?模擬胃液環境下谷維素清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺的作用?

摘要：為降低人體內亞硝胺類化合物含量，采用模擬胃液結合液質聯用的方法研究谷維素清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺的作用。結果表明：在模擬胃液條件下，谷維素能有效清除亞硝酸鈉，且亞硝酸鈉的清除率與谷維素液添加量呈正相關關系；在膳食樣品中添加谷維素能有效降低N-亞硝基-N-乙基苯胺、N-亞硝基二乙基胺、N-亞硝基吡咯烷的含量，其阻斷率分別為100%、100%和24.4%。谷維素在模擬胃液條件下能通過降低亞硝酸鈉含量減少內源性亞硝胺合成的反應底物，從而阻斷亞硝胺的合成。

關鍵詞：谷維素；亞硝胺；亞硝酸鈉；模擬胃液；液質聯用

中圖分類號：TS 201.6 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）10-0087-05

Oryzanol Clears Sodium Nitrite and Blocks the Synthesis of Nitrosamine in

Simulated Gastric Fluid

YU Feng-xiang1，CHEN Xu2，CHEN Zu-wu2，ZENG Si-jing3

（1. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic， Changsha 410127， PRC; 2. Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， PRC; 3. Longhui Market Supervision and Management Inspection and Testing Center， Shaoyang 422299， PRC）

Abstract： To reduce the content of nitrosamines in the human body， this study employed liquid chromatography-mass spectrometry to explore the performance of oryzanol in clearing sodium nitrite and blocking the synthesis of nitrosamine in simulated gastric fluid. The results showed that in simulated gastric fluid， oryzanol cleared sodium nitrite， and the removal rate was in a positive correlation with the oryzanol addition amount. Adding oryzanol in the diet reduced the content of N-nitroso-N-ethylaniline， N-nitroso-diethylamine， and N-nitroso-pyrrolidine， with the blocking rates of 100%， 100%， and 24.4%， respectively. In simulated gastric fluid， oryzanol can reduce the substrate of endogenous nitrosamine synthesis by reducing the content of sodium nitrite， thus blocking the synthesis of nitrosamine.

Key words： oryzanol; nitrosamine; sodium nitrite; simulated gastric fluid; liquid chromatography-mass spectrometry

亞硝酸鹽和胺類物質廣泛存在于食物中，這些物質攝入人體后，在胃液的作用下容易產生致癌的亞硝基化合物——亞硝胺[1-2]。亞硝胺是一種強烈的化學致癌物質，長期攝入含有高濃度亞硝胺的食品可能會增加胃癌、食道癌等的患病風險。因此，大部分國家和地區除了對亞硝胺類化合物本身進行管控外，還對亞硝胺可生成物有限量要求。世界衛生組織國際癌癥研究機構已將N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、“在導致內源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽”等列為2A類致癌物；我國GB2762—2022標準規定肉及肉制品、水產動物及其制品中N-二甲基亞硝胺（NDMA）限量分別為不超過3、4 μg/kg；美國農業部規定肉制品中總揮發性亞硝胺限量為10 μg/kg[3]；俄羅斯國家規定生食品和煙熏食品中N-亞硝胺含量不得超過2、4 μg/kg[4]。

減少NO2-及NO3-的攝入是減少內源性亞硝胺形成的關鍵一步。

目前，主要通過控制食品加工條件、加入抗氧化物質（維生素C[5]、維生素E[6]、花色苷[7]、生姜抗氧化物[8]、大黃[9]等）等方法阻斷亞硝胺的合成。為簡化樣品處理流程，解決亞硝胺類物質因熱穩定性差而不易檢測的難題，學術界普遍采用液相色譜、氣質聯用改良法、液質聯用等方法對其進行分析檢測，但都存在檢測時間長、過程繁瑣等問題，具有較大的優化空間[10-11]。

γ-谷維素具有清除自由基、抗氧化、降血脂、降血糖、抑制癌細胞生長、調節中樞及心臟自主神經等功能，但其對亞硝胺的阻斷效果及機理研究尚未見報道。前期試驗發現在蔬菜腌制時加入谷維素，會降低產品亞硝酸鈉含量[12]。筆者通過模擬胃液環境結合液相色譜-質譜聯用法，研究谷維素清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺的效果，為人體內源性亞硝胺合成的阻斷技術提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要試劑材料有亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L）、乙酸鋅溶液（220 g/L）、飽和硼砂溶液（50 g/L）、氨緩沖溶液（pH值9.6～9.7）、20%鹽酸、對氨基苯磺酸溶液（4 g/L）、鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L）、95%食用酒精、醋酸、甲醇（色譜純）、亞硝酸鈉標準使用液（5 μg/mL）、粉狀活性炭。亞硝酸納標準溶液（200 μg/mL，優級純，壇墨質檢科技股份有限公司）；谷維素（≥99.9%，瑞威爾生物科技有限公司）；模擬胃液（pH值1.5±0.1，廣州臻萃質檢技術服務有限公司）；亞硝胺標準品包括N-亞硝基二甲基胺（NDMA）、N-亞硝基二乙基胺（NDEA）、N-亞硝基甲基乙基胺（NMEA）、N-亞硝基哌啶（NPIP）、N-亞硝基-N-甲基苯胺（NMPhA）、N-亞硝基-N-乙基苯胺（NEPhA）、N-亞硝基二苯基胺（NDPhA）、N-亞硝基二丙基胺（NDPA）、N-亞硝基二丁基胺（NDBA）、N-亞硝基吡咯烷（NPYR）、N-亞硝基嗎啉（NMOR）和N-亞硝基二芐胺（NDBzA），均購自美國O2si公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290 Infinity II-6470液相色譜質譜聯用儀（LC-MSMS，安捷倫科技有限公司），ZORBAX SB-CN液相色譜柱（21 mm×100 mm，1.8 μm；安捷倫科技有限公司），UV-1800PC紫外可見分光光度計[翱藝儀器（上海）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 谷維素液的制備 為使谷維素更好地溶解于胃液體系，后續應用于食品加工，需將其配制成穩定的溶液。谷維素不溶于水，以52%普通食用白酒、75%乙醇、無水酒精、食用油、醋酸、食醋、95%食用酒精（玉米酒精）進行試驗，研究制備谷維素液的最適配方。

1.3.2 亞硝胺的液質聯用檢測 （1）對照品溶液配制：精密量取12種亞硝胺混標（均為100 mg/mL）0.25 mL于25 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋，并定容至25mL，搖勻即配得濃度均為1 mg/mL的溶液。（2）加標供試品溶液配制：稱取樣品1.00±0.05 g于玻璃比色管中，加入12種亞硝胺0.2 mL，加入2 mL甲醇，渦旋30 s，靜置2 min，取上層溶液，過濾膜上機測試。（3）上機條件：柱溫40℃，進樣量5 μL，流速0.4 mL/min，流動相A為含0.1%甲醇和5 mmol/L乙酸銨的水溶液，流動相B為甲醇，梯度洗脫條件如表1所示。

1.3.3 谷維素對亞硝酸鈉的清除率檢測 于25 mL比色管中加入模擬胃液10 mL，分別加入谷維素液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL，再加入5

μg/mL亞硝酸鈉標液2 mL，37℃水浴120 min取出，

加入0.4%對氨基苯磺酸2 mL，混勻，靜置5 min后，各加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液1.0 mL，靜置15 min，加水至刻度混勻。用0.45 μm濾膜過濾，在538 nm下測定吸光度Ai。空白調零：以去離子水代替谷維素液和亞硝酸鈉標液。不加谷維素液的樣品吸光度記為A0；對照為不加亞硝酸標準液的樣品，以扣除谷維素自身可能帶來的吸光度誤差，對照吸光度記為A0i。根據公式（1）計算亞硝酸鈉清除率（R）。

（1）

1.3.4 谷維素對膳食亞硝胺的阻斷率檢測 參考中國居民膳食寶塔及《中國居民膳食指南》，按表2設計食譜。稱取200 g經料理機均質后的混合物，添加200 mL模擬胃液，試驗組添加0.02%谷維素，混勻。把混合物放在震蕩保溫箱里，37℃保溫2 h；準確稱取1.00±0.05 g樣品于玻璃比色管中，加入2 mL甲醇，渦旋30 s，靜置2 min，上層溶液用濾膜過濾，再用液質聯用儀檢測亞硝胺物質種類和含量。根據公式（2）計算阻斷率（C）。

（2）

式中：ρ0為不加谷維素液的樣品中亞硝胺的質量濃度（ng/mL），ρi為加入谷維素的樣品中亞硝胺的質量濃度（ng/mL）。

1.4 數據分析

使用Matlab 2014、SPSS 17.0和Excel 2010軟件分析實驗數據。

2 結果與分析

2.1 谷維素液的制備結果

常溫下，谷維素在52%普通食用白酒、75%乙醇、無水酒精、食用油、醋酸、食醋、95%食用酒精（玉米酒精）中的溶解度極小；加熱后，可溶于無水酒精、食用油、醋酸、95%食用酒精。若濃度過高，溶解后加入其他試劑或泡菜液中，會析出白色絮狀物質。經反復試驗，取0.5 g谷維素，加入95%食用酒精15 mL溶解，加入85 mL沸水繼續煮沸，冷卻定容至100 mL。該方法制備的谷維素液可形成穩定的米湯狀液體，離心不沉淀，存放1個月狀態良好，且滿足食品加工要求。

2.2 模擬胃液條件下谷維素對亞硝酸鈉的清除率

由圖1可知，整體而言，亞硝酸鈉的清除率隨著谷維素液添加量增加而提高，說明谷維素在模擬胃液條件下能有效清除亞硝酸鈉，減少內源性亞硝胺合成的底物。

2.3 模擬胃液條件下谷維素對膳食亞硝胺合成的阻斷率

2.3.1 膳食中亞硝胺種類 由表3可知，膳食中亞硝胺物質主要有NEPhA、NDMA、NMEA、NDEA、NDBA、NPYR，亞硝胺混合標準樣品的色譜圖如圖2所示，樣品離子流如圖3所示，MRM定量離子圖如圖4所示。GB 2762—2022標準中規定N-亞硝基二甲基胺（NDMA）在肉及制品、水產動物及其制品中的限量分別為3.0、4.0 μg/kg，參考這一數值，推測膳食樣品N-亞硝基吡咯烷（NPYR）含量存在安全風險。

2.3.2 谷維素對膳食亞硝胺的阻斷率 由表4可知，添加谷維素主要影響了膳食中NEPhA、NDEA、NPYR的含量。NEPhA、NDEA在空白對照樣品中的含量分別為1.6 ng/g和0.2 ng/g，而添加谷維素的樣品中未檢出該種亞硝胺，阻斷率為100%；空白對照樣品中的NPYR含量為8.6 ng/g，試驗組中NPYR含量為6.5 ng/g，阻斷率為24.4%。添加谷維素對NDMA、NMEA、NDBA的阻斷效果不明顯，其原因有待進一步分析。

3 結論

在模擬胃液條件下，谷維素能有效清除食品中的亞硝酸鈉，且亞硝酸鈉的清除率與谷維素液添加量呈正相關關系。此外，谷維素在模擬胃液條件下通過降低亞硝酸鈉含量減少內源性亞硝胺合成的反應底物，阻斷了亞硝胺合成，在膳食中添加谷維素能有效降低膳食中NEPhA、NDEA、NPYR的含量，其亞硝胺阻斷率分別為100%、100%和24.4%。

參考文獻：

[1] 盧強. 綠葉蔬菜中活性成分對亞硝化反應抑制作用的比較研

究[J]. 智慧農業導刊，2021，1（8）：27-30，33.

[2] 鄧紅，賈洪鋒，周世忠，等. 果蔬對亞硝酸鹽清除作用的研究進展[J]. 中國調味品，2015，40（1）：110-114．

[3] CREWS C. The determination of N-nitrosamines in food[J]. Quality Assurance and Safety of Crops & Foods，2010，2（1）：2-12.

[4] NOLLET L M，TOLDRA F. Safety analysis of foods of animal origin[M]. Boca Raton：CRC Press，2011.

[5] RYWOTYCKI R. The effect of baking of various kinds of raw meat from different animal species and meat with functional additives on nitrosamine contamination level[J]. Food Chemistry，2007，101（2）：540-548.

[6] MERGENS W J，KAMM J J，NEWMARK H L，et al. Alpha-tocopherol： uses in preventing nitrosamine formation[J]. IARC Scientific Publications，1978（19）：199-212.

[7] 徐遠州，陳碩. 不同模擬胃液條件下紫甘薯花色苷對亞硝化反應的抑制作用[J].中國食物與營養，2012，18（4）：72-75．

[8] 顧如霞，葛鳳芹，劉步云，等. 生姜提取物抑制培根風干成熟過程的亞硝化反應[J]. 現代食品科技，2022，38（9）：198-205.

[9] 程金妞，劉真真，齊曉茹，等. 大黃對二乙基亞硝胺致大鼠肝癌癌前損傷的作用及機制[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2023，25（1）：14-19，221.

[10] 朱萌萌，葉群，周婷婷，等. 氣相色譜-串聯質譜法測定肉制品中10種揮發性N-亞硝胺類化合物[J]. 色譜，2019，37（2）：207-215.

[11] 侯靖，盧躍鵬，陳丹，等. 氣質聯用法快速測定肉制品中N-二甲基亞硝胺[J]． 食品工業，2020，41（12）：298-300.

[12] 喻鳳香，陳煦，林繼華，等. 蔬菜及其腌制品亞硝酸鈉含量變化及阻斷技術研究[J]. 農產品質量與安全，2023（6）：69-74.

（責任編輯：王婷）