三江源地區熊蜂16S rDNA序列變異及遺傳距離分析

收稿日期：2024-01-28；修回日期：2024-04-14

基金項目：青海省科技廳自然科學基金（2024-ZJ-925）;青海省“昆侖英才·鄉村振興人才”項目資助

作者簡介：張蕊（2000-），女，漢族，陜西咸陽人，碩士研究生，主要從事傳粉昆蟲生物多樣性保護研究，E-mail：2205159643@qq.com；#馮收（2000-），女，漢族，山東濰坊人，碩士研究生，主要從事植物保護學研究，E-mail：fengshou223@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：liudaoxin_dy2007@163.com

摘要：本研究基于16S rDNA序列對三江源地區不同熊蜂的遺傳變異和系統發育關系進行了系統分析，對于深入研究三江源地區熊蜂的適應與進化及生物多樣性保護具有重要意義。研究共測序獲得三江源地區9個亞屬17種熊蜂的21個單倍型，序列全長496 bp。堿基組成分析表明：顛換值高于轉換值，變異位點（V）共159個，單倍型間存在較大的變異。結合Genbank下載的該9亞屬其他39種熊蜂的16S rDNA序列，對該9個亞屬的56種熊蜂進行了遺傳距離和系統發育分析，結果表明：三江源地區17種熊蜂間遺傳距離為0.029～0.128；亞屬內平均遺傳距離為0.023～0.075，亞屬間遺傳距離為0.057～0.102，亞屬內遺傳距離明顯小于亞屬間；通過鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建立系統發育樹，兩樹拓撲結構大致相同，三江源地區的17種熊蜂均與同亞屬其他物種的親緣關系最近。

關鍵詞：三江源地區；熊蜂；16S rDNA；序列變異；遺傳距離

中圖分類號：S891 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3052-10

Analysis of Bumblebee 16S rDNA Sequence Variation and Genetic Distance in the Sanjiangyuan Region

ZHANG Rui^1#， FENG Shou^2#， YAN Jing-yan²， LIANG Cheng-bo²， MA Xiao-xuan²， LIU Dao-xin^2*

（1.College of Eco-Environmental Engineering， Qinghai University， Xining，Qinghai Province 810016， China；2.College of Agriculture and animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：Based on 16S rDNA sequences，the genetic variation and phylogenetic relationship of different bumblebees in the Sanjiangyuan region were studied systematically，which is of great significance to further study the adaptation，evolution and biodiversity conservation of bumblebees in the region. A total of 21 haplotypes of 17 species of bumblebees belonging to 9 subgenera were sequenced in the Sanjiangyuan region，with a total length of 496 bp. The base composition analysis showed that the transversion value was higher than the transition value，there were 159 variation sites （V），and there were large variation among haplotypes. Combined with the 16S rDNA sequences of 39 other bumblebees from 9 subgenera downloaded by Genbank，the genetic distances and phylogenetic analysis of 56 bumblebees belonging to 9 subgenera were performed. The results showed that：The genetic distances between 17 bumblebees in the Sanjiangyuan region ranged from 0.029 to 0.128;The average genetic distance within the subgenus ranged from 0.023 to 0.075，the genetic distance between subgenera ranged from 0.057 to 0.102，the genetic distances within subgenera were significantly smaller than that between subgenera;Phylogenetic trees were established by neighbor-joining method （NJ method） and maximum likelihood method （ML method），and the topological structure of the two trees were roughly the same，all 17 species of bumblebees in the Sanjiangyuan region were closely related to other species of the same subgenus.

Key words：Sanjiangyuan region;Bumblebees;16S rDNA;Sequence variation;Genetic distance

在農業生產和自然生態系統中，傳粉昆蟲有著不可忽視的重要作用^［1］。近年來大量研究表明，由于生態系統破壞、環境污染（農藥及殺蟲劑的使用）、棲息地縮小甚至喪失、病毒傳播以及外來物種入侵等原因，全球范圍內傳粉昆蟲多樣性急速下降，導致傳粉生態網破裂，植物面臨傳粉限制風險，農作物產量和質量下降，對農業生產和自然生態鏈產生了明顯影響^［2-3］。

熊蜂屬于昆蟲綱（Insecta）、膜翅目（Hymenoptera）、蜜蜂科（Apidae）、熊蜂屬（Bombus），包含15個亞屬^［4］，具有傳粉效率高、耐高寒和飛行能力強等特點^［5］，能夠通過自身的體溫調節保持內部生理環境的穩定以適應高原地區海拔高、氣溫低、溫度差異大等的惡劣氣候環境條件。根據目前的調查結果，北半球的高山高原地區是熊蜂主要的分布地^［6］，且青藏高原是全球物種多樣性最為豐富、最具研究價值的熱點地區之一^［7］，平均海拔為3000～5000 m。三江源地區處于青藏高原中部，占青海省區域面積的50%，植被類型以高寒草地為主^［8］，氣候冷涼，加之高原地區本身分布的傳粉昆蟲較少，熊蜂就成為高原地區最主要的傳粉類群之一^［9］。我國是現存熊蜂物種資源最豐富的國家，經研究發現及報道的種類達125種，占全世界已發現熊蜂種數的50%^［10-12］。國內外研究學者先后對西藏^［13］、云南^［14-15］、浙江^［16］、四川^［17］、甘肅^［18］、貴州^［19］等地區的熊蜂資源開展了較為系統的研究和調查，但三江源地區氣候條件惡劣，人口稀少，交通不便，經濟條件落后，在該地區開展熊蜂調查等科學研究往往面臨著諸多挑戰，最終導致該地區熊蜂生物多樣性研究工作的滯后。然而，三江源地區毗鄰全球熊蜂多樣性中心，在該地區進行熊蜂生物多樣性的系統研究對進一步豐富對中國熊蜂生物多樣性分布的認識和三江源地區熊蜂生物多樣性的保護具有重要意義。

線粒體基因組是在線粒體內發現的小型環狀染色體，具有結構相對保守、基因進化速率快、母系遺傳、高拷貝數、結構簡單且易獲得等特點。COI，16S rDNA，Cytb，D-loop區等基因序列均可應用于生物系統發育的研究^［20］，其中16S rDNA是一種重要的分子標記，常被用于物種鑒定、遺傳分化、系統發育等分析中^［21］。研究表明，16S rDNA在熊蜂種級階元系統發育分析和遺傳學應用中使用廣泛^［22］，劉霽瑤^［20］利用該基因對我國的明亮熊蜂系統發育進行分析，發現復合種內極有可能存在新種，Cameron等利用該基因序列、12S rDNA及Opain對熊蜂亞屬進行系統發育分析，發現分子鑒定與形態學鑒定結果一致^［23］。

本研究對三江源地區9亞屬17種熊蜂的16S rDNA序列進行了擴增、測序和變異情況分析，并結合Genbank數據庫下載的9亞屬其他39種熊蜂的39條16S rDNA序列數據，對相關亞屬的遺傳距離和系統發育進行了分析，以期為青藏高原三江源地區熊蜂的物種分子鑒定、遺傳多樣性的研究和三江源地區生物多樣性的保護提供更多基礎資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與鑒定

2019—2021年在三江源地區通過樣點標記，采用樣線法和網捕法采集熊蜂成蟲標本。將捕獲的熊蜂放入透氣礦泉水瓶中，待其自然死亡后針插標本盒中陰干保存。標本采集完畢后帶回實驗室，使用昆蟲針將熊蜂固定在昆蟲標本盒中暫存，統計總數后開展標本鑒定工作。

篩選出形態完好、無損壞的樣本，根據熊蜂的毛色、長度、濃密、胸腹部體節數、體型、單眼數、胸部背面和腿節、脛節有無絨毛等外部形態學特征對初篩后的樣本進行進一步分類，參考相關文獻、圖書資料等^{［18，24］}的檢索表對樣本進行分類鑒定（表1）。

1.2 DNA提取及16S rDNA序列擴增

每種熊蜂隨機挑選1～3頭，提取線粒體16S rDNA基因。視樣品體型取其右后足或右側后足與中足，用濾紙包裹后碾碎，用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（上海生物工程有限公司）提取DNA。對其線粒體16S rDNA（引物：F-5′-CACCTGTTTATCAAAAACAT-3′；R-5′-TATAGATAGAAACCAATCTG-3′）^［25］基因進行PCR擴增。反應體系為40 μL，其中10×Buffer（Mg²⁺） 5 μL，dNTPs混合物2.5 μL，正反向引物各1 μL，Tap酶0.5 μL，DNA模板1 μL，ddHO 29 μL。擴增條件為95℃預變性4 min，95℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸45 s，72℃總延伸6 min；循環45次。利用瓊脂糖凝膠電泳對擴增效果進行檢測，確定擴增出目標條帶且無雜帶后，將PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司進行Sanger測序。利用Chromas 2對測序結果進行校對。

1.3 Genbank數據整理

根據形態鑒定結果，本研究在三江源地區共發現熊蜂17種，分屬于9個亞屬。為確定三江源地區的熊蜂樣本相對亞屬內其他物種的遺傳變異情況，在NCBI［National Center for Biotechnology Information （nih.gov）］上查找9亞屬所有其他國內熊蜂物種的基因序列，共計39種熊蜂39條16S rDNA序列（表2）。

1.4 數據分析

對本研究所獲得的三江源地區17種熊蜂的21條單倍型序列在NCBI上進行BLAST序列比對分析，根據和同物種參考序列的比對結果進行種內比對分析，確定形態學鑒定結果是否準確。通過MEGA7.0軟件對本研究所獲得的17種21條序列和從Genbank下載的39種熊蜂39條序列進行比對分析種內及種間變異情況、堿基含量、堿基對組成頻數及信息位點，并計算熊蜂亞屬間和亞屬內的遺傳距離。使用DAMBE軟件^［26］，進行堿基替代飽和度檢驗。以中華蜜蜂（Apis cerana）（NCBI登錄號：OP689704）為外源群在MEGA7.0軟件中進行建樹，通過最大似然法（Maximum likelihood，ML）和鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）建立不同種熊蜂的系統發育關系，進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 三江源地區熊蜂16S rDNA序列種內比對分析

根據同物種序列比對結果可知：B. tibeticus（H12，H13），B. sp. SJY-2019（H16）和B. branickii（H15）無同物種參考序列，三者參考序列比對的最高相似度物種分別為黑熊蜂亞屬（同亞屬）紅束熊蜂（B. rufofasciatus/MG681144），相似度為95.23%；擬熊蜂亞屬（同亞屬）圖氏熊蜂（B. turneri/KX791779），相似度為97.28%；擬熊蜂亞屬（同亞屬）崖熊蜂（B. rupestris/DQ788099），相似度為96.42%。其他14個物種與參考序列比對相似度均高于99%。整體上16S rDNA分子鑒定的結果與形態學鑒定結果基本一致，可為形態學鑒定正確性提供佐證。

2.2 三江源地區熊蜂16S rDNA序列種間變異

2.2.1 堿基含量分析 本研究通過MEGA 7.0軟件對試驗所采集的17種21條單倍型序列進行分析。所有16S rDNA序列經校對后，共取序列全長496 bp，堿基組成情況為：A，T，C，G平均含量分別為39.5%，38.8%，8.0%，13.7%，A+T平均含量為78.3%，C+G平均含量為21.7%（表3）。

2.2.2 堿基對組成頻數分析 堿基對組成頻數分析可知，轉換值（si）為15%，顛換值（sv）為29%，轉換與顛換比率R為0.53，顛換值明顯高于轉換值，主要發生轉換的堿基為A和G之間，出現顛換的堿基主要為A和T之間。

2.2.3 信息位點分析 16S rDNA基因序列共有496個堿基位點，保守位點（C）共計333個，變異位點（V）共計159個，簡約信息位點（Pi）119個，自裔位點（S）40個，分別占總堿基數含量的67.14%，32.06%，23.99%，8.06%。

2.2.4 遺傳距離分析 經MEGA7.0軟件對21條單倍型序列進行分組處理，17種熊蜂樣本的遺傳距離范圍為0.029～0.128（表4）。最小遺傳距離發生在巨熊蜂亞屬內的蘇氏熊蜂（B. sushkini）和越熊蜂（B. supremus）之間，最大遺傳距離發生在真熊蜂亞屬密林熊蜂（B. patagiatus）和假熊蜂亞屬凸污熊蜂（B. convexus）、擬熊蜂亞屬斯科熊蜂（B. skorikovi）和假熊蜂亞屬凸污熊蜂（B. convexus）、胸熊蜂亞屬盜熊蜂（B. filchnerae）和假熊蜂亞屬凸污熊蜂（B. convexus）之間。

2.3 基于16S rDNA序列的不同熊蜂亞屬內信息位點分析

在Genbank上篩選出9亞屬內39條其他物種序列，結合17種樣本熊蜂21條單倍型，共計9亞屬56種熊蜂60條序列，經MEGA 7.0進行合并分析處理。利用MEGA軟件分別對9個亞屬所包含的不同物種基因序列進行分析，總信息位點數為496個，通過計算，得出以下各亞屬內的信息位點情況（表5）。其中擬熊蜂亞屬（Psithyrus）及黑熊蜂亞屬（Melanobombus）變異最大，擬熊蜂亞屬變異位點91個，簡約信息位點50個，黑熊蜂亞屬變異位點89個，簡約信息位點54個。其次為假熊蜂亞屬（Mendacibombus）及胸熊蜂亞屬（Thoracobombus），西熊蜂亞屬（Sibiricobombus）的變異最小，其簡約信息位點為0個。

2.4 基于16S rDNA序列的熊蜂亞屬內與亞屬間距離

經MEGA7.0軟件分組計算，可得亞屬間遺傳距離最小發生在巨熊蜂亞屬（Megabombus）和地熊蜂亞屬（Subterraneobombus）之間，為0.057，最大遺傳距離發生在假熊蜂亞屬（Mendacibombus）和胸熊蜂亞屬（Thoracobombus）之間，為0.102（表6）。亞屬內平均遺傳距離最小發生在真熊蜂亞屬（Bombus）中，為0.023，亞屬內最大平均遺傳距離發生在假熊蜂亞屬（Mendacibombus）中，為0.075。

2.5 三江源地區熊蜂系統發育分析結果

2.5.1 堿基替代飽和度檢驗 經DAMBE軟件分析計算，可得堿基替代飽和度指數Iss=0.235，Iss.c=0.795，P＜0.01。由于Iss＜Iss.c，P＜0.01，堿基替代飽和度為不飽和狀態。同時，以遺傳距離為橫坐標，轉換與顛換為縱坐標的堿基替代飽和度二維散點圖，表明轉換值和顛換值與遺傳距離具有一定的線性關系（圖1），具備建立系統發育樹的條件。

2.5.2 基于16S rDNA的系統發育樹分析 本研究基于線粒體基因16S rDNA建立了9個亞屬56種熊蜂的系統發育樹，以中華蜜蜂（A. cerana）為外源群，分別采用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）建樹（圖2，圖3）。由圖可知，基于兩種方法的系統發育樹拓撲結構大致相同，除黑熊蜂亞屬（Melanobombus）和胸熊蜂亞屬（Thoracobombus）中部分物種親緣關系表現特殊外，其他相同亞屬物種基本聚類為同一分支，系統發育樹所體現的亞屬間的親緣關系與遺傳距離的對比關系相似。

3 討論與結論

3.1 三江源地區熊蜂種間變異

樣本熊蜂的21條單倍型序列堿基AT含量明顯高于GC含量，存在一定的堿基偏倚性^［27］。堿基組成頻數中，轉換主要發生在A和G之間，顛換主要出現在A和T之間，顛換值高于轉換值，與前人在線粒體基因方面的研究情況一致^［28-30］。16S rDNA基因序列保守位點占比約70%，變異位點占比32%，存在相對較高的保守性和一定程度的變異^［31-33］。在種間遺傳距離分析中，巨熊蜂亞屬的蘇氏熊蜂（B. sushkini）和越熊蜂（B. supremus）之間的遺傳距離最小，與黃家興基于COⅠ的系統發育研究結果一致^［34］；真熊蜂亞屬的密林熊蜂（B. patagiatus）和假熊蜂亞屬的凸污熊蜂（B. convexus）之間的種間遺傳距離最大。

3.2 亞屬內和亞屬間遺傳距離

本研究中9個熊蜂亞屬的屬內變異位點數為23～91個，簡約信息位點為0～54個，存在相對較大的變異，與熊蜂亞屬遺傳變異分析相關研究文章結果一致^［20］，絕大多數物種的最小種間遺傳距離均出現在該物種與同亞屬的其他物種之間。黑熊蜂亞屬B. tibeticus、擬熊蜂亞屬B. branickii和B. sp. SJY-2019無NCBI參考序列，經分子序列比對后其相似度最高物種與遺傳距離最小物種均一致，故進一步為形態學物種鑒定提供可靠證據。

3.3 系統發育

在系統發育樹分析上，鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）兩類建樹分支結果大致相同，絕大多數相同亞屬物種聚類為同一分支。除黑熊蜂亞屬和胸熊蜂亞屬為并系群外，其余熊蜂亞屬均為單系群。黑熊蜂亞屬中萃熊蜂（B. eximius）和白背熊蜂（B. festivus）與同亞屬其他物種親緣關系較遠。其中萃熊蜂與阿熊蜂亞屬和假熊蜂亞屬親緣關系較近，白背熊蜂與西熊蜂亞屬親緣關系較近。胸熊蜂亞屬存在兩種熊蜂親緣關系表現特殊，黑足熊蜂（B. atripes）和仿熊蜂（B. imitator）并未和同亞屬其他物種聚為一支，而與其他亞屬親緣關系更近，但分支支持率并不高。對于兩亞屬中個別物種與其他亞屬物種親緣關系更近的情況，目前并未有相關研究結果能夠解釋這一現象，有待進一步考究。個別亞屬物種的親緣關系表現異常也可能是因為數據量支持不夠，屬正常情況，當具備足夠的數據量時結果將更加精確。本研究結果也支持了目前亞屬的分類系統。系統發育分析結果與物種采集后基于形態學的樣本鑒定結果一致。在置信度方面NJ法相對于ML法更高。

本研究對9亞屬56種熊蜂60條序列進行序列變異分析，發現三江源地區17種熊蜂16S rDNA基因序列變異位點159個，存在一定程度的變異；在系統發育分析中三江源地區的17種熊蜂均與同亞屬其他物種的親緣關系最近，支持了它們的分類地位；絕大多數物種的最小種間遺傳距離均出現在該物種與同亞屬的其他物種之間。本研究結果對三江源地區熊蜂生物多樣性的保護具有重要意義。

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（責任編輯 閔芝智）