半制備整體柱液相色譜法測(cè)定食品中泛酸的含量

摘 要：目的：建立半制備整體柱液相色譜法測(cè)定食品中泛酸含量的分析方法。方法：樣品中泛酸用熱水提取，以磷酸二氫鉀溶液和乙腈為流動(dòng)相，流速2 mL·min-1，進(jìn)樣量500 μL，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長

200 nm，經(jīng)Merck半制備整體柱凈化，在泛酸出峰處收集溶液，收集液經(jīng)反相C18柱定量分析。結(jié)果：泛酸濃度在0.001～0.032 μg·L-1具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.08 mg/100 g，泛酸在食品中測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～3.6%，加標(biāo)回收率均大于90%。結(jié)論：針對(duì)含有蛋白、肽、淀粉等復(fù)雜基質(zhì)的食品，本半制備整體柱液相色譜法的檢測(cè)一致性較好，分離度、精密度、準(zhǔn)確性等均符合要求。有效解決復(fù)雜基質(zhì)、雜質(zhì)干擾下目標(biāo)峰難分離、檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定、平行差的問題。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；泛酸；半制備整體柱

Determination of Pantothenic Acid in Food by Semi-Preparative"Monolithic Column Liquid Chromatography

CHEN Hanfeng， YANG Jing， LI Junwei， HOU Shaoping， LIU Chunli

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： Objective： To establish.an analytical method for the determination of pantothenic acid content in food using semi-preparative monolithic column liquid chromatography. Method： Pantothenic acid in the sample is extracted with hot water， using a solution of potassium dihydrogen phosphate and acetonitrile as the mobile phase，"with a flow rate of 2 mL·min-1， an injection volume of 500 μL， a column temperature of 30 ℃， and a detection wavelength"of 200 nm. The solution is purified on a Merck semi-preparative monolithic column， and the solution is collected at the elution peak of pantothenic acid. The collected liquid is then quantitatively analyzed on a reverse-phase C18 column. Result： Pantothenic acid exhibits good linearity within the concentration range of 0.001～0.032 μg·L-1，"with a correlation coefficient of 0.999 9. The limits of detection is 0.025 mg/100 g， and limits of quantification is"0.08 mg/100 g. The relative standard deviation of the pantothenic acid determination results in food is between 2.4% and 3.6%. The recovery rates of spiked samples are greater than 90%. Conclusion： For foods containing complex matrices such as proteins， peptides， and starch， this semi-preparative monolithic column liquid chromatography method demonstrates good consistency in detection， with separation， precision， and accuracy all meeting the necessary standards. It effectively addresses issues such as difficult peak separation， unstable detection results and poor parallelism under complex matrices and impurity interference.

Keywords： high performance liquid chromatography; pantothenic acid; semi-preparative monolithic column

泛酸又稱為維生素B5，是一種水溶性維生素，呈淺黃色，因廣泛存在于動(dòng)植物中而得名“泛酸”。其主要功效包括幫助能量代謝、維護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)健康、促進(jìn)傷口愈合、維護(hù)免疫系統(tǒng)健康和促進(jìn)頭發(fā)和皮膚健康。人體不能自行合成泛酸，必須從食物中獲取。如果缺乏泛酸，可能會(huì)引發(fā)疲勞、頭痛、失眠、焦慮、消化不良和皮膚病等癥狀[1-5]。

常用的泛酸含量檢測(cè)方法主要有微生物法，液相色譜法和熒光光度法，近年來液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法也逐漸被推廣使用[6-11]。最新頒布實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2023）第一法已從2016版的微生物法改為液相色譜法，但在實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)檢測(cè)含有蛋白、肽、淀粉等復(fù)雜基質(zhì)的樣品時(shí)，存在雜質(zhì)色譜峰干擾、測(cè)試結(jié)果平行性差、色譜柱損耗率高等問題[7-11]。而第二法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法存在儀器設(shè)備昂貴、運(yùn)營維護(hù)成本高、對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求高等問題。第三法微生物法是測(cè)定泛酸的經(jīng)典方法，成本低、經(jīng)濟(jì)實(shí)用，但操作復(fù)雜且費(fèi)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)化程度低、環(huán)境條件要求較高、受培養(yǎng)基質(zhì)量影響大[6]。

本研究擬以Merck公司Chromolith半制備整體柱凈化樣品溶液中未能完全去除的蛋白、肽、淀粉等雜質(zhì)[12]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中泛酸出峰的開始和結(jié)束時(shí)間設(shè)定餾分的收集時(shí)間，混合均勻的收集液再經(jīng)常規(guī)的C18色譜柱分離定量。Chromolith半制備柱采用獨(dú)特設(shè)計(jì)的整體化硅膠，其結(jié)構(gòu)包含網(wǎng)狀的孔徑大小為2 μm的大孔，以及空隙大小為

120 ?小孔。當(dāng)流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱時(shí)，樣品液中的較大分子如蛋白質(zhì)、肽類及淀粉等雜質(zhì)會(huì)迅速通過2 μm的大孔，而目標(biāo)物質(zhì)——小分子泛酸則在更大活性表面積的120 ?小孔中進(jìn)行高效液相分離。同時(shí)，整體柱大孔結(jié)構(gòu)具有極強(qiáng)抗污染能力，可在持續(xù)大體積進(jìn)樣的情況下保持較高的柱效；在高流速下柱反壓小，相同流速下壓力僅為普通色譜柱的1/4，在餾分收集過程中可以使用更高的流速進(jìn)行快速分離與凈化，有助于減少溶劑消耗和縮短凈化時(shí)間。經(jīng)過凈化后的樣品溶液只有較少的雜質(zhì)成分，根據(jù)GB 5009.210-2023第一法的色譜條件，泛酸峰與相鄰雜質(zhì)之間能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離效果。凈化后的樣品液不會(huì)對(duì)后續(xù)用于分離定量分析的色譜柱造成柱頭污染，從而顯著延長分析用色譜柱的使用壽命。綜上所述，Chromolith半制備整體柱提供了一種高效、快速且經(jīng)濟(jì)的樣品凈化方案，有助于提高泛酸測(cè)定的準(zhǔn)確性和效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品樣品A混合營養(yǎng)餐，樣品B代餐奶昔均購于商場(chǎng)；泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品；淀粉酶；磷酸二氫鉀、乙腈、三氟乙酸、磷酸（色譜純）；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鋅（分析純）；一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀帶紫外檢測(cè)器和大體積定量環(huán)（Waters公司）、WFCIII餾分收集器（Waters公司）、半制備整體柱（Chromolith SemiPrep RP-18e色譜柱，Merck公司）、分析用色譜柱（Eclipse XDB-C18色譜柱，Agilent公司）、3K15高速冷凍離心機(jī)（Sigma公司）、ST 3100 pH計(jì)（Thermo公司）、AR224CN電子天平（Mettler公司）和SW22恒溫振蕩水浴箱（Julaba公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品配制

參考《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2023）第一法3.4配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理

參考GB 5009.210—2023第一法5.2.2處理復(fù)雜基質(zhì)樣品，過濾上清液至2 mL樣品瓶中，放入帶有餾分收集器的液相色譜儀進(jìn)行泛酸的餾分收集。將泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的收集液、待測(cè)試樣的收集液分別混合均勻，轉(zhuǎn)移至2 mL液相用樣品瓶中進(jìn)行上機(jī)分析，測(cè)量峰面積并定量計(jì)算。

1.3.3 色譜條件

（1）餾分收集半制備色譜條件。色譜柱：Merck公司Chromolith SemiPrep RP-18e（10 mm×100 mm）；流速：2.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：500.0 μL；檢測(cè)波長：200 nm；流動(dòng)相：0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈按95∶5（V/V）混合；根據(jù)最大濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液中泛酸的出峰時(shí)間設(shè)定收集時(shí)間。出峰情況見圖1。

（2）分析用色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：50.0 μL；檢測(cè)波長：200 nm；流動(dòng)相：磷酸二氫鉀水溶液和乙腈按97∶3（V/V）混合。出峰情況見圖2。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

制備樣品B空白基質(zhì)樣品，按照1.3.2處理樣品，1.3.3色譜條件上機(jī)測(cè)定，泛酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的出峰時(shí)間為7.26 min（圖2），對(duì)比空白基質(zhì)樣品在此處無干擾峰（圖3）。

2.2 線性范圍

根據(jù)GB 5009.210—2016的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制方法，配制濃度在0.001～0.032 μg·L-1的6個(gè)濃度點(diǎn)的工作溶液，上機(jī)測(cè)試，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。曲線的線性回歸方程為Y=6.54×103X+112，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

2.3 檢出限和定量限

配制低濃度的試樣溶液，餾分收集后進(jìn)樣得到色譜峰，計(jì)算出待測(cè)組分的信噪比。當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，泛酸檢出限為 0.025 μg·mL-1；樣品稱樣量 5 g，定容 50 mL時(shí)，該方法的泛酸檢出限為0.025 mg/100 g。當(dāng)信噪比（S/N）為 10時(shí)，泛酸定量限為0.08 μg·mL-1；樣品稱樣量5 g，定容50 mL時(shí)，該方法的泛酸定量限為0.08 mg/100 g。

2.4 精密度

按照樣品處理方法和色譜條件，平行測(cè)定6份樣品，分別計(jì)算樣品中泛酸的含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。如表1所示，結(jié)果顯示2種樣品測(cè)定結(jié)果的RSD在2.4%～3.6%，滿足《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）中RSD小于7.5%的要求，該方法精密度良好[13]。

2.5 準(zhǔn)確度

稱取2.5 g樣品，選擇3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按照樣品處理方法和色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果如表2所示。泛酸平均加標(biāo)回收率在90.1%～109.7%，滿足GB/T 27417—2017中回收率在90%～110%的要求，該方法準(zhǔn)確度高。

3 結(jié)論

本文建立了餾分收集液相色譜測(cè)定食品中泛酸的方法，當(dāng)稱樣量為5 g定容于50 mL水時(shí)，方法的檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.08 mg/100 g；方法的線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～3.6%（n=6），加標(biāo)回收率均大于90%（n=9），精密度和準(zhǔn)確度均滿足GB/T 27417—2017中的要求。相對(duì)于GB 5009.210—2023第一法液相色譜法，本法有效排除了蛋白、肽、淀粉等基質(zhì)雜質(zhì)對(duì)泛酸定量檢測(cè)中目標(biāo)峰的干擾，方法重現(xiàn)性好、回收率高，可作為復(fù)雜基質(zhì)食品中泛酸含量檢測(cè)的優(yōu)選方法。

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