綿羊肺源大腸桿菌cyaA基因的分子特征及抗原性分析

摘要：為研究綿羊肺源大腸桿菌cyaA基因的分子特征、抗原性及其遺傳進化關系，采用PCR技術對綿羊肺源大腸桿菌XJ10菌株的cyaA基因進行擴增、克隆并測序，應用定量PCR檢測cyaA基因在不同培養階段的mRNA表達量，利用在線軟件對其進行編碼蛋白分子特征、抗原性及其遺傳進化分析。結果顯示，cyaA基因全長2 547 bp，編碼848個氨基酸；cyaA基因在細菌對數期的mRNA表達量最高，其次是穩定期及遲緩期，在衰亡期的mRNA表達量最低；氨基酸序列分析發現，分子式為C4 389H6 759N1 193O1 273S30，理論分子質量為97.57 ku，理論等電點為5.82，為酸性親水性蛋白，穩定性較低；二級結構中α-螺旋、無規則卷曲、延伸鏈和β-折疊所占比例分別為42.81%、39.03%、14.27%和3.89%。AC蛋白無信號肽與跨膜區，保守結構域位于1～848位氨基酸，屬于腺苷酸環化酶超家族，具有14個開放閱讀框，存在81個磷酸化位點。AC蛋白B細胞優勢表位共16個，分別位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806區段；遺傳進化分析發現大腸桿菌 XJ10菌株AC蛋白與志賀氏菌AC蛋白相似性最高。本試驗結果為進一步研究大腸桿菌AC蛋白的功能及其作為大腸桿菌疫苗候選抗原奠定了基礎。

關鍵詞：綿羊肺源大腸桿菌；cyaA基因；分子特征；抗原性；遺傳進化

中圖分類號：S855.1+2 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）17-0058-07

收稿日期：2023-07-19

基金項目：新疆生產建設兵團重點領域科技攻關計劃（編號：2021AB012、2019AB029）。

作者簡介：操義恒（1997—），男，湖北孝感人，碩士，主要從事動物傳染病診斷與防治研究。E-mail：1050830806@qq.com。

通信作者：周 霞，博士，教授，主要從事人畜共患病致病機制與防控研究，E-mail：32123004@qq.com；黃 新，碩士，研究員，主要從事動物傳染病診斷與防治研究，E-mail：419824643@qq.com。

大腸桿菌（Escherichia coli，簡稱E.coli）是人獸共患條件致病的重要病原，也是適應能力和致病能力最強的細菌之一，在臨床中可導致多種宿主發生疾病，包括牛羊肺炎、禽類氣囊炎、心包炎、輸卵管炎、新生兒腦膜炎、菌血癥、敗血癥等疾病［1-4］。研究顯示，其攜帶脂多糖、毒素、黏附因子、外膜蛋白、毒力島等多種毒力因子，這些毒力因子幫助菌株定殖和入侵宿主組織細胞，更甚者對其造成損傷，此外一些毒力因子還能使菌株逃避宿主細胞吞噬作用，刺激宿主產生炎癥反應［5-7］。cyaA基因是許多細菌與毒力大小密切相關的重要基因之一，其編碼的腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）在大腸桿菌關于調節毒力方面具有重要作用。AC主要作用機制是催化腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）形成環腺苷酸（cyclic adenosine monophosaphate，cAMP），cAMP與受體蛋白（cAMP receptor protein，CRP）結合，形成CRP-cAMP復合體，可以調控大腸桿菌多數基因轉錄［8-11］。柴迎錦通過構建大腸桿菌XJ10菌株的cyaA基因缺失株，發現缺失株對昆明鼠的半數致死量顯著降低，黏附侵襲小鼠肺泡上皮細胞（TC-1細胞）的數量也顯著減少［12］。劉莎莎等研究發現，鼠傷寒沙門菌的cyaA基因缺失后菌株毒力顯著下降，黏附侵襲宮頸癌細胞（HeLa細胞）的菌量也顯著減少［13］。此外，有研究發現敲除cyaA基因的鼠傷寒沙門菌仍具有較好的免疫原性［14-15］。但是在大腸桿菌中cyaA基因編碼的AC蛋白的分子特征以及抗原性還不清楚。因此，本研究對綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因進行克隆、通過軟件分析編碼蛋白分子特征和理化性質、蛋白抗原表位和系統進化，以期為進一步探討大腸桿菌AC蛋白的功能及其作為大腸桿菌疫苗候選抗原奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑

本研究于2022年12月在新疆農墾科學院的畜牧獸醫研究所實驗室中進行試驗。試驗使用的大腸桿菌XJ10菌株由筆者所在實驗室的郭強強于2016年由呼吸衰竭死亡的綿羊肺臟中分離。DNA提取試劑盒、DL 4500 DNA Marker、反轉錄試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；TRIzol試劑，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×PCR Mix、qPCR試劑盒、pMD19-T載體，購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；DH5α感受態細胞由筆者所在實驗室-80 ℃保存。

1.2 引物設計與合成

參考文獻并根據GenBank中的大腸桿菌K-12 substr. MG1655的cyaA基因（登錄號：947755）序列為模板，采用Primer 5.0軟件設計特異性擴增引物［12］。引物信息見表1。

1.3 綿羊肺源大腸桿菌cyaA基因的克隆測序

純化單菌落在BHI營養肉湯中經37 ℃恒溫箱搖床振蕩培養12 h，收集菌液離心后用沉淀提取細菌DNA。以提取的DNA為模板，利用cyaA引物通過PCR擴增cyaA基因，擴增產物經瓊脂糖凝膠驗證為陽性條帶后，通過試劑盒膠回收，回收產物連接pMD19-T載體后轉化入DH5α感受態細胞內，通過菌液PCR進一步篩選，將陽性菌株送至通用生物（安徽）股份有限公司測序，測序結果輸入GenBank中進行比對。

1.4 綿羊肺源大腸桿菌在不同生長時間cyaA基因的轉錄水平檢測

吸取200 μL “1.3”節中過夜培養的菌液轉入20 mL BHI液體培養基中振蕩培養，分別于2 h（遲緩期）、5 h（對數期）、10 h（穩定期）、24 h（衰亡期）吸取2 mL菌液，經TRIzol法提取大腸桿菌XJ10 RNA，并反轉錄為cDNA，利用cyaA-in引物通過熒光定量PCR檢測菌株cyaA基因的mRNA轉錄水平。使用16S rRNA基因為內參基因，采用相對比較ΔCT（Qr=2-ΔΔCT）法計算cyaA基因的相對轉錄水平。

1.5 腺苷酸環化酶分子特征及理化性質分析

使用表2中的相關網頁對大腸桿菌AC蛋白的分子特征和理化性質、親疏水性、二三級結構、跨膜結構區、信號肽、保守結構域和開放閱讀框的位置、磷酸化位點、抗原性進行分析。

1.6 AC氨基酸序列系統進化分析

將大腸桿菌XJ10菌株的cyaA基因推導的AC氨基酸序列與GenBank中已知的10多株不同細菌的AC氨基酸序列進行比對。利用Mega 7.0軟件根據NJ（neighbor-joining）法構建系統進化樹（Bootstrap 值為1 000）。

2 結果與分析

2.1 cyaA基因的擴增、克隆及測序結果

由圖1可知，綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因擴增產物大小約2 547 bp，與預期片段大小相符，測序結果和大腸桿菌K-12 substr. MG1655菌株的cyaA基因相似性為100%。

2.2 綿羊肺源大腸桿菌在不同生長時期cyaA基因的轉錄水平分析

由圖2可知，綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因的轉錄水平在對數期的表達量最高，其與遲緩期、衰亡期的表達量差異在0.001水平上顯著，與穩定期的表達量差異顯著（P<0.05）；其次是穩定期，其與衰亡期的差異極顯著（P<0.01），再其次是遲緩期，在衰亡期的表達量最低。

2.3 腺苷酸環化酶理化性質分析

綿羊肺源大腸桿菌XJ10 cyaA基因全長 2 547 bp，編碼848個氨基酸，利用ProtParam分析大腸桿菌AC蛋白，結果顯示，大腸桿菌XJ10 的AC蛋白分子式為C4 389H6 759N1 193O1 273S30，總原子數為13 644，理論分子質量為97.57 ku，理論等電點5.82，為酸性蛋白，不穩定性指數為45.12，屬于不穩定蛋白。由表3可知，該蛋白由20種氨基酸組成，出現頻率較高的氨基酸殘基有Leu（12.4%）、Ser（7.4%）、Glu（7.1%）、Val（6.7%）和Arg（6.6%），出現頻率較低的氨基酸殘基有Trp（1.9%）、Met（1.8%）和Cys（1.8%），不含Pyl和Sec。總疏水性平均值（GRAVY）是-0.290，屬于親水性蛋白，通過ProtScale在線工具進一步預測發現，大腸桿菌XJ10的AC蛋白親水區域大于疏水區域，為親水性蛋白，與其預測結果一致（圖3）。

2.4 腺苷酸環化酶蛋白結構分析

利用SOPMA預測大腸桿菌XJ10 AC蛋白二級結構，結果（圖4）表明，大腸桿菌XJ10的AC蛋白二級結構由α-螺旋（42.81%）、β-折疊（3.89%）、延伸鏈（14.27%）和無規則卷曲（39.03%）組成。通過SWISS-MODEL預測大腸桿菌XJ10 AC蛋白三級結構，結果（圖5）表明，該蛋白序列與PDB數據庫中多功能毒力效應蛋白相似性最高為11.32%，該蛋白主要由α-螺旋所形成的三維立體結構組成。

2.5 腺苷酸環化酶信號肽、跨膜區及保守結構域分析

TMHMM預測大腸桿菌XJ10 AC蛋白跨膜區，由圖6-A可知，大腸桿菌XJ10 AC蛋白的序列無跨膜區域。通過SignaIP軟件分析大腸桿菌XJ10 AC蛋白信號肽，由圖6-B可知，大腸桿菌XJ10 AC蛋白無信號肽，屬于非分泌蛋白。NCBI分析大腸桿菌XJ10 AC蛋白的保守結構域和開放閱讀框的位置，由圖6-C、圖6-D可知，其保守結構域位于1～848位氨基酸，屬于腺苷酸環化酶超家族，具有14個開放閱讀框。

2.6 腺苷酸環化酶磷酸化位點預測

蛋白質磷酸化是常見的翻譯后修飾，可以很好地調控蛋白質的活性，在DNA損傷修復、細胞凋亡方面發揮重要作用。由圖7可知，NetPhos預測大腸桿菌XJ10 AC蛋白存在81個潛在的磷酸化位點，分別為55個絲氨酸磷酸化位點，20個蘇氨酸磷酸化位點，6個酪氨酸磷酸化位點。

2.7 腺苷酸環化酶抗原性預測分析

利用ABCpred和IEDB對大腸桿菌XJ10 AC蛋白氨基酸序列進行分析，得到B細胞表位序列，取其共有多肽序列，最終預測大腸桿菌XJ10 AC蛋白B細胞優勢表位16個，分別位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806區段（表4）。

2.8 腺苷酸環化酶遺傳進化分析

將大腸桿菌XJ10 cyaA基因序列推導的AC蛋白氨基酸序列與GenBank中已知的19多株不同種屬的腺苷酸環化酶序列進行比對分析，由圖8可知，大腸桿菌XJ10株的腺苷酸環化酶與志賀氏菌腺苷酸環化酶相似性最高，其次與鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯菌等相似性較高，在系統進化樹上處在一個分支。

3 討論與結論

AC最早是在大腸桿菌代謝相關的阻遏過程中發現，屬于膜整合蛋白，主要分布在細胞的各類膜上，包括細胞質膜、核膜和內質網膜。AC的氨基和羧基端朝向細胞質，膜胞質面有2個催化結構域和2個膜整合區，是一種轉錄激活蛋白［12，16］。細菌中的cAMP結合CRP后，CRP中的C螺旋和鉸鏈區結構發生變化，從而激活CRP家族的轉錄因子，cAMP-CRP復合體結合靶啟動子上的特異序列，使DNA結構變化彎曲，促使RNA聚合酶激活轉錄。此外，CRP作為一種全局調節因子，與cAMP結合活化后，可將某些質粒和毒力島整合到現有的調控網絡中，調控細菌相關基因的表達，從而增強細菌的致病力。有研究發現，在鼠疫耶爾森氏菌中，CRP直接激活纖溶酶原激活劑的表達，促進跳蚤叮咬后的鼠疫傳播，cAMP-CRP還能調節Ⅲ型分泌系統相關蛋白質的表達分泌，幫助細菌更易進入宿主細胞，造成宿主感染［17-18］。

隨著生物信息學技術與相關在線軟件的應用與發展，使本研究可更加直觀和全面地分析蛋白結構及其特征，簡單快捷地對各類蛋白進行鑒定，從而快速地表達純化蛋白，為研制開放新疫苗奠定基礎。本研究利用生物信息學在線軟件對大腸桿AC蛋白的分子特征和理化性質、親疏水性、二三級結構、跨膜結構區、信號肽、保守結構域和開放閱讀框的位置、磷酸化位點、抗原性進行分析。結果表明，大腸桿菌XJ10的AC是不穩定的親水性蛋白，不易與水分子形成氫鍵；二級結構中無規則卷曲的含量占比39.03%，利于嵌合抗體，具有很好的抗原潛力；無信號肽序列和跨膜區域表明AC蛋白可高效表達；蛋白保守結構域位于1～848位氨基酸，并且在不同種屬細菌內相對保守；存在81個潛在的磷酸化位點，可能參與細胞內信號傳導以及相關蛋白定位。

有研究發現，在我國4家百日咳疫苗生產廠中，有2個廠家產品含有較高含量的AC，并且AC更多地存在于菌體內而不是可溶性表達于培養液上清中［19］。百日咳桿菌的AC保護性免疫原性依賴于CyaC對983位賴氨酸的修飾，通過修飾影響蛋白分子構象，從而暴露出免疫優勢表位［20］。通過在AC的N-末端插入二肽，獲得無或低AC活性的AC，當修飾后的AC與無細胞百日咳疫苗共同免疫小鼠時，可提高無細胞百日咳疫苗的免疫原性，影響輔助性T淋巴細胞的分化，協助宿主清除肺部定殖的百日咳桿菌［21］。本研究利用生物信息學在線軟件ABCpred和IEDB對大腸桿菌XJ10 AC抗原表位進行預測，對兩者預測結果進行分析，共得到16個具有優勢的抗原表位區域，分別位于第44～51、61～65、248～250、259～267、296～304、355～366、436～439、456～456、476～481、489～490、540～559、589～597、634～640、717～722、766～773、806～806區段。以上結果可為大腸桿菌亞單位疫苗的研制提供參考依據。

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