不同生長期瓦尼桑黃和粗毛纖孔菌子實體主要活性成分含量比較

摘要 測定比較瓦尼桑黃和粗毛纖孔菌子實體不同產地及不同生長期粗多糖、總黃酮、總三萜、麥角甾醇的含量，結果表明，相同培養條件下，粗毛纖孔菌子實體在180 d采收時粗多糖含量最高，為4.52%；在60 d采收時總黃酮和麥角甾醇含量最高，分別為5.23和34.03 mg/kg；在30 d采收時總三萜含量最高，為0.61 mg/kg。3年生椴木栽培瓦尼桑黃子實體總三萜和麥角甾醇含量分別為0.17和5.86 mg/kg，顯著高于1年生子實體總三萜和麥角甾醇含量（0.06和1.90 mg/kg）。綜合比較，粗毛纖孔菌子實體活性成分含量優于瓦尼桑黃子實體。

關鍵詞 粗毛纖孔菌；瓦尼桑黃；子實體；活性成分；含量比較；生長期

中圖分類號 R 284 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）20-0160-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.039

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Comparison of the Content of Main Active Components in the Fruiting Bodies of Sanghuangporus vaninii and Inonotus hispidus in Different Growth Stages

GAO Yang，LIU Hao，LIAO Fang-zhou et al

（Research Institute of Forestry and Pomology， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384）

Abstract The content of crude polysaccharides， total flavonoids， total triterpenoids， and ergosterol in the fruiting bodies of Sanghuangporus vaninii and Inonotus hispidus in different origins and growth stages were measured and compared.The results showed that under the same cultivation conditions， the fruiting body of Inonotus hispidus had the highest crude polysaccharide content at 180 days of harvesting， which was 4.52%; at 60 days of harvesting， the total flavonoid and ergosterol contents were the highest， at 5.23 and 34.03 mg/kg， respectively; at 30 days of harvesting， the total triterpenoid content was the highest， at 0.61 mg/kg.The content of total triterpenes and ergosterol of fruiting bodies of Sanghuangporus vaninii cultivated by segment wood with 3 years were 0.17 and 5.86 mg/kg， respectively，which were significantly higher than those of 1 year fruiting body （0.06 and 1.90 mg/kg）.Overall， the content of active components of fruiting bodies of Inonotus hispidus was higher than that of Sanghuangporus vaninii.

Key words Inonotus hispidus;Sanghuangporus vaninii;Fruiting body;Active components;Content comparison;Growth stage

桑黃是一類具有珍貴價值的大型藥用真菌，享有“森林軟黃金”之美譽，在我國已有2 000多年的使用歷史，在《神農本草經》《本草綱目》《藥性論》等醫書中均有記載。伴隨著近些年研究進展，桑黃的生物學分類及對應的拉丁學名在經歷了歷史演變后已日漸清晰。當前關于桑黃生物學活性或藥用功能的研究對象主要是銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）的桑樹桑黃（Sanghuangporus sanghuang）、瓦尼桑黃［Sanghuangporus vaninii （Ljub.） L.W. Zhou & Y.C. Dai］、粗毛纖孔菌［Inonotus hispidus （Bull.） P. Karst］、火木層孔菌［Phellinus igniarius （L.） Quél］、裂蹄熱帶孔菌［（Tropicoporus linetus （Berk. & M.A. Curtis） L.W. Zhou & Y.C. Dai］等［1］。桑黃含有多糖類、黃酮類、香豆素、三萜類、氨基酸以及酶類等化學活性成分，現代醫學研究證實桑黃有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等功效，已成為國內外醫藥制劑與保健品行業研究與開發的熱點［2-5］。

粗毛纖孔菌被認為是傳統中藥中桑黃的正源，國內外大量研究表明粗毛纖孔菌集抗病毒、降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗炎抑菌等功能于一身［6-7］。瓦尼桑黃是目前生產和研究較多的桑黃品種，具有豐富的活性成分和良好的功效［8-9］。現在人工栽培的桑黃菌種主要包括瓦尼桑黃（Sanghuangporus vaninii）和粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus）。不同的采收時期、不同的栽培模式以及產地都會對桑黃主要活動成分產生影響，是影響桑黃子實體品質的重要因素［10］。該研究對不同生長期、不同產地瓦尼桑黃和粗毛纖孔菌子實體主要活性成分進行對比，測定其粗多糖、總黃酮、總三萜、麥角甾醇的含量，以期為桑黃質量評價和桑黃生產種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試瓦尼桑黃和粗毛纖孔菌子實體由山東省淄博市沂源縣臻紅桑黃農產品合作社提供。具體信息見表1。子實體經60 ℃干燥至恒重、粉碎后，過60目篩備用。

1.2 主要試劑 蘆丁、熊果酸、麥角甾醇，均為標準品；無水乙醇、硫酸、苯酚、葡萄糖、硝酸鋁、亞硝酸鈉、冰乙酸、香草醛、高氯酸，均為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試品提取物的制備。

1.3.1.1 粗多糖提取物制備。稱取5 g桑黃子實體粉末，加入150 mL蒸餾水混合均勻，在90 ℃水浴下浸提3 h，其間經常攪拌、冷卻，6 000 r/min離心15 min取上清液，沉淀部分再重復提取2次，合并上清液，將提取液旋轉蒸發濃縮至原體積的10%后，加入無水乙醇，使得溶液中的乙醇濃度為80%，4 ℃下靜置12 h，6 000 r/min離心15 min回收乙醇，取沉淀冷凍干燥，得粗多糖提取物。

1.3.1.2 總黃酮提取物制備。稱取5 g桑黃子實體粉末加70%乙醇70 mL，50 ℃回流提取4次，每次浸提3 h，合并上清液，抽濾去除雜質，用旋轉蒸發儀真空濃縮，回收乙醇，冷凍干燥，得總黃酮提取物。

1.3.1.3 總三萜提取物制備。稱取5 g桑黃子實體粉末加100 mL無水乙醇，80 ℃回流提取3次，每次浸提3 h，合并上清液，抽濾去除雜質，用旋轉蒸發儀在75 ℃、116 r/min，真空泵0.04～0.06 MPa條件下真空濃縮，回收乙醇，冷凍干燥，得總三萜提取物。

1.3.1.4 麥角甾醇提取物制備。精密稱取0.1 g桑黃子實體粉末，置于10 mL具塞試管中，精確加入無水乙醇10 mL，密塞，搖勻，超聲（工作功率200 W，頻率40 kHz）提取30 min，冷卻至室溫，補足失重，6 000 r/min 離心3 min，移取上清液，-20 ℃低溫保存備用。

1.3.2 活性成分含量的測定。

1.3.2.1 粗多糖含量測定。以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量［11］。將葡萄糖在105 ℃的烘箱中烘干至恒重，準確稱取80 mg葡萄糖溶解，定容至500 mL容量瓶中（濃度為160 μg/mL），取7根旋蓋試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖溶液，用蒸餾水定容至1 mL，然后加入6%苯酚溶液（現配現用）0.5 mL后，再加入濃硫酸3.5 mL，旋緊試管蓋，振蕩，沸水浴15 min，迅速涼水冷卻，放置5 min后在490 nm處比色測定吸光度，以吸光度為縱坐標、粗多糖濃度為橫坐標繪制粗多糖標準曲線，得出線性回歸方程（表2）。稱取一定量的粗多糖提取物樣品加蒸餾水定容，按樣品糖溶液∶6%苯酚溶液∶濃硫酸=1∶0.5∶3.5（V∶V∶V）的比例加入旋蓋試管，振蕩，沸水浴15 min，迅速涼水冷卻，放置5 min后在490 nm處比色測定吸光度，代入標準曲線回歸方程，得到樣品中粗多糖含量。

1.3.2.2 總黃酮含量測定。采用NaNO2-Al（NO3）比色法［12］，以蘆丁為標準品繪制標準曲線。準確稱取蘆丁標準物（蕓香葉苷，C27H30O16·3H2O）20 mg；用70%乙醇溶解，完全轉移至100 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容。分別移取上述蘆丁標液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于7支25 mL容量瓶中。加5%亞硝酸鈉溶液1.4 mL，搖勻，放置5 min；再加10%硝酸鋁溶液1.4 mL，搖勻，靜置5 min后加入4%氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻，用70%乙醇定容至刻度，10 min后在510 nm 處比色測定吸光度，以吸光度為縱坐標、總黃酮濃度為橫坐標繪制總黃酮標準曲線，得出線性回歸方程（表2）。稱取一定量的總黃酮提取物樣品加70%乙醇定容，超聲5 min， 按標準曲線繪制方法取樣品提取液，加入顯色試劑，在510 nm 處比色測定吸光度，代入標準曲線回歸方程，得到樣品中總黃酮含量。

1.3.2.3 總三萜含量測定。采用冰乙酸-香草醛分光光度法，以熊果酸標準品繪制標準曲線。精密稱取熊果酸標準品5.0 mg，用乙酸乙酯定容于50 mL容量瓶中，取7個旋蓋試管，分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL熊果酸標液，水浴100 ℃加熱揮去溶劑，然后分別加入新配制的4%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，在65 ℃水浴15 min后，冷卻至室溫，并加入5 mL冰乙酸，搖勻后放置15 min，在548 nm 處比色測定吸光度，以吸光度為縱坐標、總三萜濃度為橫坐標繪制總三萜標準曲線，得出線性回歸方程（表2）。稱取一定量的總三萜提取物樣品加乙酸乙酯溶解，超聲提取2 h（工作功率200 W，頻率40 kHz）后定容，過0.22 μm有機相濾膜，得到的濾液待測。按標準曲線繪制方法加入顯色試劑，在548 nm處比色測定吸光度，代入標準曲線回歸方程，得到樣品中總三萜含量。

1.3.2.4 麥角甾醇含量測定。參照李南臻等［13］的方法測定，略有改動。迅速精確稱取麥角甾醇標準品0.005 g，快速溶解于無水乙醇，定容至50 mL，即得到100 μg/mL麥角甾醇標準品母液。精密吸取母液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL用無水乙醇稀釋定容至10 mL，配制成5、10、20、30、40、50 μg/mL麥角甾醇標準系列溶液，-20 ℃避光保存備用。分別精密吸取配制好的各濃度麥角甾醇標準系列溶液于比色皿中，在波長292 nm下分別測定各標準溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標、麥角甾醇濃度為橫坐標繪制麥角甾醇標準曲線，得出線性回歸方程（表2）。將樣品提取液稀釋5倍，過0.22 μm微孔有機相濾膜得到濾液待測。按標準曲線繪制方法在292 nm 處比色測定吸光度，代入標準曲線回歸方程，得到樣品中麥角甾醇含量。

2 結果與分析

2.1 不同采收期粗毛纖孔菌子實體活性成分含量比較 從不同采收期粗毛纖孔菌子實體粗多糖、總黃酮、總三萜、麥角甾醇含量（圖1）可以看出，不同采收期（30、60、180 d）粗毛纖孔菌粗多糖、總黃酮和總三萜含量均存在明顯差異。粗多糖含量隨子實體生長不斷增加，30 d采收粗多糖含量為2.83%，60 d采收粗多糖含量為3.48%，在180 d采收時粗多糖含量最高，達到4.52%。

不同采收期粗毛纖孔菌子實體總黃酮含量和麥角甾醇含量均呈現先增加后降低的變化趨勢。黃酮類化合物由苯丙氨酸代謝途徑合成而來，具有多種生理活性功能。30、60、180 d采收時，粗毛纖孔菌子實體總黃酮含量分別為1.46、5.23、1.68 mg/kg，60 d采收時總黃酮含量最高，這個變化趨勢與張文雋等［14］報道的桑樹桑黃不同采收期的總黃酮含量變化一致，均是在60 d時總黃酮含量最高。麥角甾醇是真菌細胞膜的重要組分，是真菌類物質的標志性化合物，具有抗腫瘤、抗炎、降低膽固醇、治療偏頭痛等作用［15］。該試驗結果顯示，在30 d采收時粗毛纖孔菌子實體麥角甾醇含量僅為3.86 mg/kg，在60 d采收時麥角甾醇含量達到最高，為34.03 mg/kg，180 d采收時麥角甾醇含量為19.60 mg/kg。目前麥角甾醇常作為測定生物量的指標，因為在細胞死亡后，存在于細胞膜上的麥角甾醇會很快發生降解。從這個角度上看，粗毛纖孔菌在30 d采收時活性較低，處于初生階段，60 d 采收時活性旺盛，180 d采收時活性又下降。

不同采收期粗毛纖孔菌子實體總三萜含量呈現先減少后增加的變化趨勢。總三萜也是桑黃的主要功效成分，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝護肝、降血糖、提高免疫力和防治心腦血管系統疾病等功效。該試驗結果顯示，粗毛纖孔菌子實體在30 d采收時總三萜含量為0.61 mg/kg，在60 d 采收時總三萜含量降低為0.06 mg/kg，在180 d采收時總三萜含量為0.57 mg/kg，這與王偉科等［16］報道的瓦尼桑黃不同采收期總三萜含量變化一致，說明采收期對供試菌株子實體總三萜含量產生了顯著的影響。

2.2 不同產地、不同采收期瓦尼桑黃子實體活性成分含量比較 從表3可以看出，分別采自合作社山東基地（S1）和黑龍江基地（S2）的1年生椴木栽培瓦尼桑黃子實體總三萜和麥角甾醇含量差異不顯著，但山東基地1年生椴木栽培瓦尼桑黃子實體粗多糖、總黃酮含量明顯高于黑龍江基地1年生椴木栽培瓦尼桑黃子實體。不同生長時期瓦尼桑黃子實體活性物質存在顯著差異，3年生椴木栽培（S3）瓦尼桑黃子實體總三萜和麥角甾醇含量分別為0.17和5.86 mg/kg，顯著高于1年生（S1）子實體總三萜和麥角甾醇含量（0.06和1.90 mg/kg），但同一產地3年生椴木栽培（S3）瓦尼桑黃子實體粗多糖和總黃酮含量顯著低于1年生椴木栽培（S1）瓦尼桑黃子實體。

2.3 不同菌種桑黃子實體活性成分含量比較 從表3可以看出，瓦尼桑黃（S1～S3）和粗毛纖孔菌（S4～S6）2個試驗菌株子實體在活性成分含量上存在明顯差異。180 d采收的粗毛纖孔菌（S6）子實體粗多糖含量最高，為4.52%，1年生椴木栽培（S1）瓦尼桑黃子實體總黃酮含量最高，為10.06 mg/kg，30 d采收的粗毛纖孔菌（S4）子實體總三萜含量最高，為0.61 mg/kg，60 d采收的粗毛纖孔菌（S5）子實體麥角甾醇含量最高，為34.03 mg/kg。總體來看，粗毛纖孔菌子實體活性成分含量優于瓦尼桑黃子實體。

3 討論

桑黃作為重要的藥用真菌資源日益受到關注，桑黃產業不斷發展。自2009年至今，已有湖北、安徽、吉林、甘肅、浙江等省份陸續頒布了桑黃的相關地方標準以及種植的桑黃中藥飲片炮制規范，這對于桑黃產業發展起到了重要的促進作用。該試驗采用瓦尼桑黃和粗毛纖孔菌2個不同菌種子實體進行了不同采收期及產地的活性成分含量測定，結果顯示，不同菌種不同采收期及產地的桑黃子實體活性成分含量存在明顯差異，這可能與供試菌種的特性有關，桑黃在生長過程中受諸多因素影響，包括產地溫濕度、光照等環境因子、培養料營養情況、采收期長短，因此最終的試驗結果不能一概而論。伴隨著桑黃栽培技術的發展和成熟，篩選優良菌株始終是產業發展重要的基礎和保障。

粗毛纖孔菌子實體在顏色、質地等外觀及內在組織結構方面與瓦尼桑黃子實體有明顯不同，因此推測粗毛纖孔菌子實體生長發育進程也與其他桑黃有明顯差異。試驗結果顯示，粗毛纖孔菌子實體中有些活性成分優于瓦尼桑黃，180 d采收的粗毛纖孔菌子實體粗多糖含量最高，為4.52%，30 d采收的粗毛纖孔菌子實體總三萜含量最高，為0.61 mg/kg，尤其是60 d采收的粗毛纖孔菌子實體麥角甾醇含量達到34.03 mg/kg，顯示出較高的生物活性。因此，在實際應用中應選擇目標功效成分含量高的菌株；同時根據試驗結果也要注意到不同采收期對子實體活性成分的影響，過早或過遲均會影響活性成分含量，因此生產上要根據情況確定最佳采收期。今后應更加關注桑黃生理生化、活性標志物及其結構和作用機理、桑黃生物活性物質代謝機理及調控機制等基礎研究，才能更好地發揮桑黃這一寶貴資源價值、為人民生命健康服務。

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