羅丹明B在3種作物中傳導能力研究

摘要 研究羅丹明B熒光示蹤劑在大豆、玉米、煙草幼苗上的傳導能力。結果表明經水培處理的植株幼苗地上部均能檢測到羅丹明B，其中大豆幼苗真葉部含量較高，玉米幼苗葉鞘中含量高于葉，煙草幼苗莖中含量高于葉。經羅丹明B處理后的植株鮮重與未處理之間無顯著差異。同時以煙草幼苗作為模式作物，借助活體成像技術發現葉片和莖分別經質量濃度為15 mg/L和30 mg/L羅丹明B處理后的熒光強度最高。

關鍵詞 羅丹明B；植物傳導；活體熒光成像

中圖分類號 S 45 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）23-0140-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.029

Study on the Conductivity of Rhodamine B in Three Plants

WEI Hong， LI Meng， WANG Zhen et al

（College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agriculture University， Hohhot， Inner Mongolia 010019）

Abstract In this work， the Rhodamine B was selected as fluorescent tracer to investigate its conductivity on soybean， maize and tobacco seedlings. The results suggested that Rhodamine B could be detected in the aboveground parts of hydroponic treated plant seedlings， therein， soybean seedlings had the highest content in part of true leaves， the leaf sheath of maize seedlings had a higher content compared with leaves， and tobacco seedlings had a higher content in the stem than leaves. There was no significant difference in fresh weight between Rhodamine B treated plants and untreated plants. And choosing tobacco seedlings as the model crop， the fluorescence intensity was dedected by in vivo imaging system. The results showed that the fluorescence intensity was the highest in leaves and stems with treat concentrations of 15 mg/L and 30 mg/L， respectively.

Key words Rhodamine B;Plant transmission;In vivo fluorescence imaging

基金項目 內蒙古自治區自然科學基金項目（2022MS03030）；內蒙古農業大學青年教師科研能力提升專項（BR220130）；內蒙古農業大學園藝與植物保護學院中青年教師科研能力提升專項（BR230101）。

作者簡介 魏宏（1998—），女，內蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：資源利用與植物保護。

*通信作者：王振，講師，博士，從事綠色農藥制劑研發；趙明敏，教授，博士，從事植物病毒學研究。

收稿日期 2024-02-12；修回日期 2024-03-19

雜草通過與作物競爭陽光、水分、空氣、營養物質等資源的方式，極大地影響了作物的生長，如何減輕雜草危害是當前農業生產中面臨的重要問題。精準的除草技術，可以減少化學藥劑使用［1］，符合綠色植保的發展需求，有利于我國農業可持續發展。

快速準確識別雜草，是農田雜草精確管理的基礎。隨著計算機技術、網絡技術以及視覺技術的發展，快速精準的機器視覺技術在雜草識別上的應用越來越廣泛，該技術顯著提高了除草機械的作業能力，為精準除草提供了技術保證［2］。基于機器視覺技術的雜草識別技術是通過深度學習以及構建作物和雜草顏色、紋理、形態等特征數據庫的方式，實現雜草有效識別［3-4］。該技術在傳統圖像處理的基礎上，通過結合 MATLAB 圖像處理技術［5］、視覺注意模型［6］、圖像處理多算法融合［7］以及高度特征與單目圖像特征融合的 SVM 識別模型［8］等方式極大地提高了識別雜草的能力。

然而在實際應用中，自然環境變化會影響圖像采集質量；部分雜草與作物形態相似，加大了自動識別的難度；并且雜草的形態特征隨生長周期變化較大，增加了機器學習的工作量，不利于實踐操作；此外，一些識別模式對硬件資源要求較高［9］，難以推廣應用。

作物植株信號技術是一種本質為熒光示蹤技術的新型機器-植物互作技術，該技術通過對標記熒光示蹤劑的作物進行靶向識別，從而區分作物與雜草［10-11］。與基于計算機學習算法的視覺技術相比，作物植株信號技術具有操作簡便、識別準確的優點。

隨著現代生物學技術的發展，新型熒光標記物質被不斷發現，各種先進熒光檢測技術和儀器被發明應用，熒光標記技術作為一種非放射性的標記技術開始受到重視和發展并在生物學、工業［12］、醫藥研究［13］、環境勘探［14］等領域廣泛應用。

示蹤劑的熒光特性及其在作物體內的傳導能力是影響熒光示蹤效果的關鍵因素［13］。羅丹明染料是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸染料，其中，羅丹明B（Rh-B）因其光穩定性強、熒光產量高、波長范圍寬、pH敏感性低、細胞膜滲透性良好以及對細胞無毒副作用等優點，常被用作植物活體細胞熒光示蹤劑［15-16］。

該試驗選取Rh-B作為示蹤劑，研究大豆、玉米和煙草根系對其吸收及其在作物內向上傳導能力，以期開發一種新型精準識別雜草的技術。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品和儀器。乙腈（色譜純）購于默克公司；甲酸（色譜純，≥98%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Rh-B標準品（HPLC 級，＞99%）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；霍格蘭氏營養液購于青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

高效液相色譜儀（安捷倫1260 Infinity II）；立體式熒光顯微鏡（LEICA M205 FA）；植物活體成像系統（IVScope 7200）。

1.1.2 供試作物和基質。

大豆（合豐55）由黑龍江省農業科學院合江農業科學研究所提供；玉米（先玉335）購于鐵嶺先鋒種子研究有限公司；本氏煙為內蒙古農業大學植物病毒實驗室自留；基質購自內蒙古蒙肥生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 作物幼苗培養。在直徑 15 cm的花盆中加入基質播種大豆、玉米和煙草，并分別培養至大豆真葉完全舒展、玉米第1片葉與葉鞘垂直、煙草八葉期。

向霍格蘭氏營養液中加入Rh-B，配制成質量濃度為60 mg/L的水培溶液，將上述作物根部洗凈后放入含200 mL水培溶液的塑料杯中，以等量不含Rh-B的霍格蘭氏營養液作為對照，將所有植株放置在25 ℃，光照/黑暗16 h/8 h 條件下培養4 d，每個處理重復4次。

1.2.2 Rh-B在作物上的熒光檢測。將“1.2.1”中培養4 d后的大豆幼苗分為三葉、真葉、上胚軸、子葉、下胚軸、根6個部位，玉米分為根、葉鞘和葉3個部位，煙草分為根、莖、葉3個部位，利用立體式熒光顯微鏡 RFP 模塊（激發波長541～551 nm，檢測波長590 nm）檢測上述部位。

1.2.3 Rh-B在作物不同部位的含量測定。

1.2.3.1 樣品處理。分別稱取按“1.2.1”方法處理的大豆幼苗三葉、真葉、上胚軸、子葉、下胚軸、根各0.5 g，玉米幼苗根、葉鞘和葉各0.5 g，煙草幼苗根、莖、葉各0.1 g，研磨后加入4 mL乙腈，超聲提取40 min，浸提1 d后濃縮至1 mL，利用高效液相色譜儀測定Rh-B在大豆、玉米和煙草不同部位的含量，按照文獻［16-17］的方法計算根濃度因子（RCF）和轉運因子（TF）。

色譜條件：色譜柱為 Shim-pack GIST C18-AQ（5 μm，250 mm×4.6 mm），柱溫35 ℃，流動相為乙腈∶0.1%甲酸水溶液=80∶20（V/V），流速T0ADHVzge/gaIokt1ovawQ==1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長560 nm。

1.2.3.2 標準溶液配制及標準曲線的繪制。準確稱取Rh-B 5.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，得到質量濃度500 mg/L Rh-B標準品溶液，隨后用乙腈逐級稀釋成0.411 5～300.000 0 mg/L的系列標準溶液，在“1.2.3.1”中的色譜條件下測定各標準溶液的吸收峰面積，繪制標準曲線。

1.2.3.3

添加回收率試驗。在大豆、玉米、煙草各部位空白樣品中分別添加質量濃度為100.000 0、33.333 3、11.111 1 mg/L Rh-B標準溶液，每組重復3次，按“1.2.3.1”方法進行樣品前處理及分析，計算添加回收率及相對標準偏差。

1.2.4 Rh-B對大豆、玉米、煙草生長的影響。稱量“1.2.1”處理的大豆幼苗三葉、真葉、上胚軸、子葉、下胚軸、根，玉米幼苗根、葉鞘和葉，煙草根、莖、葉各部位的鮮重，研究該質量濃度Rh-B對這3種作物生長的影響。

1.2.5

Rh-B在煙草地上部的活體熒光成像研究。取煙草八葉期幼苗，洗凈后分別放入含 3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 mg/L Rh-B的霍格蘭氏營養液中，以等量不含Rh-B的霍格蘭氏營養液為對照。上述幼苗在25 ℃環境下培養4 d后，清洗植株表面，利用活體成像系統檢測Rh-B在煙草幼苗地上部的熒光強度。

1.2.6 數據處理。利用SPSS 20.0（α=0.05）進行單因素方差分析，利用Origin 2022進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 HPLC分析方法驗證

根據“1.2.3.2”所繪標準曲線表明Rh-B質量濃度在0.411 5～300.000 0 mg/L與對應響應值呈良好的線性關系（圖1），線性方程為y=1.062 5x-1.596 2，其線性方程決定系數（R2）為 0.999 6。平均回收率在 81%～109%，相對標準偏差為 0.28%，表明該方法符合分析要求。

2.2 Rh-B在植株不同部位的熒光檢測

2.2.1

Rh-B在大豆幼苗不同部位的分布。通過高效液相色譜法測定大豆幼苗中Rh-B含量，其分布比例如圖2A所示，Rh-B在根部含量最高，其次是真葉、下胚軸、上胚軸、子葉、三葉。通過立體式熒光顯微鏡觀察發現，霍格蘭氏營養液對照處理組中的大豆植株各部位未檢測出熒光，經Rh-B處理的大豆幼苗各部位均呈現熒光且上胚軸和下胚軸熒光呈現清晰，同時，三葉和真葉葉脈中熒光強度較高，真葉較為明顯，子葉內呈現熒光不明顯（圖3）。

2.2.2 Rh-B在玉米幼苗不同部位的分布。

玉米幼苗中的Rh-B含量分布如圖2B所示，Rh-B主要分布在根部，葉鞘、葉中含量較少，且玉米葉鞘含量略高于玉米葉。由圖4可知，經霍格蘭氏營養液處理后的玉米幼苗葉、葉鞘，在立體式熒光顯微鏡RFP檢測條件下均未出現熒光，經Rh-B處理的玉米幼苗葉鞘和葉均能檢測到熒光，但葉熒光較弱，該結果與其含量測定趨勢一致。

2.2.3 Rh-B在煙草幼苗不同部位的分布。

通過液相色譜法檢測發現Rh-B在煙草幼苗根部分布較多，剩余依次分布于莖、葉（圖2C）。與對照處理的煙草幼苗未呈現熒光不同，經Rh-B處理的煙草葉、莖均呈現明顯熒光，且莖熒光強于葉，此外，其中葉熒光主要集中在葉脈處（圖5），這與液相色譜檢測結果一致。

2.3 Rh-B在3種作物中的傳導

2.3.1 作物根系對Rh-B的吸收能力。

RCF為根濃度因子，RCF>1表示此化合物易被根部吸收。計算得到大豆、玉米、煙草的RCF值分別為6.664 0、4.328 4、1.165 0，說明Rh-B易被這3種作物根系吸收，其中大豆根系吸收Rh-B能力最強，煙草最弱。

2.3.2 Rh-B在作物中的傳導能力。

TF為轉運因子，TF>1表示該化合物易從根部向上傳導。計算得出大豆、玉米、煙草的TF值分別為0.032 0、0.008 3、0.171 9，說明Rh-B在這3種植物中的向上傳導能力較弱。相對而言，Rh-B在煙草幼苗中向上傳導能力強于大豆和玉米，在雙子葉植物煙草、大豆中的向上傳導能力優于單子葉植物玉米。

2.4 Rh-B對作物幼苗生長的影響

由圖6可知，經質量濃

度為60.00 mg/L Rh-B處理4 d后，大豆、玉米、煙草幼苗各部位

的鮮重與對照均無顯著差異，表明該濃度下Rh-B對大豆、

玉米、煙草植株的生長無明顯影響。

2.5 Rh-B在煙草中的活體成像

2.5.1 活體熒光成像系統檢測。

在植物活體熒光成像系統中觀察煙草植株，經霍格蘭氏營養液為對照處理的煙草未呈現熒光，經 Rh-B 處理的煙草呈現熒光。煙草整株的熒光成像結果表明，Rh-B 主要分布在莖部和根部（圖7A），尤其是根莖結合部。將處理植株分割后進行檢測，根部上端熒光響應強度較高，莖部下端熒光響應強度較高，表明根系吸收 Rh-B 后，有向上轉移的趨勢，另外葉片的熒光主要呈現在葉柄處，且葉片背面熒光響應值高于葉片正面（圖7B）。

以莖部熒光強度值為1，其余部位與莖部熒光強度值比值為縱坐標作圖（圖8），數據顯示經 Rh-B 處理的煙草植株在地上部的熒光強度值高于地下部。

2.5.2 不同濃度Rh-B 在煙草幼苗中的活體成像研究。

如圖9所示，經質量濃度為3.75 mg/L的 Rh-B 處理后的煙草葉片背面（圖9A）和正面（圖9B）在該熒光閾值下均無熒光響應，而當 Rh-B 質量濃度在 7.50～60.00 mg/L 時，葉片正面和背面的熒光強度均呈現先上升后下降的趨勢，其中，當 Rh-B 質量濃度為 15.00 mg/L 時熒光強度值達到最高（圖9D）。煙草莖在質量濃度為3.75～60.00 mg/L時存在熒光響應（圖9C），在質量濃度為3.75～30.00 mg/L時，熒光強度值隨濃度升高而升高，當質量濃度達30.00 mg/L時達到最大，之后有所下降（圖9D）。

3 結論與討論

該試驗結果表明Rh-B在水培條件下可以被大豆、玉米和煙草根部吸收，并通過木質部向上傳導，同時，Rh-B在雙子葉的大豆、煙草中向上傳導能力優于單子葉的玉米。通過借助植物活體熒光成像系統檢測在經不同質量濃度Rh-B處理后的煙草幼苗地上部熒光強度值發現，煙草幼苗地上部經質量濃度為15～30 mg/L的 Rh-B 處理后熒光強度值較高。

目前已有研究表明豆類可以吸收Rh-B并傳導到地上部［18］，因此可以通過進一步研究Rh-B對處理作物種子的方式或其在作物地上部之間的傳導機理，實現精準區分作物與雜草的目標，為農田智慧除草提供新思路。

隨著現代科學技術的發展，熒光標記技術被應用于越來越多的領域［18，13］。熒光標記技術與作物信號傳導技術［19］、自動除草機器［20］結合，有望開發出一種新型自動化除草技術對作物和雜草進行精確識別，在現代農業雜草精確管理方面具有潛在應用價值。

參考文獻

［1］ 鄧向武，齊龍，馬旭，等.基于多特征融合和深度置信網絡的稻田苗期雜草識別［J］.農業工程學報，2018，34（14）：165-172.

［2］ 何朝霞，朱嶸濤，徐俊英.基于生成對抗網絡的田間雜草圖像超分辨率重建［J］.中國農機化學報，2023，44（9）：154-160.

［3］ WESTWOOD J H，CHARUDATTAN R，DUKE S O，et al.Weed management in 2050：Perspectives on the future of weed science［J］.Weed science，2018，66（3）：275-285.

［4］ 王子曼，楊學全.基于深度學習的多特征融合雜草識別仿真［J］.計算機仿真，2023，40（8）：206-210.

［5］ 王佳玉，劉立群，常琴，等.基于農業圖像處理的雜草分割［J］.電腦知識與技術，2021，17（17）：17-20.

［6］ 吳蘭蘭，徐愷，熊利榮.基于視覺注意模型的苗期油菜田間雜草檢測［J］.華中農業大學學報，2018，37（2）：96-102.

［7］ 苗中華，余孝有，徐美紅，等.基于圖像處理多算法融合的雜草檢測方法及試驗［J］.智慧農業，2020，2（4）：103-115.

［8］ 胡煉，劉海龍，何杰，等.智能除草機器人研究現狀與展望［J］.華南農業大學學報，2023，44（1）：34-42.

［9］ 付豪，趙學觀，翟長遠，等.基于深度學習的雜草識別方法研究進展［J］.中國農機化學報，2023，44（5）：198-207.

［10］ SU W H，SHENG J，HUANG Q Y.Development of a three-dimensional plant localization technique for automatic differentiation of soybean from intra-row weeds［J］.Agriculture，2022，12（2）：1-16.

［11］ SU W H，SLAUGHTER D C，FENNIMORE S A.Non-destructive evaluation of photostability of crop signaling compounds and dose effects on celery vigor for precision plant identification using computer vision［J］.Computers and electronics in agriculture，2020，168：1-8.

［12］ 黃曉紅.一種新型熒光示蹤劑的研究與應用［J］.內蒙古石油化工，2020，46（3）：37-38，48.

［13］ 王懿佳，張自剛，宋金星.羅丹明B標記聚丙烯酸酯的制備及其在織物整理中的應用［J］.印染助劑，2021，38（10）：23-27.

［14］ 黃月，海源，張浩瀾，等.熒光示蹤技術在果實同化物卸載運輸中的研究進展［J］.寧夏農林科技，2021，62（3）：66-69.

［15］ 章英才，黃月，海源，等.棗果實維管組織中熒光示蹤劑引入方法的應用［J］.生物技術通報，2021，37（6）：295-304.

［16］ 劉婷婷，劉尚可，李北興，等.農藥在植物中的內吸和傳導行為與施藥技術研究進展［J］.農藥學學報，2021，23（4）：607-616.

［17］ SU W H，FENNIMORE S A，SLAUGHTER D C.Fluorescence imaging for rapid monitoring of translocation behaviour of systemic markers in snap beans for automated crop/weed discrimination［J］.Biosystems engineering，2019，186：156-167.

［18］ 石曉博，聯翩，黃成，等.油田用納米熒光類示蹤劑發展現狀及前景［J］.精細與專用化學品，2021，29（2）：12-15.

［19］ 李海蕓，林紀輝，方智毅，等.一種用于農田除草的智能機器人設計［J］.閩江學院學報，2021，42（2）：31-37.

［20］ 魏純，李明，龍嘉川.自動除草機目標識別方法研究：基于神經網絡聚類算法［J］.農機化研究，2022，44（12）：60-63，134.