基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討車前子治療高尿酸血癥的作用機(jī)制

［摘要］" 目的： 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討車前子治療高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的作用機(jī)制，以期為車前子治療高尿酸血癥的研究提供思路。方法： 根據(jù)前期對(duì)車前子入血成分研究結(jié)果確定車前子的潛在藥效成分，結(jié)合藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)（TTD）、人類在線孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)篩選高尿酸血癥的作用靶點(diǎn)，進(jìn)而確定成分與疾病的交集核心靶點(diǎn)，利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“成分靶點(diǎn)疾病網(wǎng)絡(luò)”，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路富集分析，再采用分子對(duì)接技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果： 共得到85個(gè)成分與疾病的交集靶點(diǎn)，包括胱天蛋白酶3（CASP3）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、雌激素受體1（ESR1）等，GO富集分析在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)層面上分別得到56、15和18個(gè)GO功能條目，KEGG通路富集分析得到腫瘤壞死因子、代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胰島素抵抗、缺氧誘導(dǎo)因子-1等信號(hào)通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示主要活性成分與核心靶蛋白間的結(jié)合性能較好；RT-qPCR結(jié)果表明，與模型組比較，車前子給藥組大鼠腎臟組織中Ras與p38 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01）。結(jié)論： 本研究建立了車前子干預(yù)高尿酸血癥的“成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)，為系統(tǒng)闡釋車前子治療高尿酸血癥的分子機(jī)制提供了參考。

［關(guān)鍵詞］" 車前子；高尿酸血癥；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接；作用機(jī)制

［中圖分類號(hào)］" R285.5；R589.7" ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］" A" ［文章編號(hào)］" 1671-7783（2024）05-0369-08

DOI： 10.13312/j.issn.1671-7783.y230307

［引用格式］王莉婷，劉湉，母磊鑫，等. 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討車前子治療高尿酸血癥的作用機(jī)制［J］. 江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）， 2024， 34（5）： 369-376，382.

［基金項(xiàng)目］國(guó)家中醫(yī)藥管理局高水平中醫(yī)藥重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（zyyzdxk-2023265）

［作者簡(jiǎn)介］王莉婷（1995—），女，碩士研究生；*：共同第一作者，博士研究生；馬群（通訊作者），研究員，博士生導(dǎo)師，E-mail： maqun99@126.com

Investigation the mechanism of Plantaginis Semen in the treatment of hyperuricemia based on network pharmacology and molecular docking

WANG Liting， LIU Tian*， MU Leixin， WANG Kaihe， KE Caiyi， JI Li， XU Guang， MA Qun

（School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 102488， China）

［Abstract］" Objective： To explore the mechanism of Plantaginis Semen （PS） in the treatment of hyperuricemia （HUA） based on network pharmacology and molecular docking technology， in order to provide ideas for the treatment of HUA. Methods： The active components of PS were determined according to reported data of previous studies， and the targets of HUA were screened in combination with TTD， OMIM and GeneCards databases， so as to determine the core targets of the intersection of ingredients and diseases. The components-target-disease network was constructed using Cytoscape software. GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed on the target， and the obtained results were verified by molecular docking technology and RT-qPCR technology. Results： A total of 85 common disease targets were obtained， and the core targets were CASP3， PPARG， IL-6， ESR1， etc. There were 56， 15 and 18 GO functional items obtained by GO enrichment analysis at the biological process， cytoomics and molecular function levels， respectively， and 44 pathways were obtained by KEGG pathway enrichment analysis， including TNF， metabolic signal transduction， insulin resistance， HIF-1 signaling pathway and so on. Molecular docking results showed that the binding performance between the main active ingredient and the core target was good. RT-qPCR verified the difference of Ras and p38 mRNA expression levels between the PS administration group and the model group （Plt;0.01）. Conclusion： In this study， the \"component-target-pathway\" network of PS for the treatment of HUA was established， which provides a reference for systematically elucidating the molecular mechanisms of PS in treating HUA.

［Key words］" Plantaginis Semen; hperuricemia; network pharmacology; molecular docking; mechanism

高尿酸血癥是一種由機(jī)體嘌呤代謝紊亂、尿酸代謝異常引起的慢性代謝性疾?。?］。隨著生活水平的提高，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年上升，目前已成為僅次于糖尿病的第二大代謝疾病，嚴(yán)重威脅人類健康［2］。中醫(yī)藥注重整體調(diào)節(jié)，對(duì)于高尿酸血癥等代謝性疾病的治療具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且中藥的安全性較高，停藥后不易復(fù)發(fā)［3］。中醫(yī)治療高尿酸血癥多以健脾化濕、降濁化瘀為法［4］，臨床常用藥物以利水滲濕藥為主，包括車前子、薏苡仁、土茯苓、萆薢、黃柏、牛膝等，其中車前子在實(shí)際應(yīng)用中的使用頻率極高［5-6］。

車前子為車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantago depressa Willd.的干燥成熟種子，味甘性寒，歸肝、腎、肺、小腸經(jīng)，功能清熱利尿通淋，滲濕止瀉，明目，祛痰［6］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)探討車前子治療高尿酸血癥的作用機(jī)制，以期為高尿酸血癥的治療提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 主要藥物與試劑

車前子藥材購(gòu)自北京仟草中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定為車前科植物車前Plantago asiatica L.的干燥成熟種子；苯溴馬隆（批號(hào)：107358，德國(guó)赫曼大藥廠）；氧嗪酸鉀（批號(hào)：C10555513，上海麥克林生化科技股份有限公司）；95%乙醇，分析純（北京化工廠有限責(zé)任公司）；DEPC水，RNA提取試劑盒，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；熒光定量PCR試劑盒（武漢愛博泰克生物科技有限公司）。

1.2" 藥物制備

氧嗪酸鉀溶液的制備：將氧嗪酸鉀用蒸餾水溶解制成濃度為15%的氧嗪酸鉀混懸液。車前子提取物的制備：取車前子藥材500 g，加8倍量65%乙醇加熱回流提取3次，每次2 h，過濾，將3次提取所得濾液混合，濃縮至500 mL，含生藥量1.0 g/mL，冷藏備用。苯溴馬隆溶液的配制：將藥片碾碎，加入蒸餾水溶解、混勻，配制成2 mg/mL的溶液。

1.3" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組給藥

健康雄性SD大鼠32只，體重（220±20）g，周齡6～7周，SPF級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCKY（京）2021-0011，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、苯溴馬隆組、車前子組，每組8只。采用連續(xù)28 d灌胃氧嗪酸鉀的方法建立大鼠高尿酸血癥模型，于給藥前1 h，按照1.5 g/kg劑量，對(duì)大鼠灌胃給予氧嗪酸鉀，對(duì)照組灌胃給予相應(yīng)體積的蒸餾水。苯溴馬隆組、車前子組的給藥劑量分別為0.01 g/kg和3.75 g/kg，1次/d，共28 d。給藥劑量根據(jù)課題組前期研究結(jié)果而確定［7］，前期研究分別設(shè)置了給藥劑量為0.937 5、1.875和3.75 g/kg組進(jìn)行比較，結(jié)果表明3.75 g/kg組的降尿酸效果最好，因此確定車前子組的給藥劑量為3.75 g/kg。造模第28天，腹主動(dòng)脈取血，取左腎放入4%多聚甲醛中固定，之后經(jīng)過脫水、包埋、切片處理，再進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察，通過觀察腎臟組織病理變化判斷造模是否成功。右腎放入液氮罐中速凍，取材結(jié)束后放入-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存，備用。

1.4" 車前子成分靶點(diǎn)的篩選

基于前期對(duì)車前子入血移行成分的研究結(jié)果［8］，選取車前子中的熊果酸、毛蕊花糖苷、α-亞麻酸、阿魏酸、高車前苷、京尼平苷酸、咖啡酸、木犀草苷、檸檬酸、芹菜素、車前素A、異毛蕊花糖苷、桃葉珊瑚苷進(jìn)行研究，通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取成分的2D結(jié)構(gòu)的.sdf格式文件。將成分2D結(jié)構(gòu)的.sdf格式文件導(dǎo)入Swiss Target Prediction平臺(tái)（http：//www.swisstargetprediction.ch/），物種屬性選擇“Homo sapiens”，收集入血移行成分的所有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，篩選符合Probabilitygt;0.05的候選靶點(diǎn)。同時(shí)，將入血移行成分通過PharmMapper平臺(tái)（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）目標(biāo)集選擇“Human Protein Targets Only”進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將兩平臺(tái)預(yù)測(cè)得到的靶點(diǎn)信息進(jìn)行合并，提取靶蛋白、靶基因名稱。

1.5" 高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)的篩選

以“hyperuricaemia”和“hyperuricemia”為關(guān)鍵詞，通過TTD（https：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM（https：//www.omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)搜集高尿酸血癥的相關(guān)靶點(diǎn)。根據(jù)Score值中位數(shù)對(duì)疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行篩選。查閱相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集得到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充，組成高尿酸血癥作用靶點(diǎn)庫(kù)。

1.6" 共有靶點(diǎn)分析及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將車前子入血移行成分的靶點(diǎn)與高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，得到成分疾病共有靶點(diǎn)。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5平臺(tái)（http：//string-db.org），將生物種類設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“medium confidence（0.4）”，其余均為默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建車前子成分高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI）。

將交集靶點(diǎn)PPI結(jié)果以.tsv格式文件下載，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，利用軟件內(nèi)置的Network Analyzer分析工具分析交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值，并以接近中心性、中介中心性、度中心性3個(gè)參數(shù)的中位數(shù)為篩選條件，篩選靶點(diǎn)并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7" 靶點(diǎn)的GO富集分析與KEGG通路富集分析

將篩選得到的車前子治療高尿酸血癥的靶點(diǎn)上傳到DAVID網(wǎng)站（http：//david.ncifcrf.gov/），進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。

1.8" 車前子治療高尿酸血癥的“成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）排名，選取FDR值排名前20位的信號(hào)通路，利用Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建“成分靶點(diǎn)通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.9" 分子對(duì)接模擬

通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載車前子入血成分的3D結(jié)構(gòu)的.sdf格式文件，處理獲得配體文件。選取車前子入血移行成分高尿酸血癥關(guān)鍵靶點(diǎn)作為靶蛋白。通過蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)資料數(shù)據(jù)庫(kù)（RCSB PDB，http：//www.rcsb.org/）下載關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)文件，并利用Pymol軟件對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行水分子去除、結(jié)合配體小分子去除及非極性氫添加等處理，得到受體文件。使用AutoDock Vina軟件進(jìn)行入血成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接，以最低集合效能評(píng)價(jià)成分與靶點(diǎn)之間的結(jié)合能力。

1.10" 大鼠腎臟組織中Ras與p38 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

取大鼠腎臟組織，使用RNA分離試劑盒從腎臟組織中分離總RNA，用分光光度法測(cè)定RNA的濃度與純度，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)Ras和p38 mRNA的表達(dá)水平，以20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共44個(gè)擴(kuò)增循環(huán)。RT-qPCR引物：Ras上游5′-GAGTACAGTGCAATGAGGGAC-3′，下游5′-CCTGAGCCTGTTTTGTGTCTAC-3′；p38上游5′-TGTTCTGTCCATCCCACTTCA-3′，下游5′-TGCCATCACAATGACTTCCA-3′，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.11" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" 結(jié)果

2.1" 車前子成分靶點(diǎn)的篩選

通過Swiss Target Prediction與PharmMapper平臺(tái)對(duì)車前子入血移行成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，分別得到280和432個(gè)靶點(diǎn)。將兩平臺(tái)得到的靶點(diǎn)進(jìn)行合并，去除重復(fù)項(xiàng)，最終共得到603個(gè)靶點(diǎn)。

2.2" 高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)的篩選

以“hyperuricemia”和“hyperuricaemia”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索分別得到773和102個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)，合并，去除重復(fù)項(xiàng)后得到789個(gè)疾病相關(guān)靶點(diǎn)。通過TTD、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選及文獻(xiàn)檢索，對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集得到的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充，最終共得到804個(gè)高尿酸血癥相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3" 車前子成分高尿酸血癥疾病的共有靶點(diǎn)分析及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在jvenn網(wǎng)站（https：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html）獲得車前子入血移行成分的靶點(diǎn)，與高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)取交集，得到成分與疾病共有靶點(diǎn)85個(gè)，為車前子治療高尿酸血癥的潛在靶點(diǎn)。

將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.5平臺(tái)，構(gòu)建車前子成分高尿酸血癥疾病靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，以網(wǎng)絡(luò)“節(jié)點(diǎn)（Node）”表示靶點(diǎn)，以“邊（Edge）”表示靶點(diǎn)之間的關(guān)系。對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，共涉?1個(gè)節(jié)點(diǎn)，622條邊（圖1），篩選2次，分別得到30個(gè)核心節(jié)點(diǎn)（表1）與8個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

2.4" 靶點(diǎn)的GO富集分析與KEGG通路富集分析

對(duì)車前子治療高尿酸血癥的85個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，以FDR小于0.05為篩選條件，在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三個(gè)層面上分別得到56、15和18個(gè)GO功能條目，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，車前子主要參與藥物反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、含嘌呤化合物回收、對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)等生物過程。潛在靶點(diǎn)的細(xì)胞組分主要富集在胞質(zhì)、細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外間隙等。潛在靶點(diǎn)的分子功能主要富集在藥物結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等。

KEGG通路分析篩選得到腫瘤壞死因子、代謝信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胰島素抵抗、缺氧誘導(dǎo)因子1、5-羥色胺能突觸、色氨酸代謝、2型糖尿病、磷脂酰肌醇3-激酶、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等44條信號(hào)通路（圖2）。

2.5" 車前子治療高尿酸血癥的“成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將富集得到的FDR值排名前20的通路及其映射的57個(gè)靶點(diǎn)、13個(gè)車前子入血移行成分導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建“成分靶點(diǎn)通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）。該網(wǎng)絡(luò)由90個(gè)節(jié)點(diǎn)、613條邊組成，其中紫色節(jié)點(diǎn)代表入血移行成分，綠色節(jié)點(diǎn)代表作用靶點(diǎn)，黃色節(jié)點(diǎn)代表通路，各個(gè)節(jié)點(diǎn)之間通過邊相連。結(jié)果表明，車前子治療高尿酸血癥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)。

2.6" 車前子入血移行成分與關(guān)鍵靶蛋白的分子對(duì)接結(jié)果

將入血移行成分與8個(gè)關(guān)鍵靶蛋白分別進(jìn)行分子對(duì)接，通過結(jié)合能評(píng)價(jià)化合物與蛋白的結(jié)合情況，小于0說明配體與受體間能夠自發(fā)結(jié)合，數(shù)值越小表示結(jié)合能力越強(qiáng)。一般結(jié)合自由能小于-5 kcal/mol時(shí)，認(rèn)為成分與蛋白結(jié)合穩(wěn)定。其中，只有檸檬酸與CASP3、ESR1、PPARA、ALB對(duì)接以及熊果酸與PPARA對(duì)接的能量大于-5 kcal/mol，其余均小于-5 kcal/mol，表明車前子入血移行成分與關(guān)鍵靶蛋白的結(jié)合穩(wěn)定，結(jié)果如表2所示。8個(gè)關(guān)鍵靶蛋白與各自結(jié)合性最好的入血移行成分對(duì)接模式圖見圖4。

2.7" 車前子改善高尿酸血癥大鼠腎臟組織的病理狀態(tài)

大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組的腎臟組織結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，未見尿酸結(jié)晶、系膜增生和腎小球分節(jié)，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。與對(duì)照組相比，模型組腎組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重異常，可見部分腎小球分葉，系膜增生，部分腎小管可見蛋白管型，部分位置有尿酸鹽結(jié)晶，并伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多。與模型組相比，苯溴馬隆組和車前子組的組織病理狀態(tài)表現(xiàn)出不同程度的改善，特別是在腎小管與腎小球損傷以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)方面（圖5）。

2.8" 車前子上調(diào)高尿酸血癥大鼠腎臟組織中Ras、p38 mRNA的表達(dá)水平

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎臟組織中Ras、p38 mRNA的表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05或Plt;0.01）；與模型組相比，車前子組大鼠腎臟組織中Ras、p38 mRNA的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），表明車前子能夠上調(diào)高尿酸血癥大鼠腎臟組織中Ras、p38 mRNA的表達(dá)水平。

3" 討論

高尿酸血癥是一種由于機(jī)體嘌呤代謝紊亂而引起血尿酸水平高于正常水平的慢性代謝性疾病，目前臨床應(yīng)用的降尿酸藥物主要包括尿酸生成抑制劑、促尿酸排泄類藥以及促尿酸溶解類藥［9］，但以上降尿酸藥物具有一定的不良反應(yīng)，長(zhǎng)期服用會(huì)對(duì)身體造成傷害，因此，尋找安全有效的防治高尿酸血癥的策略具有重要臨床意義。課題組前期研究表明［7］，車前子可有效降低高尿酸血癥大鼠的尿酸水平，但車前子治療高尿酸血癥的作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于其系統(tǒng)性與整體性的特點(diǎn)，為探究中藥復(fù)雜體系作用于疾病的分子機(jī)制提供了新思路。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)對(duì)車前子治療高尿酸血癥的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探究。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析篩選得到車前子治療高尿酸血癥的85個(gè)潛在靶點(diǎn)，富集得到89個(gè)GO條目和44條信號(hào)通路。研究表明，高尿酸血癥與炎癥、脂質(zhì)代謝、腎臟疾病、糖尿病等密切相關(guān)［10-11］。在富集到的信號(hào)通路中，TNF信號(hào)通路、NOD樣受體蛋白信號(hào)通路和PI3K-Akt信號(hào)通路均在炎癥反應(yīng)中有重要作用。TNF抑制劑會(huì)使系統(tǒng)性自身免疫性風(fēng)濕病患者的血清尿酸水平升高，與全身炎癥反應(yīng)相關(guān)［12］。NOD樣受體蛋白3信號(hào)通路與血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎性因子的釋放有關(guān)，研究表明該通路可被丙酮酸乙酯抑制，進(jìn)而使血管內(nèi)皮細(xì)胞中炎性因子釋放減少［13］。研究發(fā)現(xiàn)尿酸可通過激活過表達(dá)蛋白激酶活化受體2（PAR2），使PI3K/AKT/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而加重人腎小管上皮細(xì)胞的炎癥損傷，而敲減PAR2可使上述通路下調(diào)從而減輕炎癥損傷［14］。本課題組前期研究表明［7］，車前子可能通過介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮降尿酸的作用。李東東等［15］研究表明，降尿酸方可減少尿酸鹽結(jié)晶的沉積，使腎臟炎癥減輕，其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。脂肪細(xì)胞分泌的炎癥因子可以使胰島素的生理作用受到干擾，與富集得到的胰島素抵抗信號(hào)通路有關(guān)［16］。Yu等［17］研究發(fā)現(xiàn)miR-92a-KLF2-VEGFA軸可能是高尿酸血癥治療的靶點(diǎn)，表明高尿酸血癥與VEFG通路有關(guān)。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)IL-6、CAT、TNF和PPARA與車前子入血移行成分木犀草苷的結(jié)合能最低。木犀草苷是具有多種生物活性的黃酮類成分，具有解熱抗炎、降低膽固醇、抗氧化、抗病毒等生物活性［18］。黃冠華［19］研究發(fā)現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)尿酸水平與炎癥因子IL-6、IL-1β及TNF-α水平均具有相關(guān)性。尿酸酶可以將尿酸分解為尿囊素與過氧化氫，從而降低體內(nèi)尿酸水平。CAT可促進(jìn)過氧化氫的分解，清除體內(nèi)蓄積的過氧化氫，進(jìn)而間接起到促進(jìn)尿酸分解的作用［20］。PPARA在肝臟中控制脂肪酸的氧化、結(jié)合與活化等多種代謝過程［21］。課題組前期研究表明［7］，甘油磷脂代謝途徑與車前子干預(yù)尿酸機(jī)制密切相關(guān)。因此，PPARA可能通過脂質(zhì)代謝途徑干預(yù)體內(nèi)尿酸水平。

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)車前子治療高尿酸血癥的作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路進(jìn)行分析，初步探究車前子治療高尿酸血癥的作用機(jī)制。結(jié)果表明，車前子入血成分與高尿酸血癥有85個(gè)共有靶點(diǎn)，經(jīng)PPI拓?fù)浞治?，篩選得到了ALB、TNF及IL-6等8個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。將主要成分與8個(gè)關(guān)鍵靶蛋白分別進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示主要成分與關(guān)鍵靶蛋白結(jié)合穩(wěn)定。同時(shí)，利用車前子入血成分與高尿酸血癥的共有靶點(diǎn)進(jìn)行生物富集分析及通路分析，發(fā)現(xiàn)85個(gè)共有靶點(diǎn)主要參與氧化還原、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)等生物進(jìn)程，調(diào)控TNF、HIF-1、PI3K-Akt、VEGF等信號(hào)通路，并采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了VEGF通路上Ras、p38 mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步證明了車前子對(duì)VEGF通路的影響。綜上，車前子對(duì)高尿酸血癥的調(diào)控具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)，本研究可為高尿酸血癥的研究提供參考。

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［收稿日期］" 2023-12-22" ［編輯］" 郭" 欣