纖維素降解菌和溫度對水稻秸稈纖維降解和發酵品質的影響

摘要：本研究從白蟻腸道中篩選出了一株纖維素降解菌，并探討其在不同溫度下水稻（Oryza sativa L.）秸稈青貯中的發酵效果。青貯試驗設置對照組（CK）和纖維素降解菌處理組（CS），纖維素降解菌添加量為1×10⁷cfu·g^-1，分別進行常溫（28℃）和高溫（37℃）青貯，30 d后取樣分析青貯品質。結果表明，與對照組相比，添加纖維素降解菌在常溫條件下能夠顯著增加乳酸菌數量和乳酸含量，顯著降低pH值（P<0.05）；在高溫條件下降低了氨態氮含量，pH值顯著下降（P<0.05）。兩種溫度條件下，添加纖維素降解菌均顯著降低中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量（P<0.05）。綜上所述，纖維素降解菌有助于降解纖維素，促進乳酸發酵，對水稻秸稈青貯飼料發酵品質具有改善作用。在37℃條件下，水稻秸稈青貯飼料纖維降解效果更佳。

關鍵詞：纖維素降解菌；纖維；水稻秸稈；溫度；青貯

中圖分類號：S816.53 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2024）10-3305-08

Effects of Cellulose-degrading Bacteria and Temperature on Fibre Degradation and Fermentation Quality of Rice Straw

YANG Dan， ZHOU Yu-xin， YIN Han-xue， CHEN Dan-dan， ZHANG Qing^*

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong Province 510642， China）

Abstract：This study isolated a cellulose-degrading bacterium from the termite gut and investigated its fermentation effects on rice straw silage at different temperatures. The silage experiment included a control group （CK） and a cellulose-degrading bacterium treatment group （CS），with the addition of cellulose-degrading bacteria at a concentration of 1×10⁷ cfu·g^-1. Fermentation was conducted at room temperature （28℃） and high temperature （37℃） for 30 days，after which samples were taken for quality analysis. The findings indicated that compared to the control，the addition of the cellulose-degrading bacterium significantly increased the quantity and content of lactic acid bacteria，markedly reduced pH values （P<0.05） under normal temperature condition，and lowered ammonia nitrogen content （P>0.05） while significantly reducing pH values （P<0.05） under high-temperature condition. In both temperature conditions，the cellulose-degrading bacterium notably decreased the levels of neutral detergent fiber and acid detergent fiber content （P<0.05）. In summary，the cellulose-degrading bacterium aided in cellulose degradation，promoted lactic acid fermentation，and improved the fermentation quality of rice straw silage. Particularly，the effectiveness of fiber degradation in rice straw silage feed was enhanced under 37℃ condition.

Key words：Cellulose-degrading bacteria;Fiber;Rice straw;Temperature;Silage

收稿日期：2024-04-08；修回日期：2024-06-12

基金項目：廣州市科技特派員項目（2024E04J0301）;國家重點研發項目（2022YFE0111000-2，2022YFD1300901）資助

作者簡介：楊丹（1999-），女，漢族，江西南昌人，碩士研究生，主要從事牧草青貯加工研究，E-mail：ydycbwywtb@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zqing1988@126.com

水稻（Oryza sativa L.）是我國最主要的糧食作物，隨著水稻單產的增加，每年廢棄水稻秸稈產量也在持續增加^［1］。青貯是一種利用乳酸菌厭氧發酵調制天然飼草的方法，經過青貯發酵過的飼草具有較高的營養價值，且適口性強、消化率高、利用率高^［2-3］。因此將水稻秸稈進行青貯發酵，不僅可以有效地解決冬季新鮮牧草不足的問題，還可以解決直接焚燒和填埋廢棄秸稈所造成的環境污染和資源浪費問題^［4］。然而，秸稈纖維素含量豐富，且內部結構穩定不易被降解，粗糙堅硬，適口性差，青貯后的水稻秸稈不利于畜禽營養吸收與消化，難以達到預期的效果^［5］。因此，如何降低秸稈的纖維素含量，提升秸稈飼料適口性的同時增強其營養品質，為動物提供更為優質的飼料是亟需解決的問題。

纖維素酶能破壞植物細胞壁，將纖維降解為可利用的還原糖，促進動物營養吸收，整個反應過程中所需條件溫和且生態友好，受到了越來越多人的關注^［6］。近年來，研究者將目光聚焦到微生物產酶這一方法上，篩選并識別具有降解纖維素的功能性微生物，試圖通過微生物之間的協同作用，以高效率、低成本的方式對植物中存在的纖維素進行降解^［7-9］。一般情況下，所篩選的微生物中，真菌降解纖維素的能力較細菌強，但是由于其生長較慢、相關酶類較復雜，且熱穩定較差，限制了它的生產，所使用的菌株仍然存在纖維素降解能力低、活性不夠穩定和pH作用不顯著等問題^［10-11］。Li等^［12］從蠶糞中分離到了三株纖維素降解菌，經過16S rRNA基因序列比對分析，分別鑒定為地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，且這三株細菌展現了高效的降解纖維素能力，水解能力值在1.86～5.97之間，酶活力范圍為5.07～7.31 U·mL^-1。從中可以看出篩選降解纖維素的細菌更具有其獨特的優勢：（1）細菌培養周期短、生長速度快、可以依靠低成本的氮源和碳源作為纖維素酶生產的能源；（2）細菌纖維素基因表達量相對較高、相對容易獲得；（3）細菌纖維素酶的熱穩定性好，原核表達控制系統相對簡單方便^［13］。

微生物產酶降解植物性纖維素已成為當前較為普遍的研究，研究者們通過利用微生物產酶的方式來加速堆肥腐熟的效率以及促進生物能源的轉化^［14-15］。然而，關于在水稻秸稈中添加纖維素降解菌制成青貯飼料，從而降解纖維素并有效改善其發酵品質的研究較少。因此，本研究從白蟻腸道中篩選出一株高效纖維素降解菌，應用于水稻秸稈中，觀察其在兩種不同溫度下的發酵效果，為促進纖維素降解菌在農作物秸稈青貯飼料中的應用，纖維的降解能力和水稻秸稈發酵品質的改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所選用的白蟻來自華南農業大學林學與風景園林學院昆蟲生物防治實驗室，于2023年1月對200只白蟻進行養殖后收集的新鮮白蟻腸道。水稻種植于華南農業大學啟林北試驗田（23°16′ N，113°36′ E），于2023年12月人工收割水稻秸稈，在實驗室切成2 cm左右的水稻秸稈碎段，用微型植物粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）將水稻秸稈粉碎成粉狀。

1.2 試驗設計

試驗設置對照組（CK）和纖維素降解菌處理組（CS）。將青貯原料水分含量調到65%，把篩選的纖維素降解菌按照1×10⁷cfu·g^-1添加量加進水稻秸稈中，對照組添加等量的生理鹽水，混合均勻后分別裝入聚乙烯塑料包裝袋中，每袋約100 g，然后用真空密封機密封，按照28℃和37℃分別進行常溫和高溫青貯，一共24青貯樣品袋（4個處理×6個重復）。青貯30 d后對青貯飼料進行發酵品質、纖維含量和可溶性糖含量分析。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離與純化 將采集到的白蟻腸道內容物放置于研磨儀中加入10 mL 0.9%生理鹽水進行研磨成勻漿。并以10倍梯度對菌液進行逐層稀釋直至10^-7梯度，隨后分別取100 μL各梯度液涂布到LB固體培養基上。待菌液放干后倒置放于37℃恒溫培養箱培養2 d后，挑取單菌落劃線培養，二代劃線后轉移至LB液體培養基中培養1 d。

1.3.2 纖維素降解菌的初篩 取出上述菌液以0.5 μL以三點法接種到羧甲基纖維素鈉固體培養基中，37℃培養2 d～4 d，待菌落長出來以后，將培養基平鋪在試驗臺上，沿著培養基邊緣緩慢加入5 mL 0.2%剛果紅染液使其鋪平整個平板后靜置染色15～30 min，隨后倒掉染液，加入5 mL的1 mol·L^-1氯化鈉溶液進行脫色30 min后倒掉。若菌落出現明顯的透明圈則初步斷定該菌株具有纖維素降解能力。用游標卡尺記錄所篩選菌株的透明圈直徑（D）與菌落直徑（d），根據兩者的比值大小（D/d）推測其產纖維素酶能力大小^［16］。根據比值的大小選擇酶活較高的菌株進行復篩。

1.3.3 纖維素降解菌的復篩 測定菌株的胞外酶活力，并篩選出一株酶活力較高的菌株用于水稻秸稈青貯，在常溫和高溫條件下比較青貯效果。（1）纖維素酶活測定：試驗采用二硝基水楊酸法（Dinitrosalicylic acid，DNS）測定^［17-19］，將所篩選到的微生物按2%接種量加入50 mL液體產酶培養基中，37℃，以180 r·min^-1恒溫搖床上振蕩培養48小時。取5 mL發酵液轉入10 mL離心管8000 r離心10 min。取上清液0.5 mL作為粗酶液。空白對照為煮沸10 min滅活的等體積粗酶液，取0.5 mL粗酶液到20 mL試管中，加入1.5 mL的1%的底物，抽打混勻后將試卷放水浴鍋50℃恒溫條件酶解30 min，加入3 mL DNS溶液終止反應，充分混勻后沸水浴10 min，冷卻后利用酶標儀比較540 nm處的吸光度，再代入所制作的葡萄糖標準曲線，得出纖維素降解菌所產生的葡萄糖含量。根據酶活力計算公式計算纖維素酶活性。（2）制作葡萄糖標準曲線：分別取1 mg·mL^-1葡萄糖標準液0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL加入到10 mL已標記的試管中，再依次加入2，1.8，1.6，1.4，1.2，1，0.8 mL蒸餾水，分別準確加入DNS試劑3 mL，沸水浴加熱2 min。自來水冷卻后，檢測620 nm處吸光度，縱坐標為吸光度，橫坐標為各標準濃度（mL），作圖得到標準曲線。

1.3.4 菌株鑒定 根據SK8255 Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，細菌通用引物擴增16S rDNA序列。PCR產物在1.5%瓊脂凝膠，1×TAE緩沖液中進行電泳檢測。將擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，獲得16S rRNA序列信息與GenBank基因庫中的序列進行Blast相似性比較。

1.3.5 水稻秸稈青貯飼料發酵品質測定

（1）微生物數量測定

青貯30 d后開袋，混合均勻后使用五點法稱取樣品10 g，注入90 mL無菌生理鹽水充分振蕩混勻，將上清液從10^-1至10^-6進行梯度稀釋，微生物數量測定采用平板計數法，乳酸菌和大腸菌分別采用MRS瓊脂培養基和結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）進行培養計數，酵母菌和霉菌采用孟加拉紅培養基（虎紅瓊脂）進行培養計數^［20］。

（2）pH值及有機酸測定

取10 g鮮樣加入90 mL純水于4℃冰箱浸泡過夜，24 h后取出用濾紙過濾后，使用雷磁PHS-3C型pH計（上海市精密科學儀器有限公司）測定濾液的pH值。其余濾液經0.22 μm孔徑的濾膜進行過濾，采用島津GC-14型高效液相色譜儀測定有機酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量。

（3）化學成分測定

采用蒽酮比色法測定可溶性碳水化合物，用葡萄糖制作標準曲線，將樣品煮沸10 min，冷卻過濾定容，吸取搖勻后加入蒽酮，在620 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算原料中所含可溶性碳水化合物含量。取適量樣品，稱重記錄，置于65℃恒溫干燥箱烘干48 h，計算樣品烘干后的重量與烘干前的重量的百分比就是干物質含量。根據Van Soest^［21］的方法，使用纖維分析儀（2000，英國Ringbio）分析粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。

1.4 數據統計與分析

所有的試驗數據統計分析均SPSS 27.0軟件完成，采用獨立樣本T檢驗對不同溫度下纖維降解菌添加處理的各個樣本平均值之間差異進行比較，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。所有圖片則使用GraphPad Prism 8軟件進行繪制后導出。

2 結果與分析

2.1 初篩纖維素降解菌

分離純化后，通過初篩得到20株有透明圈的菌株，初步判定這些菌株具有產纖維素酶的能力，其中篩選出透明圈直徑/菌落直徑≥3的5株菌株，分別為2，9，11，13，20號菌株，菌株20的透明圈直徑/菌落直徑值最大，其次是菌株9。之后對這些比值較大的菌株進行復篩。

2.2 復篩纖維素降解菌

（1）葡萄糖標準曲線

通過DNS法測得葡萄糖標準曲線如圖1所示，以三次重復值的均值得到葡萄糖標準曲線為y=2.666x-0.021，線性相關系數R²=0.999，由此可得，該標準曲線線性良好，達到基本要求。

（2）纖維素酶活力

對初篩后選出的5株菌進行酶活力測定，篩選出20號菌株透明圈與菌落直徑最大且纖維素酶活力最高，因此20號菌株為最終獲得的目的菌株。

2.3 纖維素降解菌16S rDNA鑒定

通過對復篩出的目的菌株進行提取DNA，以此模板進行PCR擴增，通過測序結果在NCBI網站進行Blast比對后，結果表明20號菌株歸屬于Cellulomonas sp.。

2.4 水稻秸稈化學成分和微生物組成

水稻秸稈的化學成分和微生物組成如表2所示。水稻秸稈干物質含量為54.67%；可溶性碳水化合物含量為3.50%DM；中性洗滌纖維含量和酸性洗滌纖維含量分別為83.91%和49.03%DM；原料表面附著的微生物數量豐富，其中乳酸菌和大腸桿菌分別為5.92和6.52 lg cfu·g^-1 FW。

2.5 纖維素降解菌和溫度對水稻秸稈青貯飼料發酵品質和微生物數量的影響

不同溫度下纖維素降解菌對水稻秸稈青貯發酵品質如表3所示。兩個溫度條件下，添加纖維素降解菌后，水稻秸稈青貯飼料的pH值均顯著降低（P<0.05）。當溫度在37℃時，乳酸菌數量顯著下降（P<0.05）。與此相反，乳酸菌數量和乳酸含量在常溫條件下顯著增加（P<0.05）。水稻秸稈自然青貯后，與28℃相比，37℃條件下的pH值顯著降低，而乳酸含量、氨態氮含量、乳酸菌和酵母菌數量顯著升高（P<0.05）。添加纖維素降解菌后，28℃下的乳酸菌，酵母菌數量和氨態氮含量較37℃顯著增加（P<0.05）。

2.6 纖維素降解菌和溫度對水稻秸稈青貯飼料纖維含量和碳水化合物含量的影響

由表4可知，相比常溫條件下的CK組，37℃條件下自然青貯后水稻秸稈的可溶性碳水化合物含量顯著增加，然而，添加CS后，可溶性碳水化合物含量顯著降低（P<0.05）。在兩種溫度條件下，添加CS降低了中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，且中性洗滌纖維含量顯著降低了近4個百分點，酸性洗滌纖維含量顯著降低了近5個百分點（P<0.05）。當溫度在37℃條件下，不論是自然青貯還是添加CS，酸性洗滌纖維含量顯著降低（P<0.05）。

3 討論

3.1 水稻秸稈營養成分

優質的水稻秸稈青貯的關鍵在于乳酸菌能否大量且迅速增殖。一般情況下，新鮮原材料本身附生乳酸菌的數量超過10⁵cfu·g^-1 FW就可以很好的滿足青貯發酵品質^［22］。本研究中的水稻秸稈乳酸菌數量正好符合快速發酵的要求，但不良微生物如酵母菌、霉菌和大腸桿菌的數量也較多，可能會增加營養物質的損耗，不利于青貯發酵。青貯原料中可溶性糖也是影響發酵品質的一個重要因素，充足的可溶性糖可以為乳酸菌提供充分的發酵底物^［23］。水稻秸稈中可溶性碳水化合物大多是以木質纖維素（纖維素，半纖維素和木質素）的形式存在于細胞壁中，而水稻秸稈中纖維素含量最高，很難被乳酸菌充分利用^［24-25］。同時，本研究中水稻秸稈的粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量偏高，單獨青貯不利于反芻動物消化，結果往往不理想。

3.2 纖維素降解菌和溫度對水稻秸稈青貯發酵品質的影響

生產過程中通過應用添加劑來提高青貯發酵質量。纖維素降解菌產生的纖維素酶能夠促進秸稈中結構性碳水化合物的分解，釋放出額外的可溶性碳水化合物以補充乳酸菌發酵所需的底物，促進乳酸發酵，降低pH值并抑制有害微生物的活性，從而提高青貯發酵品質^［26-27］。

本研究通過添加纖維素降解菌到水稻秸稈中發現，常溫條件下添加CS，乳酸含量和乳酸菌數量顯著增加，pH值顯著降低，說明纖維素酶能夠降解植物細胞壁為乳酸菌生長提供底物來源，促進乳酸增加，與王玉榮^［28］和He等^［29］觀點一致，能有效抑制大腸桿菌和霉菌等不良微生物，加快乳酸的積累，降低pH值。確保厭氧環境是青貯飼料制作成功的關鍵因素，高溫條件下，溫度升高，酵母菌等其他不良微生物生長活躍，利用可溶性糖等營養物質產生乙醇和二氧化碳，導致本試驗在水稻秸稈青貯中發現丁酸的存在，pH值下降遲緩，酵母菌數量和氨態氮含量顯著增加^［30］。

3.3 纖維素降解菌和溫度對水稻秸稈可溶性碳水化合物和纖維的影響

常規青貯條件下，可溶性碳水化合物含量一般隨青貯時間的延長呈現下降趨勢^［31］。然而，纖維素降解菌能分泌高活性纖維素酶，纖維素酶通過酶解作用能直接將水稻秸稈中的纖維素和半纖維素降解，釋放可溶性糖^［33-34］。在常溫條件下，相較于CK，纖維素降解菌很好地發揮了酶解作用，增加了WSC含量。在高溫條件水稻秸稈自然青貯下，WSC含量顯著增加，這可能是使乳酸菌迅速增殖的最佳溫度，其代謝產物乳酸含量增加，使pH維持穩定，抑制了好氧微生物對可溶性碳水化合物的分解，從而減少了對WSC的消耗量^［23］。

纖維含量是評價青貯飼料的一個重要指標。水稻秸稈中擁有較高的粗纖維以及較低的可溶性碳水化合物含量，不利于動物的采食和干物質消化率，對動物生產性能也會產生影響^［20］。本試驗中，CF，NDF和ADF含量在添加CS的作用下均有所降低，尤其NDF和ADF含量顯著低于對照組，這或許是因為纖維素降解菌在青貯過程中的酶解作用改變了水稻秸稈的細胞壁結構，持續對水稻秸稈中的纖維素和半纖維素進行降解^［34］。這與Lee等研究結果相似^［35］，他們發現在水稻秸稈青貯過程中添加含有纖維素降解活性的真菌，真菌能夠降解含木質素的植物結構，對纖維素和半纖維素的降解很有效，與對照組對比后，發現處理組均能降低青貯飼料的NDF和ADF含量。一般情況下，青貯后的NDF和ADF含量會比原料低。然而，本研究中發現青貯后高溫和常溫下的NDF和ADF含量均比原料高，37℃下添加纖維素降解菌的CF，NDF和ADF含量均低于28℃下儲存的青貯飼料。這可能是青貯過程中營養物質被消耗，導致干物質含量中纖維含量占比更大^［34-36］。高溫下有利于促進具有纖維素分解活性的細菌生長。因此，當水稻秸稈在高溫條件下，添加纖維素降解菌對青貯飼料纖維降解效果更佳。

4 結論

添加纖維素降解菌有助于水稻秸稈青貯飼料纖維素的降解，對青貯品質有一定的改善作用。本研究表明，纖維素降解菌的添加為青貯過程中微生物發酵提供了更多的發酵底物，兩種溫度條件下，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均顯著降低。常溫條件下能夠顯著增加乳酸含量和乳酸菌數量，顯著降低pH值，有利于改善水稻秸稈青貯飼料的發酵品質。總體而言，纖維素降解菌有助于降解纖維素，促進乳酸發酵，尤其在37℃條件下，水稻秸稈青貯的纖維降解效果更佳。

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（責任編輯 閔芝智）