多指標響應面-滿意度函數優(yōu)化秦嶺龍膽提取工藝研究

摘要 ［目的］優(yōu)化秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的共提取條件。［方法］在單因素試驗基礎上選取最佳因素水平，采用響應面-滿意度函數優(yōu)選料液比、提取時間、超聲頻率對龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。［結果］秦嶺龍膽中2個成分的共提最優(yōu)條件為提取時間26 min、料液比1∶21（g：mL）、超聲頻率58 kHz，在此條件下，龍膽苦苷、獐牙菜苦苷的提取率分別為0.312%、0.258%，分別與預測值（0.326%、0.270%）接近。［結論］響應面-滿意度函數可用于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取工藝的優(yōu)化，該方法快速、簡單、穩(wěn)定可行。

關鍵詞 秦嶺龍膽；龍膽苦苷；獐牙菜苦苷；響應面法；滿意度函數；共提取條件

中圖分類號 R 284.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）23-0162-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.035

Study on Optimization of Extraction Process from Gentiana apiata by Multi-index Response Surface-satisfaction Function

XU Hai-yan1，HOU Min-na1，CHEN Yan-bin2 et al

（1.Medical College，Shaanxi Institute of International Trade，Xianyang，Shaanxi 712046;2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xi’an，Shaanxi 710075）

Abstract ［Objective］ To optimize the co-extraction conditions of gentiopicroside and swertiamarin from Gentiana apiata.［Method］On the basis of single factor experiments，the optimal factor level was selected，and the response surface-satisfaction function was used to optimize the effects of solid-liquid ratio，extraction time and ultrasound frequency on the extraction rates of gentiopicroside and swertiamarin.［Result］The optimal conditions for co-extraction of two components from Gentiana apiata in Qinling Mountains were extraction time of 26 minutes，solid-liquid ratio of 1∶21 （g∶mL），and ultrasonic frequency of 58 kHz.Under these conditions，the extraction rates of gentiopicroside and swertiamarin were 0.312% and 0.258%，respectively，which were close to the predicted values of 0.326% and 0.270%，respectively.［Conclusion］The response surface satisfaction function can be used to optimize the co-extraction process of gentiopicroside and swertiamarin from Gentiana apiata in Qinling Mountains.This method is fast，simple，stable and feasible.

Key words Gentiana apiata;Gentiopicroside;Swertiamarin;Response surface methodology;Satisfaction function;Co-extraction condition

基金項目 陜西省教育廳青年創(chuàng)新團隊建設科研計劃項目（21JP011）；陜西省科技廳項目（2021SF-365）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（S202113123008）。

作者簡介 許海燕（1977—），女，陜西咸陽人，副教授，碩士，從事天然產物化學研究。*通信作者，主任藥師，碩士生導師，從事藥物分析研究。

收稿日期 2023-12-14；修回日期 2024-01-30

秦嶺龍膽（Gentiana apiata）別名茱苓草、太白龍膽，屬龍膽科龍膽屬植物，秦巴山區(qū)特有藥用資源，生長于高山草甸中，夏、秋花期采收，民間以全草入藥，主要用于頭暈失眠、月經不調、小便不利等病癥［1-2］。有研究表明秦嶺龍膽中含有萜類、酚酸類、揮發(fā)油類、皂苷類、糖類等成分［3-4］。其中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷屬萜類中的環(huán)烯醚萜苷類化合物，為秦嶺龍膽中的主要化學成分，藥理試驗表明，該類成分具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、保肝、神經保護等作用［5-6］。查閱國內外相關文獻發(fā)現，對于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取方面的研究鮮見報道，而且目前對于中藥的提取工藝研究多以單一化合物為指標，少有多指標聯用考察提取工藝，這就增加了提取時溶劑、時間等能耗的浪費，不利于提取過程中綠色節(jié)能環(huán)保。因此，筆者以秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率為共提取評價指標，采用響應面-滿意度函數優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數，建立共提取方法，以期為秦嶺龍膽的提取及進一步發(fā)展提供參考依據，也為其他中藥材提取過程中的節(jié)能綠色環(huán)保提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試材 秦嶺龍膽藥材購自陜西省眉縣藥材公司，經陜西中醫(yī)藥大學楊新杰教授鑒定為秦嶺龍膽（Gentiana apiata N.E.Brown）的干燥帶花全草。

1.2 主要儀器與試劑 電子天平（京制00000246）；數控超聲波清洗器（KQ5200DE）；高效液相色譜儀（Waters e2695）。 龍膽苦苷標準品（PS010423）、獐牙菜苦苷標準品（PS012298），對照品純度均不低于98.5%；甲醇（色譜純）；磷酸、無水乙醇、甲醇，均為分析純。

1.3 龍膽苦苷、獐牙菜苦苷含量測定

1.3.1 藥材預處理。

將秦嶺龍膽藥材處理干凈，放置烘箱 （60 ℃） 中干燥，再用粉碎機進行粉碎，粉碎完成后過篩 （80目） ，置于密封袋中備用。

1.3.2 色譜條件。

色譜柱為Diamonsil C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為0.2% 磷酸溶液，B為10%甲醇溶液。洗脫采用梯度洗脫，各流動相的比例分別為0～10 min，A（90% → 72%）、B（10% → 28%）；10 ～ 30 min，A（72% → 71%）、B（28% → 29%）。流速1 mL/min；波長254 nm；進樣量10 μL［7］。

1.3.3 標準曲線的繪制。

精密量取適量的龍膽苦苷和獐牙菜苦苷對照品，純甲醇溶解后濃度分別為0.130和0.265 mg/mL的混合對照品溶液。移取混合對照品溶液1、3、5、7、9、11 mL，純甲醇稀釋10倍，以“1.3.2”色譜條件進樣，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 龍膽苦苷（獐牙菜苦苷）提取率的測定。

精密稱取適量處理干凈的藥材粉末，采用超聲法提取，甲醇為溶劑，過濾，濾液按“1.3.2”色譜條件分別測定秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量，按以下公式計算二者的提取率。

提取率=提取液中龍膽苦苷（獐牙菜苦苷）含量秦嶺龍膽質量× 100%

1.4 單因素試驗 該試驗使用超聲輔助提取法，以甲醇為提取溶劑，采用控制單一變量法，在保證其他條件不變的情況下，分別考察料液比、提取時間、超聲頻率3個因素對同時提取秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。

1.5 滿意度函數

滿意度函數用于優(yōu)化多種目標成分，可將多響應值的優(yōu)化轉變?yōu)閱雾憫档膬?yōu)化，將不同的響應值轉化為0～1的無量綱數值，數值趨近于1時的效果最好［8-9］。該試驗選擇龍膽苦苷提取率和獐牙菜苦苷提取率作為2個不同響應值，通過優(yōu)化料液比、提取時間、超聲功率3個單一因素以獲得總體滿意度值，旨為找到適合的優(yōu)化提取工藝條件。滿意度函數如下：

Di（Yi）=0Yi（x）≤Yimin

Yi（x）-YiminYimax-YiminYimin<Yi（x）≤Yimax

1Yi（x）>Yimax

D=d1w1×d2w2×d3w3×…×diwi

式中：Di（Yi）為總體滿意度；Yi（x）為響應值；Yimin為最小響應值；Yimax為最大響應值。wi表示各響應值權重，各響應值權重之和為1，即w1＋w2＋…+wi=1［10］，該研究中只涉及2個因素，故只有2個權重，即w1（龍膽苦苷權重）和w2（獐牙菜苦苷權重），由于這2個成分均為藥材中的主要活性成分，故設定w1、w2均為0.5。

1.6 響應面分析

以單因素試驗結果為依據，結合Box-Behnken法，設定料液比（A）、提取時間（B）、超聲頻率（C）3個影響因素，利用響應面軟件對龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取條件進行優(yōu)化，得到二者的提取率，將二者提取率利用滿意度函數轉化為共提取總體滿意度，再以總體滿意度為響應值，分析數據結果，得到共提取最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 色譜峰的建立

供試品與對照品溶液分別按照“1.3.2”色譜條件進樣，測定結果如圖1所示，HPLC圖基線平穩(wěn)，樣品中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷與其他峰分離情況較好，保留時間分別為16.168、14.889 min，與對照品的保留時間（16.096和14.843 min）分別僅相差0.072和0.046 min。

2.2 標準曲線繪制

2.2.1 龍膽苦苷標準曲線。從龍膽苦苷標準曲線（圖2）可以看出，龍膽苦苷濃度為0.13 ～1.46 mg/mL時線性關系良好，回歸方程為y=1 322 116.81x+7 114.05（R2=0.999 8）。

2.2.2 獐牙菜苦苷標準曲線。

從獐牙菜苦苷標準曲線（圖3）可以看出，獐牙菜苦苷濃度為0.26 ～2.88 mg/mL時線性關系良好，回歸方程為y=642 755x+9 181.8（R2=0.999 2）。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取時間對龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響。

設定料液比1∶10（g∶mL）、超聲頻率100 kHz，考察不同提取時間（5、10、15、20、25、30 min）對秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。從圖4a可以看出，提取時間25 min之前龍膽苦苷和獐芽菜苦苷的提取率升高明顯，隨后提取率略有下降，可能是25 min左右時藥材內外活性成分濃度達到平衡，隨著時間延長活性成分被破壞或者發(fā)生了變化，故選擇25 min為最佳提取時間。

2.3.2 料液比對龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響。

固定超聲頻率100 kHz、提取時間25 min，考察不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）對秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐芽菜苦苷提取率的影響。從圖4b可以看出，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率隨著溶液體積的增加也逐漸增高，1∶20的料液比后提取率增加不太明顯，可能此料液比時龍膽苦苷和獐牙菜苦苷被溶解完全，故選擇1∶20作為最佳料液比。

2.3.3 超聲頻率對龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響。

在料液比1∶20、提取時間25 min條件下，考察不同超聲頻率（50、60、70、80、90、100 kHz）對秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷提取率的影響。從圖4c可以看出，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率與超聲頻率呈相關性，隨著超聲頻率的增加而增大， 提取率在70 kHz時達到峰值，而后下降，超聲頻率太高，可能有效成分被破壞，故最佳超聲頻率選擇70 kHz。

2.4 響應面-滿意度函數優(yōu)化分析

根據上述單因素試驗的結果，以響應面軟件對共提取工藝條件進行優(yōu)化。以料液比（A）、提取時間（B）、超聲頻率（C）為自變量，以總體滿意度（D）為響應值，試驗設計方案與結果見表1。

利用Design-Expert 8.0.5 b軟件對秦嶺龍膽中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷共提取工藝優(yōu)化條件進行分析，以2種成分的提取率總體滿意度（D）為響應值，得到二次多項回歸方程為

D=-12.897 71+0.691 08A+0.297 88B+0.050 56C+6.07×10-4AB+1.78×10-5AC - 1.71×10-4BC-0.013 59A2-7.048 90×10-3B2-3.770 76×10-3C2

對滿意度進行回歸方差分析，結果表明（表2），模型及失擬項的P值分別為0.000 4和0.267 1，說明模型顯著而失擬項不顯著，模型擬合度高，得到的二次回歸方程預測性較佳。此外，從表3中可直觀看出，各影響因素一次項P值均小于0.05，說明各因素對秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率影響均顯著。各交互項的P值均大于0.05，說明各因素之間互相沒有影響。

調整確定系數R2adj=0.907 9，表明90.79%的響應值可用該模型解釋。從一次項P值結合F值來看，各因素影響滿意度的次序為C>A>B。

從3個影響因素兩兩交互作用的響應面與等高線圖（圖5）可以看出，各因素的最佳范圍分別為提取時間（A）24～28 min、料液比（B）1∶19～1∶23、超聲頻率（C）55～70 kHz。等高線圖顯示，C的曲面較A和B曲面陡峭，而A的曲面較B陡峭，說明C對提取率的影響強于A，而A強于B［11］，此分析與表3結果吻合。

通過Design-Expert 8.0.5 b軟件對試驗結果進行分析，得到最優(yōu)工藝為提取時間25.77 min、料液比1∶21.32、超聲頻率57.53 kHz，在此工藝下，龍膽苦苷和獐牙菜苦苷的提取率分別為0.326%、0.270%，總體滿意度為0.847 6。為了試驗的可操作性，修正秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取條件為提取時間26 min、料液比1∶21、超聲頻率58 kHz，經過3次重復性試驗，得到此工藝下龍膽苦苷和獐牙菜苦苷平均提取率分別為0.312%和0.258%，比預測值分別相差0.014百分點、0.012百分點，總體滿意度為0.810 6，與預測者僅相差0.037。各試驗值與模擬值接近，表明該模型擬合度較高，可用于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取預測。

3 結論

超聲提取法是利用超聲波的空化作用，將植物中的化學成分快速提取出來的方法，相比較傳統(tǒng)的提取方法其具有提取溫度低、時間短、提取效率高等特點，目前常用于中藥材的提取［12］。甲醇作為一種親脂親水性溶劑，可將植物中絕大多數活性成分提取出來，常作為提取溶劑使用。龍膽苦苷和獐牙菜苦苷為秦嶺龍膽中的活性成分，其藥理活性已得到證實，如具有治療肝臟疾病、代謝、抗炎鎮(zhèn)痛等方面作用，在臨床上應用也較為廣泛［13］。查閱文獻發(fā)現，對于藥材中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷的提取都是將其中一種成分進行提取，少有同時將2種成分同時提取出來，且提取率也不是特別高。因此，該研究以秦嶺龍膽作為研究對象，以甲醇作為提取溶劑，采用超聲輔助提取法，考察提取時間、料液比、超聲頻率對秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取的影響，并采用響應面-滿意度函數對提取工藝進行

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優(yōu)化，得到的最優(yōu)工藝條件為提取時間26 min、料液比1∶21（g∶mL）、超聲頻率58 kHz，在此條件下龍膽苦苷、獐牙菜苦苷的提取率分別為0.312%、0.258%，分別與預測值（0.326%、0.270%）接近。表明響應面-滿意度函數可用于秦嶺龍膽中龍膽苦苷和獐牙菜苦苷共提取工藝的優(yōu)化，該方法快速、簡單、穩(wěn)定可行。該研究結果可為其他中藥中化學成分的共提取工藝研究提供參考依據。

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