嗜水氣單胞菌Hcp蛋白的原核表達?多克隆抗體制備及生物信息學分析

摘要 ［目的］獲得嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）Hcp蛋白的多克隆抗體（Polyclonal Antibody）及基本生物學特性。［方法］利用RT-PCR方法擴增Hcp基因，構建重組表達質粒后轉化BL21感受態細胞，經IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside）誘導表達獲得Hcp重組蛋白，純化后免疫家兔，制備針對該蛋白的多克隆抗體，進行抗體的效價測定、Western blotting鑒定，利用生物信息學在線工具對其基本理化性質、保守結構域、磷酸化位點、二級與三級結構進行預測。［結果］該蛋白在IPTG 終濃度為 0.6 mmol/L、37 ℃下誘導表達6 h可獲得最高表達量，蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在；Western blotting結果顯示，AH的培養物上清與沉淀均能夠與制備的兔抗發生特異性結合，具有良好的反應原性，制備的多克隆抗體效價達1.024×106。生物信息學分析表明，嗜水氣單胞菌Hcp蛋白的分子式為C846H1304N224O259S8，共編碼172個氨基酸，相對分子質量為19 013.49 u，等電點（PL）為5.24，屬于穩定蛋白；二級結構中無規則卷曲占比為 51.74%，延伸鏈占比為25.00%，α-螺旋占比為19.19%，β-轉角占比為4.07%。［結論］成功制備了Hcp蛋白的多克隆抗體，為進一步研究AH的VI 型分泌系統（Type VI secretion system，T6SS）提供技術支持。

關鍵詞 嗜水氣單胞菌；Hcp基因；原核表達；多克隆抗體制備；生物信息學

中圖分類號 S 94 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）23-0079-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.23.018

Prokaryotic Expression of Hcp Protein of Aeromonas hydrophila，Preparation of Polyclonal Antibody and Bioinformatics Analysis

XU Yi-lan1，XU Jia-le2，LU Bing-xia1 et al

（1.Guangxi Veterinary Research Institute/Key Laboratory of Veterinary Biotechnology of Guangxi，Nanning，Guangxi 530002;2.Animal Science and Technology College，Guangxi University，Nanning，Guangxi 530005）

Abstract ［Objective］In order to obtain a polyclonal antibody to the Hcp protein of Aeromonas hydrophila （AH） and its basic biological properties.［Method］The present study utilized RT-PCR to amplify the Hcp gene，constructed a recombinant expression plasmid and then transformed the BL21 receptor cells，which were induced to express the Hcp recombinant protein through IPTG （Isopropyl β-D-Thiogalactoside），purified and immunized fc1dca0e9a683cd4688b2a6868e22dd7rabbits，and then prepared a polyclonal antibody against the protein.Hcp recombinant protein was obtained by IPTG （Isopropyl β-D-Thiogalactoside） induced expression，purified and immunized rabbits，and polyclonal antibody against the protein was prepared，and the potency of the antibody was determined，identified by Western blotting，and its basic physicochemical properties，conserved structural domains，and phosphorylation sites were investigated using bioinformatics online tools，secondary and tertiary structure prediction.［Result］The results showed that the highest expression of the protein was obtained at the final concentration of IPTG of 0.6 mmol/L at 37 ℃ for 6 h，and the protein mainly existed in the form of soluble protein; the results of Western blotting showed that the supernatant and precipitate of the culture of AH were able to specifically bind to the prepared rabbit antibody with good reactivity，and the potency of the prepared polyclonal antibody reached 1.024×106.Bioinformatics analysis showed that the molecular formula of Aeromonas hydrophila Hcp protein was C846H1304N224O259S8，encoding a total of 172 amino acids，with a relative molecular mass of 19 013.49 u，an isoelectric point （pl） of 5.24，which is a stabilized protein; the secondary structure of the protein was 51.74% of the irregularly coiled，25.00% of the elongated chain，and 25.00% of the alpha-chain.25.00%，α-helix accounted for 19.19%，and β-turns accounted for 4.07%.［Conclusion］In this study，a polyclonal antibody to Hcp protein was successfully prepared，which can provide technical support for the further study of Type VI secretion system （T6SS） of AH.

Key words Aeromonas hydrophila;Hcp gene;Prokaryotic expression;Preparation of polyclonal antibody;Bioinformatics

基金項目 廣西重點研發計劃項目（桂科AB21076008，桂科AB20297059）；玉林市科學研究與技術開發計劃項目（玉市科20220519）。

作者簡介 許藝蘭（1996—），女，廣西北流人，研究實習員，碩士，從事動物病原學研究。*通信作者：陳忠偉，正高級獸醫師，從事動物病毒學研究；何穎，正高級獸醫師，博士，從事獸醫藥理學和動物傳染病學研究。

收稿日期 2024-01-15

嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）是革蘭氏陰性菌、弧菌科氣單胞菌屬，是一種普遍存在于各種水體、土壤中的條件性病原菌［1］，是構成養殖水環境中正常菌群種類之一，能夠引起魚類、動物和人的多種疾病［2］，如可誘發魚類感染敗血癥［3］，為國內外水產養殖業帶來巨大的經濟損失［4-5］。目前在水產養殖業中主要依靠抗生素抑制AH感染［6］，抗生素的濫用不僅會導致AH產生耐藥性，還對生態環境與食品安全質量產生影響［7］，引起食品質量安全問題和生態安全問題［8］。水產養殖中水生生物易受到AH的侵襲而產生疾病。蝦的個體較小，逐一進行治療不現實，而蝦群在水體中也難以治療。因此，控制該細菌在人群和水產養殖中的不斷暴發具有重要意義［9］。

AH的致病機制十分復雜，使宿主的疾病發生通常依靠分泌系統與毒力因子之間的相互作用。IV型分泌系統（type VI secretion system，T6SS）是AH的分泌系統之一［10］，由13個蛋白組成，負責將部分效應蛋白運傳遞到細胞外。溶血素共調節蛋白（hemolysin co-regulated protein，Hcp）是T6SS的蛋白質成分之一， Hcp蛋白可以形成一個類似管狀的六聚體，協助T6SS分泌毒力相關蛋白［11-12］。Hcp蛋白在T6SS系統中起著重要作用，既是其結構蛋白幫助形成注射裝置分泌蛋白，又是其效應蛋白可以分泌到胞外增強毒力［13］。筆者制備兔抗Hcp多克隆抗體，為深入開展Hcp的相關研究提供研究工具，還通過生物信息學軟件分析其基本理化性質、結構等，為后續致病機制探究提供理論信息。

1 材料與方法

1.1 菌株及載體 AH-SC-3株、pET-32a（+）載體由廣西獸醫生物技術重點實驗室保存并提供。DH5α、BL21（DE3） 感受態細胞購自上海昂羽生物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內切酶EcoRI和Xho I、T4 DNA Ligase購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；質粒小量提取試劑盒購自OMEGA公司；His標簽蛋白純化試劑盒、山羊抗兔IgG（H+L）HRP抗體購自康為生物技術有限公司；預染蛋白Marker購自GenStar公司。

1.3 引物的設計與合成

根據Hcp基因序列設計Hcp基因特異性引物，限制性酶切位點分別為EcoRI和Xho I。Hcp-F：5′—3′：CCGGAATTCATGCCAACTCCATGTTATAT； Hcp-R：5′—3′： CGGCTCGAGTTACGCCTCGATCGGAGCAC。

1.4 Hcp基因的擴增

以AH-SC-3的DNA為模板， Hcp-F/R為引物對進行PCR擴增，按照膠回收試劑盒操作說明對PCR產物進行膠回收。

1.5 原核表達質粒pET-32a-Hcp的構建

對目的基因Hcp的膠回收產物和pET-32a（+）載體進行雙酶切，再次膠回收，按照T4連接酶說明書對2個片段進行連接，將連接產物按照DH5α感受態細胞使用說明轉化至DH5α感受態細胞。次日將單菌落擴繁后按照質粒抽提試劑盒操作說明提取質粒。對獲得的質粒進行酶切鑒定并測序，命名為pET-32a-Hcp。

1.6 重組Hcp蛋白的誘導表達及表達條件的優化

按照說明書將pET-32a-Hcp轉化至BL21感受態細胞涂布于含氨芐抗性的LA平板，37 ℃恒溫培養箱培養12 h。挑取單菌落于37 ℃ 150 r/min培養6 h，取部分菌液進行PCR鑒定，對鑒定正確的陽性克隆進行增菌培養。達到對數生長期后通過加入不同劑量的IPTG和改變誘導時間來確定最佳誘導條件。收集菌液8 000 r/min 3 min棄上清，加入40 μL PBS重懸沉淀，并與10 μL×loading buffer混合，沸水浴10 min后進行SDS-PAGE電泳。

1.7 重組Hcp蛋白表達形式的鑒定及純化

將表達的菌液進行超聲裂解，裂解產物4 000 r/min 10 min分離上清和沉淀，將沉淀溶解于Inclusion Body Elutio Buffer。將40 μL的上清與沉淀溶解液與10 μL×loading buffer混合，沸水浴10 min后進行SDS-PAGE電泳。確定表達形式后進行大量誘導。根據純化試劑盒中的方法純化蛋白。

1.8 重組Hcp蛋白多克隆抗體的制備

按照表1所示的免疫程序，對家兔皮下進行多點注射。免疫結束后第7天進行心臟采血，收集血清（免疫前從兔耳緣靜脈采血，分離血清作為陰性對照）。

1.9 兔抗Hcp蛋白多克隆抗體效價的測定 測定方法參考文獻［14］。

1.10 兔抗Hcp蛋白多克隆抗體反應性的測定

收集27 ℃、150 r/min過夜培養的嗜水氣單胞培養物，分別以培養物上清與沉淀作為抗原，以1∶4 000稀釋的兔陽性血清和陰性血清為一抗，以1∶10 000稀釋的HRP山羊抗兔IgG（H+L）為二抗進行Western blotting，以判斷該抗體的反應性。

1.11 Hcp蛋白的生物信息學分析

使用在線生物信息學網站對Hcp蛋白的理化性質、結構等進行預測，具體為使用 ExPASy 數據庫的 ProtParam 和 ProtScale工具分析基本理化性質和親疏水性，使用 SignalP 5.0、TMHMIM 2.0 分別對蛋白質進行信號肽分析、跨膜結構域分析。使用NetPhos 3.1和 NCBI數據庫的 CD-search 工具尋找蛋白質磷酸化位點和保守結構域。使用 SPOMA和SWISS-MODEL分別預測蛋白質的二級結構和三級結構。

2 結果與分析

2.1 Hcp基因的擴增及原核表達載體的構建

凝膠電泳結果顯示，擴增結果得到519 bp目的片段（圖1A）。凝膠電泳結果顯示，對pET-32a-Hcp進行雙酶切，得到519 bp片段和5 900 bp片段，與預期相符（圖1B）。測序結果與參考序列的同源性為100%。

2.2 重組蛋白Hcp表達的條件優化

結果顯示，表達的目的蛋白大小為37 ku，與預期大小一致（圖2A、圖2B）。當誘導終濃度提高時，蛋白表達量提高（圖2A），而誘導時間延長時蛋白表達量無明顯提升（圖2B）。

2.3 重組蛋白Hcp表達形式的鑒定及純化

SDS凝膠電泳結果表明，重組蛋白Hcp在上清和沉淀中都存在（圖3），如圖3所示在上清中的表達量更高，純化后蛋白大小與預期結果一致。

2.4 兔抗AH-Hcp蛋白多克隆抗體反應性

Western-blot驗證結果顯示，AH的培養物上清及沉淀與陽性一抗、二抗發生結合，顯色后條帶大小約為19 ku，與預期結果一致（圖4A），與陰性一抗反應未出現預期條帶（圖4B）。

2.5 多克隆抗體效價的測定

經間接ELISA檢測結果計算，該研究制備的兔抗Hcp蛋白多克隆抗體血清平均效價為1.024×106（圖5）。

2.6 Hcp蛋白基本理化性質 Hcp 蛋白由172 個氨基酸組成，數量最多的氨基酸為纈氨酸（Val）、蘇氨酸（Thr），均占 8.7%。蛋白分子式為C846H1304N224O259S8，相對分子質量為19 013.49，理論等電點為 5.24。該蛋白攜帶的正電荷殘基總數為 138，負電荷殘基總數為 20。蛋白總平均親水性（GRAVY）為-0.273，屬于親水性蛋白，第117號氨基酸的疏水性最強，值為1.433，第55號氨基酸的親水性最強，值為-1.911。蛋白質脂肪系數為73.66，不穩定系數為 32.03，為穩定蛋白。使用 ProtScale 分析 Hcp蛋白的親疏水性，氨基酸分值<0 表明具有親水性，分值>0 表明具有疏水性。分析顯示，Hcp蛋白的大部分氨基酸位于親水性區域，是親水性蛋白，與蛋白質理化分析結果一致（圖6）。

2.7 Hcp蛋白的信號肽和跨膜結構域預測

SignalP 5.0分析（圖7）顯示，Hcp蛋白沒有信號裂解位點，推測Hcp蛋白不含信號肽，屬于非分泌蛋白。由TMHMM 2.0 預測（圖8）顯示，該蛋白在跨膜區（transmembrane）和膜內區（inside）的概率極低，在膜外區（outside）的概率接近于1，說明Hcp 蛋白無跨膜結構域，且整體位于膜外區。

2.8 Hcp蛋白的磷酸化位點和保守結構域

使用 NetPhos 3.1預測 Hcp 蛋白的磷酸化位點，當域值為 0.5 時，預測該蛋白共有 30個磷酸化位點（圖9），包括11個絲氨酸（Serine），15個蘇氨酸（Threonine）和4個酪氨酸（Tyrosine）。使用NCBI的CD-search 工具預測 Hcp 蛋白含有1個保守結構域（圖 10），屬于T6SS分泌系統中Hcp1家族，為外膜通道蛋白家族。

2.9 Hcp蛋白的二、三級結構

使用SPOMA軟件對Hcp 蛋白二級結構進行預測分析，該蛋白的構成主要是無規則卷曲（random coil） ，占51.74%，延伸鏈（extended strand）占25.00%，α-螺旋（alpha helix）占19.19%，β-轉角（beta turn）占4.07% （圖 11）。利用 SWISS-MODEL預測的三級結構模型（圖12），預測得到全局模型質量估計（global model quality estimation，GMQE）值為0.95，GMQE 值可以簡單評估預測模型的質量，其值越接近1，表明建模質量越好，表明預測結果可靠。

3 結論與討論

T6SS的內管由數百至數千個Hcp蛋白亞基組成六聚體［15］，形成一個管狀結構。該研究中Hcp 蛋白生物信息學分析表明，其由172 個氨基酸組成，蛋白分子式為C846H1304N224O259S8，相對分子質量為19 013.49 u，理論等電點為 5.24，屬于親水性蛋白，蛋白質脂肪系數為73.66，不穩定系數為 32.03，為穩定蛋白。Hcp蛋白沒有信號裂解位點，屬于非分泌蛋白，預測該蛋白共有 30個磷酸化位點，包括11個絲氨酸，15個蘇氨酸和4個酪氨酸，含有1個保守結構域。

對Hcp 蛋白二級結構進行預測分析，該蛋白的構成主要是無規則卷曲、延伸鏈、α-螺旋、β-轉角。Hcp作為效應蛋白的輸出載體和伴侶，可以通過這些成分的共價延伸或通過非共價相互作用附著。因此，Hcp 蛋白也可以作為T6SS功能正常產生作用的標志。Wang等［16-17］用Hcp蛋白免疫了鯉魚，與未接種的相比免疫了Hcp蛋白的鯉魚存活率增加7.14%。因此，該研究制備了Hcp蛋白多克隆抗體，以期待可以研究出針對AH的疫苗來對該細菌進行防控。

該研究使用pET-32a（+）系統表達重組蛋白［18］，這是目前應用最廣、最成熟的表達系統之一［19］。該質粒含有多個常用的酶切位點，便于不同基因克隆。此前有王楠楠等［17］ 根據嗜水氣單胞NJ-35株，利用pET-28a（+）表達載體構建重組質粒，表達重組pET-28a-Hcp蛋白，該蛋白大小為24 ku，免疫家兔后效價達1.28×104。該研究根據實驗室保存的AH基因組擴增了Hcp基因的完整序列，構建重組表達質粒pET-32a-Hcp。使用IPTG誘導Hcp基因在宿主菌E.coli BL21（DE3）中能夠大量穩定地表達。結果表明，重組蛋白Hcp同時在上清與沉淀中表達。由于可溶性表達的重組蛋白的生物學活性較高［20］，且上清中的表達量更高，故純化上清中重組Hcp蛋白作為免疫原對家兔進行了免疫。ELISA檢測結果顯示，抗體效價達到1.024×106，說明表達的Hcp蛋白具有良好的免疫原性。經Western blot方法測定，該多抗具有較好的反應性，為深入開展Hcp的相關研究提供研究工具。

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