時，洗脫能力較弱，出峰延遲，峰形較寬；流速越大，峰形越窄，出峰時間越短。但流速過快會導致色譜峰重疊，常用的流速為0.8～1.2 mL·min-1。魏琴芳等[13]研究發現，30 mmol·L-1磷酸氫二銨（pH值為6.0）在流速為1.0 mL·min-1時，對大豆中5種硒形態的分離效果較好。陳思伊等[18]研究發現，流動相流速為1.0 mL·min-1時，色譜柱呈現出最佳的柱效，其對食品中5種硒形態的分離效果最優。

3.1.6 洗脫方式

不同的洗脫方式對硒形態的分析時間和分離效果都有影響。等度洗脫在硒形態分離中最為常見，但通常保留時間較長；梯度洗脫能有效縮短分析時間，在硒形態研究中的應用越來越受重視。陳貴宇等[16]以含5%的10 mmol·L-1檸檬酸的水溶液為流動相分離茶葉中的5種硒形態，采用等度洗脫時5種硒化合物的分離時間達到22 min，而梯度洗脫能夠將分離時間縮短至15 min內。陳思伊等[18]以不同濃度的磷酸氫二銨體系進行梯度洗脫，使5種硒形態的分析時間由原來的16.0 min左右縮短至8.5 min左右。

3.2 ICP-MS工作條件的優化

ICP-MS工作條件包括高頻入射功率、載氣流量、等離子體氣流量、檢測同位素、碰撞模式及蠕動泵轉速等。其中，檢測同位素數和碰撞模式的優化在現有研究中有報道，其他指標主要依靠ICP-MS調諧和優化來實現。

3.2.1 檢測同位素

硒的同位素常見有74Se、76Se、77Se、78Se、80Se和82Se，其自然豐度分別為0.87%、9.02%、7.48%、23.52%、49.82%和9.19%。80Se的自然豐度最高，其受到的干擾也最大，通常很少使用；78Se的自然豐度次之，常作為質譜檢測硒元素的定量離子[7-8]；其他各同位素的豐度都不超過10%，因此使用較少。王賢波等[11]以78Se作為監測同位素，采用H2-He碰撞池模式并調節碰撞氣流量，從而消除了40Ar38Ar+和38Ar40Ca+等對78Se的質譜干擾。曾鳳澤等[15]分別考察了6種同位素作為檢測質量數時各種硒形態在ICP-MS中的響應信號強度，結果發現可通過選擇碰撞池模式和優化碰撞反應氣流量來消除40Ar2H2+對82Se干擾。

3.2.2 檢測模式優化

常用的質譜檢測模式有標準模式（No gas，不通氣體）、雙路氣體（H2-He）碰撞反應池模式、高能氦氣模式、氦氣碰撞模式、動態反應池模式等。盧鑫等[9]考察了78Se和80Se為定量同位素，并在不同碰撞反應池模式下分別對檢測器調諧消除多原子離子的干擾，進一步聯用高效液相色譜測定5種硒代氨基酸的檢出限，結果顯示在高能氦氣模式下，當監測質荷比為78時，檢出限最佳。

3.2.3 其他ICP-MS工作條件優化

梁志森等[6]采用80Se為定量同位素，在動態反應池模式下，對比氧氣、甲烷分別作為反應氣體時對質譜干擾的消除效果，發現甲烷作為反應氣體時基線平整、響應較低，且質譜信號響應比氧氣作為反應氣體時高三四倍。林樾等[12]通過儀器調諧，在射頻功率為1 100 W、霧化器流量為0.91 L·min-1、輔助氣流速為1.2 L·min-1、泵速為0.8 r·s-1、定量同位素為78Se、檢測模式為氦氣碰撞模式等條件下，檢測了富硒碎米薺中的5種硒形態。

4 結語

當前，采用HPLC-ICP-MS對富硒食品中的硒形態進行定量分析成為熱點。但在不同食品中硒形態種類和含量各不相同，且各形態的硒在分析過程中易受環境影響發生轉化，因此需要結合待測樣品類型和儀器條件，選擇影響較大的因素進行方法優化。隨著聯用分析技術的不斷創新，期待建立更加快速便捷、精密準確的硒形態分析方法。同時，未知硒化合物的鑒定分析及相關硒化合物標準品的開發、硒形態與其他元素之間的相互關系也有待深入研究。

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