紫薇種子無菌萌發與快繁技術研究

摘要 以花瓣深粉紅色的紫薇品種“彩霞滿天”（Lagerstroemia indica ‘Caixia Mantian’）的自然結實種子為試驗材料，建立種子無菌萌發體系，以試管苗探索基本培養基類型、植物生長調節劑種類及濃度對不定芽增殖和根系誘導的影響，篩選出無菌苗“一步法”增殖、生根培養基。結果表明：紫薇種子無菌萌發最佳消毒方案為先用75%乙醇消毒2 min后，用2.5% NaClO消毒5 min；相同滅菌方案下接種于WPM培養基的紫薇較接種于MS的紫薇褐化率總體偏少，且較接種于1/2MS和MS中無菌萌發苗的莖粗壯且葉色濃綠；篩選出紫薇“一步法”增殖、生根最佳培養基為WPM+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L，試管苗葉色濃綠，增殖系數達到3.09，平均芽長為5.21 cm，平均生根率達75.00%，單株平均生根數為2.78。

關鍵詞 紫薇；無菌萌發；離體培養；繼代增殖

中圖分類號 S 722 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）23-0118-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.025

Study on Aseptic Germination and Rapid Propagation of Lagerstroemia indica Seeds

YAN Na， WANG Chun-yan， HUA Yu-xin et al

（Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210038）

Abstract In this study， the naturally fertile seeds of Lagerstroemia indica ‘Caixia Mantian’ with dark pink petals were used as test material to establish the seed aseptic germination system， the effects of basic medium type， plant growth regulator type and concentration on adventitious bud proliferation and root induction were explored with test-tube seedlings， and the one-step breeding and rooting medium of bacteria-free seedlings was screened. The results showed that the optimal disinfection scheme for the seed germ-free germination of Lagerstroemia was： disinfection with 75% alcohol for 2 min， then disinfection with 2.5% NaClO for 5 min;the browning rate of L. indica inoculated in WPM medium was lower than that inoculated in MS， and the stems were thicker and the leaves were darker green than those inoculated in 1/2MS and MS. The optimal medium for one-step proliferation and rooting was WPM+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L;the leaf color of the test tube seedlings was dark green， the proliferation coefficient reached 3.09， the average bud length was 5.21 cm， the average rooting rate was 75%， and the average rooting number per plant was 2.78.

Key words Lagerstroemia indica;Aseptic germination;Culture in vitro;Proliferation

基金項目 2021年南京市綠化園林局科技項目（YLKJ202111JH）。

作者簡介 閆娜（1981—），女，安徽利辛人，副教授，碩士，從事植物與植物生理教學與研究。*通信作者，教授，碩士，從事園林植物與觀賞園藝研究。

收稿日期 2024-01-05

紫薇（Lagerstroemia indica L.），千屈菜科（Lythraceae）紫薇屬（Lagerstroemia）落葉灌木或小喬木［1］。我國是紫薇屬植物種質資源的世界分布中心和栽培起源中心，有1 600余年的栽培歷史［2］。紫薇花姿優美、花色艷麗、花期長達100 d，觸碰樹干則上部枝條會隨之震顫，因此又有百日紅、癢癢樹等別稱；適宜生長的溫度范圍較大，被廣泛應用于園林綠化中［3］。紫薇的根、葉、皮還可入藥，具有清熱解毒、活血止血之效，種子還可制成農藥［4-5］；紫薇枝干光滑、柔軟，生長緩慢，可以經人工盤扎形成各種造型。因此，紫薇在我國乃至世界都被廣泛栽培和大量應用［6］。

紫薇傳統的繁殖方式主要有播種和扦插，但繁殖速度較慢，限制了其苗木產量和推廣應用［7-8］。采用植物組織培養技術可大幅縮短優良種質苗木的培育周期［9］，是快速繁殖植物優良品種脫毒苗的重要途徑，且不受季節限制，還可用于種質保存、體細胞無性變異和突變體篩選、次生代謝物的生產以及林木育種等［10］。前人對不同品種紫薇的組培快繁體系進行了大量研究。劉曉等［11］分別以矮首領紫薇的當年生半木質化帶腋芽莖段、硬枝莖段和葉片為外植體進行快繁技術研究，結果表明：莖段為較好的外植體。曹受金等［12］以無果紫薇帶芽嫩莖為外植體，得出最佳誘導培養基為MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+KT 0.5 mg/L，最佳增殖培養基為MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L，適合的生根培養基為1/2MS＋NAA 0.5 mg/L＋6-BA 0.1 mg/L。饒丹丹等［8］研究發現，“紫玉”紫薇帶腋芽莖段在改良的DKW+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.25 mg/L培養基上增殖芽健壯，在1/2MS+0.5 mg/L上獲得較好的生根效果。“紫精靈”紫薇適宜的初代培養基和增殖培養基分別為DKW+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L［5］。以矮生紫薇（L.indica cv.Petite Pinkie）種子進行無菌播種，在不含任何激素的培養基上的無菌萌發率明顯低于含有一定濃度激素培養基的；而以獲得的無菌苗進行增殖培養時，采用 6-BA 和 KT 2種激素搭配使用，增殖效果較好［13］。紅葉紫薇種子無菌萌發最佳萌發培養基為1/2MS，WPM對紅葉紫薇的生長萌發沒有明顯效果［14］。可見，在紫薇外植體選取、基本培養基以及激素種類和濃度配比方面表現出品種差異。

“彩霞滿天”紫薇分枝較多，花序也較多，花瓣紅色，花徑5.5 cm，屬于大花品種，可作為紫薇種質創新的材料［15］。目前對于該紫薇品種的組培快速繁殖研究報道較少。種子作為植物組培材料一般具有材料量大，易獲取，不傷害母株等優點，且無菌萌發可以解決其種子自然萌發率低的問題，易在短期內獲得無菌增殖材料［16-17］。筆者以紫薇 “彩霞滿天”（Lagerstroemia indica ‘Caixia Mantian’）品種的自然結實種子為試驗材料，建立種子無菌萌發體系，通過對無菌苗帶腋芽莖段誘導，篩選出無菌苗“一步法”增殖、生根培養基，以縮短紫薇組培快繁周期，以期為紫薇品種的離體快繁提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金陵科技學院校園內選擇生長健壯的紫薇“彩霞滿天”（Lagerstroemia indica ‘Caixia Mantian’）優良單株。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌方案的篩選。

2022年10月中旬采摘紫薇飽滿未開裂果實，在自來水下流水沖洗，然后將紫薇果實及經高壓滅菌后的組培空瓶、水、濾紙、解剖刀、鑷子和培養基等物品置于超凈工作臺上紫外線消毒殺菌20 min。用解剖刀和鑷子取出種子，無菌水沖洗1～2次，先用75%乙醇浸洗2 min，無菌水沖洗2～3次，再分別用2.5% NaClO 和5.0% NaClO消毒，消毒時間分別為1、3、5 min，消毒過程中使種子全部浸入溶液并不斷振蕩裝有種胚的組培瓶，無菌水沖洗3～5次，用無菌濾紙吸干種子表面水分。

1.2.2 種子無菌萌發。

初代培養過程中，把滅過菌的種胚分別接種到含有蔗糖20 g/L的MS、1/2MS和WPM的固體培養基上，每個處理90瓶，每瓶接種1粒種子，重復3次。然后將其轉入培養室進行培養，觀察記錄種子萌發生長情況，28 d后統計污染率、褐化率、無菌萌發率以及幼苗生長狀況。

污染率=污染外植體數/接種外植體總數×100%

褐化率=褐化的外植體/存活的外植體×100%

無菌萌發率=萌芽的外植體數/存活的外植體總數×100%［10，18］

1.2.3 無菌苗一步法增殖、生根培養基篩選。

采取基本培養基（A因素）和6-BA（B因素）2個因素，A設置3個水平，即A1（MS）、A2（1/2MS）和A3（WPM），B設置2個水平，即B1（1.0 mg/L）和B2（1.5 mg/L），進行雙因素隨機試驗，每個培養基分別添加0.05 mg/L IBA +蔗糖30 g/L+瓊脂6.3 g/L。將無菌萌發獲得的腋芽剪取約1.5 cm接種到以上培養基上，每處理30瓶，每瓶接種3個芽，重復3次。培養28 d，觀察其生長情況，統計增殖系數、苗高、葉長、葉寬、生根率及單株生根數。

增殖系數=統計時有效芽數/接種芽數［8，10］。

1.2.4 培養條件。

培養基pH調至6.7，置于121 ℃高壓滅菌20 min。培養容器為100 mL 塑料錐形組培瓶，接種后置于溫度為（23±2）℃，光照強度為3 000～4 000 lx，光照時間為16 h/d的培養室內培養。

1.3 數據統計

使用Microsoft Excel 2019對數據進行計算及圖表處理，用IBM SPSS 25.0 軟件對數據進行極差分析、方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌方案對外植體污染率、無菌萌發率及褐化率的影響

外植體滅菌是植物組織培養無菌系建立的關鍵環節［9］。將紫薇種子經不同滅菌方式處理后接入WPM培養基，結果見表1。通過雙因素方差分析發現，消毒時間對污染率有顯著作用（P＜0.05）。進一步分析簡單效應和事后多重比較可知，75%乙醇消毒2 min之后，2.5% NaClO和5.0% NaClO消毒不同時間對紫薇種子滅菌效果不同，但外植體污染率均隨著消毒時間的延長逐漸降低，說明消毒時間越長，滅菌效果越好。其中，75%乙醇消毒2 min之后，用2.5% NaClO消毒5 min和5.0% NaClO消毒5 min的處理污染率分別降至6.67%和7.04%，顯著低于其他處理（P＜0.05）。

NaClO濃度和消毒時間均對無菌萌發率有極顯著作用（P＜0.01）。在相同消毒劑處理下隨著消毒時間的延長無菌萌發率呈下降趨勢，說明隨著消毒時間的延長進一步加劇了對外植體的傷害。其中，75%乙醇消毒2 min之后，2.5% NaClO消毒1 min的平均無菌萌發率最高，極顯著高于其他各處理（P＜0.01）；5.0% NaClO處理整體較2.5% NaClO處理下的無菌萌發率下降幅度大，5.0% NaClO消毒5 min的無菌萌發率降至25.74%。

NaClO濃度和消毒時間均對褐化率的作用呈極顯著水平（P＜0.01）。相同滅菌方案下，褐化率隨消毒時間的延長整體呈下降趨勢。其中，75%乙醇消毒2 min之后，5.0% NaClO處理下隨著消毒時間的延長，褐化程度降低，消毒1 min處理下褐化率極顯著高于3 min和5 min處理（P＜0.01），平均褐化率由70.24%降至37.31%；2.5% NaClO處理下褐化程度整體較5.0% NaClO處理輕。經觀察，無菌接種后第8天開始陸續出現褐化現象，此后不再有新增褐化苗，且部分紫薇褐化后仍能繼續萌發，甚至其中少部分苗長勢良好（圖1）。相同滅菌方案下，發現接種于WPM培養基的紫薇較接種于MS的紫薇褐化率總體偏少。接種于1/2MS培養基的無菌萌發苗較為矮小，且葉色黃綠；MS培養基中子葉大而濃綠，第1真葉長勢較弱；WPM培養基中的無菌萌發苗長勢較好，莖粗壯且葉色濃綠（圖2）。

綜合考慮，用75%乙醇消毒2 min+2.5% NaClO消毒5 min是紫薇種子無菌萌發的最佳滅菌方案；紫薇種子無菌萌發的適宜基本培養基為WPM。

2.2 不同培養基對紫薇“一步法”快速繁殖的影響

將紫薇種子無菌萌發苗莖段接入增殖、生根培養基，結果見表2。雙因素方差分析結果表明，基本培養基（A因素）以及基本培養基（A因素）與6-BA濃度（B因素）的交互作用對增殖系數、芽長、生根率和單株生根數具有顯著影響（P＜0.05）；B因素對生根率亦影響顯著（P＜0.05）；A、B因素以及AB交互項對葉長和葉寬均無顯著影響（P＞0.05）。進一步分析簡單效應和事后多重比較，A3B2處理下增殖系數和芽長均顯著高于其他各處理（P＜0.05），因此A因素為主效應下各水平對增殖系數促進程度表現為WPM＞MS＞1/2MS；A3B2 和A1B1處理下生根率和單株生根數顯著高于其他處理（P＜0.05），生根率以A2B1處理最低，單株根數以A2B2處理最低。可見，A因素為主效應下各水平對生根率和單株生根數的促進程度表現為WPM＞MS＞1/2MS。因此，以WPM為基本培養基，添加1.5 mg/L 6-BA和0.05 mg/L IBA對紫薇“一步法”成苗效果最佳。

3 結論與討論

植物組織培養中的污染主要來源于外植體，因此，外植體滅菌是植物組培無菌系建立的關鍵環節之一，是組織培養取得成功的重要因素［9-10］。培育種子無菌苗作為外植體，可減少污染，提高組培的成功率［19］，也可解決其種子自然萌發率低的問題［17］。褐化問題在紫薇屬植物組織培養過程中比較突出，目前國內外鮮見較為系統的研究報道［9］。李芳菲等［20］研究發現，“紅火球”紫薇組培中易出現褐化現象，這主要由于植物體內含較多的酚類物質，且初代培養時外植體褐化嚴重，并指出能否克服褐化問題是其組培成功的關鍵因素。褐變一般與培養基的成分、激素種類與配比以及外植體滅菌等因素密切相關。呂銘等［14］研究認為，低質量濃度的無機鹽和合適的激素配比可以適當減輕材料的褐變程度，其中細胞分裂素BA或KT 能提高多酚氧化酶的活性。段麗君等［21］通過試驗得出，適宜的滅菌時間能顯著減少外植體的褐化和污染，從而有效提高外植體的存活率。筆者于10月中旬以紫薇飽滿未開裂果實中獲取的種子作為外植體，經不同滅菌方式處理后接入WPM培養基發現，經75%乙醇消毒2 min之后，用2.5%NaClO消毒5 min和用5.0% NaClO消毒5 min的污染率低，前種方案處理下的褐化率亦低于其他處理，而且較高的NaClO濃度導致無菌萌發率下降，前人在用升汞作為消毒劑也得到類似結果，即消毒時間越長，污染率越低，而死亡率和褐化率越高［19］。因此，紫薇種子無菌萌發最佳消毒方案為：先用75%乙醇消毒2 min之后，用2.5% NaClO消毒5 min，這與陳磊［7］以紫薇品種“彩霞滿天”為材料、莖段為外植體，最佳滅菌方案為多菌靈浸泡5 min、0.1%升汞浸泡6 min有所不同，說明同一品種外植體選取部位不同，最佳滅菌方案亦有差別。對于成熟的種子而言，無菌萌發培養基中往往不添加任何激素，在對紅葉紫薇［14］、麗江山慈姑［17］等植物種子無菌萌發研究中發現，最適宜萌發條件為不含激素的1/2MS培養基。該試驗發現，相同滅菌方案下接種于WPM培養基的紫薇較接種于MS的紫薇褐化率總體偏小，且較接種于1/2MS和MS中無菌萌發苗的莖粗壯且葉色濃綠。

植物組織培養快速繁殖是為了在最短時間內生產出最多的優質種苗，既要縮短培養周期，又要擴大種苗的繁殖系數［18］。培養基是組培外植體營養物質的來源，因此合適的培養基類型對植物組織培養至關重要［16］。陳磊［7］以紫薇品種“彩霞滿天”莖段為外植體進行組培試驗，結果表明最佳誘導培養基、增殖培養基和生根培養基分別為MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，MS+BA 1.0 mg/L +NAA 0.1 mg/L和1/2MS+NAA 0.5 mg/L；而以葉片為外植體的最佳誘導培養基為 MS+2，4-D 1.0 mg/L +BA 1.0 mg/L。Zhang等［3］以紫薇“彩霞滿天”種子為外植體獲得的無根苗莖段轉接到MS+4.44 μmol/L 6-BA+0.54 μmol/L α-NAA的增殖培養基上擴繁，并添加一定濃度秋水仙堿成功建立了體外誘導紫薇四倍體的方法。王闖等［13］以矮生紫薇（L.indica cv.Petite Pinkie）種子進行無菌播種，發現其試管苗適宜的誘導培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，適宜的快繁培養基為MS+6-BA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L +NAA 0.01～0.05 mg/L，適宜的生根培養基為 MS+NAA 0.5 mg/L。蔡能等［22］以“紫韻”紫薇帶腋芽的幼嫩莖段為外植體，發現適合的初代培養基為 DKW＋BA 1.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，而增殖培養及生根培養最佳配方分別為 WPM＋BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L和1/2 MS＋NAA 0.2 mg/L＋AC 300 mg/L。“一步法”快速繁殖是植物組織培養過程中利用優化的培養基及培養條件，將傳統的芽增殖和生根2個步驟合二為一，從而大大提高繁殖速率［14］。該試驗通過雙因素試驗設計，研究“一步法”對紫薇的增殖和生根效果，發現WPM+6-BA1.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L對紫薇的生長和生根效果最佳，葉色濃綠，增殖系數達到3.09，平均芽長為5.21 cm，平均生根率達75.00%，單株平均生根數為2.78。該研究得出的紫薇快速繁殖方法可為紫薇規模化生產，以及轉基因育種中將有用的候選基因轉移到紫薇品種中，從而改善其生長習性、栽培適應性以及觀賞特性提供參考。

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