肉串制品中豬牛羊源性成分多重熒光PCR檢測方法研究

摘要 ［目的］建立畜類肉串產品中常見的黃牛、綿羊和豬源性成分的多重熒光PCR檢測方法，實現肉串制品中動物源性成分的快速鑒別。［方法］比較磁珠法和柱膜法對肉糜組織中DNA的提取效果，優化實時熒光PCR多重檢測方法，比較58、60 ℃ 2個退火溫度下黃牛、綿羊、豬源性成分擴增效果。［結果］試驗采用的2種DNA提取方法效果相似，DNA溶液的A260/A280值均能滿足PCR檢測要求;58 ℃為最優退火溫度，此時黃牛、綿羊、豬源性成分均能有效擴增，且最低檢出的DNA濃度均為10-3 ng/μL。方法中用到的引物和探針特異性較好，均未產生非特異性擴增。［結論］試驗建立的黃牛、綿羊和豬源性成分的多重PCR檢測方法能為肉制品中動物源性成分的快速定性分析提供方法參考。

關鍵詞 黃牛;綿羊;豬;源性成分;實時熒光多重PCR

中圖分類號 TS251.7 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）18-0184-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.18.039

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Detection Method for Pig，Cow and Sheep Derived Components by Multiple Fluorescence PCR in Meat Skewer Products

YAO Yan-ling，ZHOU Yu-dong，WANG Wen-yu et al

（Jiaxing Testing Institute for Food，Drug and Product Quality Control，Jiaxing，Zhejiang 314050）

Abstract ［Objective］To establish a multiple fluorescence PCR detection method for common cattle，sheep and pig derived components in animal meat skewer products，and to achieve rapid identification of animal derived components in meat skewer products.［Method］Compared the extraction effect of DNA from meat mince tissue using magnetic bead method and column membrane method，optimized the real-time fluorescence PCR multiple detection method，and compared the amplification effect of cattle，sheep，and pig derived components at two annealing temperatures of 58 and 60 ℃.［Result］The two DNA extraction methods used in the experiment had similar effects，and the A260/A280 values of the DNA solution could meet the requirements of PCR detection.58 ℃ was the optimal annealing temperature，at which point the cattle，sheep and pig derived DNA could be effectively amplified，and the lowest detected DNA concentration was 10-3 ng/μL.The primers and probes used in the method had good specificity and had not produced non-specific amplification.［Conclusion］The multiplex PCR detection method established by the application scope experiment for cattle，sheep and pig origin can provide a method reference for rapid qualitative analysis of animal origin components in meat products.

Key words Cattle;Sheep;Pig;Derived component;Real-time fluorescence multiplex PCR

基金項目 浙江省市場監督管理局雛鷹計劃培育項目（CY2023322）。

作者簡介 姚艷玲（1980—），女，浙江嘉興人，高級工程師，碩士，從事食品微生物及分子生物檢測研究。

收稿日期 2023-10-28

燒烤食品近年來備受年輕人喜愛，尤其以豬、牛、羊等畜肉類肉串最為常見，因其含有多種維生素、氨基酸，且燒烤口味鮮美，深受年輕人青睞，也豐富了人們的餐桌文化。隨著市場上豬肉、牛肉和羊肉價格差距的拉大，某些商販在肉制品加工過程中摻假售假，通過牛羊油浸泡，或者牛羊類香精香料及調味料添加等方式處理后，冒充牛、羊肉進行銷售，損害了消費者利益，也給食品安全帶來了風險。目前，食品中動物源性成分的鑒定主要是通過形態學、細胞學、生物化學、酶聯免疫吸附法（ELISA）、紅外光譜技術等［1-3］，隨著聚合酶鏈式反應（PCR）技術的快速發展，動物源性的鑒別檢驗也有了相關研究。在動物源性定量檢測方面，有研究者通過PCR技術、定量PCR技術或者數字PCR技術對肉制品和其他食品中的豬、牛、羊、兔等動物源性成分進行定量檢測分析［4-12］;在定性檢測方面，采用探針法PCR技術、SYBR實時熒光PCR技術、PCR可視化檢測技術等對肉制品的動物源性成分進行多重檢測研究［13-21］。

上述研究在肉源性鑒別方面有了較大的進展，但由于大多研究立足于生鮮肉制品，而針對市場上常見的經過調味料腌制的肉串制品的摻假研究較少，且部分調味料對DNA模版提取及PCR檢測過程中存在一定的干擾，影響檢測結果的準確性。因此，筆者以豬、牛、羊源性肉串制品為研究對象，建立多重實時熒光PCR快速檢測方法，為日常肉串產品的快速篩查提供方法參考，滿足肉制品監管需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑。

DNA Extraction Kit Ver.5.0［寶生物工程（大連）有限公司］，Prepito DNA Tissue 10 Kit［鉑金埃爾默醫學診斷產品（上海）有限公司］。實時熒光PCR試劑為Premix Ex TaqTM PCR預混試劑［寶生物工程（大連）有限公司］。試驗用水為一級純化水。

1.1.2 引物探針。

該研究采用的黃牛、綿羊和豬的引物、探針見表1，參考國家標準GB/T 38164—2019，根據儀器檢測通道，設計探針，引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.3 儀器設備。

Roche LightCycler 480Ⅱ實時熒光定量PCR，羅氏診斷產品（上海）有限公司;全自動核酸提取儀，鉑金埃爾默醫學診斷產品（上海）有限公司;Nanodrop one超微量分光光度計，賽默飛世爾科技（中國）有限公司;MK 10干式恒溫器，杭州奧盛儀器有限公司;Legend Micro 21R離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA模板提取。由于該試驗針對的樣品為經過腌制的肉串制品，因此從市場上采購了經調味料腌制的黃牛肉串。該肉串樣品處理分為2組，一組樣品在DNA提取前，先用70%乙醇進行浸泡，然后用純化水進行多次漂洗，除去大部分調味料，還原肉組織的原色，再進行DNA提取;另一組不做任何處理，直接提取DNA。同時把已知黃牛肌肉組織作為對照組，比較3組樣品的DNA提取效果。

該試驗比較了磁珠法和柱膜法對動物組織DNA的提取效果。磁珠法采用的是全自動核酸提取儀進行DNA提取，分別稱取上述3組樣品各10 mg，加入裂解液和蛋白酶K后，經56 ℃裂解，直到組織完全溶解，把裂解液加入深孔板中，用全自動核酸提取儀進行DNA提取。柱膜法則使用商品化的試劑盒進行手工提取，分別稱取上述3組樣品各20 mg于1.5 mL離心管中，加裂解液、蛋白酶K和RNase A，經56 ℃溫育3 h后，吸上清液于新的1.5 mL離心管中，加200 μL緩沖液和200 μL無水乙醇，充分混勻，然后將液體全部加入吸附小柱內，將吸附小柱裝入配套收集管中，按試劑盒說明書進行DNA提取。用超微量核酸測定儀檢測DNA溶液的濃度和純度。

1.2.2 多重熒光PCR檢測方法的建立。

根據試驗設計，把3種動物源性的上、下游引物（10 μmol/L）分別按等體積混合，制成上、下游混合引物，同時把3種動物源性的探針（10 μmol/L）也按等體積混合，制成混合探針。反應體系配制：Premix Ex TaqTM PCR預混試劑10.0 μL，上、下游混合引物各0.4 μL，混合探針0.8 μL，模板DNA為2.0 μL，反應體系共20 μL，剩余體積用無菌去離子水補足。PCR反應擴增條件：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性 5 s，退火溫度58 ℃，延伸1 min，共40個循環。

1.2.3 靈敏度試驗。

取黃牛、綿羊和豬3種肌肉組織中提取的DNA溶液，

以10倍系列稀釋的方法，用純化水分別稀釋至10、100、10-1、10-2、10-3、10-4 ng/μL，用制成的DNA溶液進行靈敏度試驗。

1.2.4 特異性試驗。

選取黃牛、牦牛、山羊、綿羊和豬5種常見畜類動物的肉糜，按質量等比例混合后，提取混合DNA模板，配制反應體系、設置PCR反應條件，對3種目標動物源性成分的引物和探TxDgUgYTeTTroSr9f1+Sfg==針進行特異性試驗。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

按照“1.2.1”方法提取DNA，比較2種方法對肌肉組織中DNA的提取效果，每種方法做6個平行試驗，計算樣品中DNA濃度、A260/A280的平均值，結果見表2。由表2可知，2種方法提取的DNA效果較為接近。但是未經預處理的肉制品組織中提取DNA溶液的A260/A280值不能滿足PCR檢測需要，說明肉串中的各種調味料對DNA提取或檢測存在一定干擾。因此，經調味料腌制過的樣本在提取DNA之前需經過預處理，其提取效果才能滿足PCR檢測需求。該試驗后續檢測用DNA模板均采用柱膜法提取。

2.2 多重熒光PCR檢測分析

為了能同時對黃牛、綿羊和豬3種動物源性成分進行多重檢測，在設計探針時選取FAM、CY5和VIC這3個通道，并優化檢測方法。根據“1.2.2”配制反應體系，把3對引物和3個探針等比例混合，配制成混合引物和混合探針，并比較了58、60 ℃ 2種常用退火溫度下的擴增效果。結果顯示，在退火溫度60 ℃時，黃牛和豬源性成分均能有效擴增，但綿羊源性成分擴增效果不佳；在退火溫度為58 ℃時，3種目標物源性成分均能有效擴增。綿羊源性成分在2種退火溫度下的擴增結果圖1。因此，在混合體系下，退火溫度設置為58 ℃，黃牛、綿羊和豬3種動物源性成分均能有效擴增。

2.3 靈敏度試驗

試驗將黃牛、綿羊和豬的DNA溶液均稀釋至10 ng/μL，然后按照10倍稀釋梯度進行稀釋，制成100、10-1、10-2、10-3、10-4 ng/μL的DNA混合梯度稀釋液，在混合體系下，退火溫度設置為58 ℃進行試驗，每個濃度擴增時做3個平行試驗，擴增結果見圖2。

擴增后Ct值的平均值結果見表3。由表3可知，當DNA濃度從100 ng/μL逐漸降低至10-3 ng/μL時，黃牛、綿羊和豬源性成分在多重檢測體系中均擴增良好；當DNA濃度為10-4 ng/μL 時，3種目標物源性成分的Ct值均超過35.00。因此，試驗建立的多重檢測方法中黃牛、綿羊和豬源性成分的方法檢出限均為10-3 ng/μL。

2.4 特異性試驗

選取黃牛、牦牛、山羊、綿羊和豬5種畜類動物的肉糜，按質量等比例混合后，提取DNA溶液，在黃牛、綿羊和豬的混合檢測體系中進行特異性試驗，結果見圖3～5。

由圖3～5可知，通過該研究建立的多重熒光PCR檢測方法能在常見的動物源性肉制品混合DNA溶液中檢出目標黃牛、綿羊和豬源性成分，而其余非目標源性成分均未檢出。可見，該方法建立的多重檢測體系采用的引物和探針特異性

較好，未出現非特異性擴增，能實現多重快速檢測。

2.5 肉串樣本檢測

以市場上采購的12批牛肉串和12批羊肉串為樣本，按試驗建立的方法進行源性成分鑒定分析，同時按照國家標準GB/T 38164—2019分別進行檢測。結果顯示，12批次牛肉串樣品中均檢出牛源性成分，其中有2批樣本也同時檢出了豬源性成分;12批次羊肉串中都檢出了羊源性成分，其中有5批同時檢出了豬源性成分。采用國標法檢測結果與該試驗建立的方法一致。

3 討論

該試驗以市場上常見的經調味或腌制的牛肉、羊肉和豬肉串為研究對象，對肉串制品進行預處理后，采用實時熒光PCR檢測技術，建立了黃牛、綿羊和豬的多重熒光PCR的定性檢測方法，方法的檢出限達到10-3 ng/μL。該法的引物、探針特異性較好，建立的多重檢測體系能有效地對混合肉制品樣本中的黃牛、綿羊和豬源性成分進行定性鑒別，為動物源性成分的多重鑒定分析提供方法參考。

采用該研究建立的多重檢測方法對市場上的烤肉串進行檢測，結果顯示部分肉串制品中檢出多種源性成分，推測原因主要有：市場上采購的畜禽肉產品及其加工制品，在生產加工過程中加入牛風味、羊風味等香精香料滾揉進了肌肉組織內;有些肉串為多種源性肉組織混合加工;或者有些產品在加工過程中使用的工器具未按產品類別分開使用，存在

交叉污染，使得通過PCR技術檢測源性成分時，存在多種動物源性都被檢出的情況，一定程度上影響了真實源性成分的

判斷。因此，在動物源性成分鑒別分析時，除了定性檢測以

外，還應該引入定量分析方法，只有2種方法結合應用，才能更準確地反映肉制品的真實來源。

參考文獻

［1］

陳正芳，曾萍，楊具田，等.動物源性食品中豬源性成分檢測［J］.中國農學通報，2015，31（36）：259-264.

［2］ VON HOLST C，HONIKEL K O，UNGLAUB W，et al.Determination of an appropriate heat treatment of animal waste using the ELISA technique：Results of a validation study［J］.Meat science，2000，54（1）：1-7.

［3］ 王小燕，王錫昌，劉源，等.近紅外光譜技術在食品摻偽檢測應用中的研究進展［J］.食品科學，2011，32（1）：265-269.

［4］ SANTOS C G，MELO V S，AMARAL J S，et al.Identification of hare meat by a species-specific marker of mitochondrial origin［J］.Meat science，2012，90（3）：836-841.

［5］ 翟曉虎，李翎旭，陳小竹，等.肉中豬源性成分Real-time PCR定量檢測技術［J］.中國農業科學，2023，56（1）：156-164.

［6］ 劉艷，王鳴秋，李詩瑤，等.基于實時熒光定量PCR和數字PCR的肉制品中牛源性成分檢測［J］.現代食品科技，2019，35（7）：254-260.

［7］ 史瑩瑩，康雨薇，邵俊鋒，等.實時熒光定量PCR鑒定肉制品中牛源性成分及其含量［J］.食品研究與開發，2020，41（6）：158-163.

［8］ 酈娟，董華夏，張珣，等.基于熒光定量PCR法鑒定嬰幼兒配方羊奶粉中牛源性成分［J］.中國乳品工業，2018，46（9）：47-49.

［9］ 趙新，陳銳，劉娜，等.基于單拷貝核基因的數字PCR定量檢測肉制品中羊源性成分［J］.食品工業科技，2021，42（6）：260-264，281.

［10］ 高志強，汪琳，蒲靜，等.雙重實時熒光PCR定量檢測動物產品中牛源性成分［J］.生物技術通報，2018，34（9）：190-194.

［11］ AMPAPORN K，PHASUK Y，DUANGJINDA M.Droplet digital polymerase chain reaction assay for identifying and quantifying pork products［J］.Animal science journal，2021，92（1）：e13595.

［12］ 張誼，湯思凝，梅汝蕃，等.羊肉中貉源成分Real-time PCR檢測方法的建立［J］.安徽農業科學，2023，51（1）：179-182，187.

［13］ JONKER K M，TILBURG J J H C，HAGELE G H，et al.Species identification in meat products using real-time PCR［J］.Food additives and contaminants：Part A，2008，25（5）：527-533.

［14］ 侯東軍，韓合敬，郝智慧，等.三重熒光PCR法鑒定食品中牛、豬、鴨3種動物源性成分［J］.畜牧與獸醫，2016，48（4）：45-48.

［15］ 范維，高曉月，李賀楠，等.4種動物源性成分多重real-time PCR檢測方法的建立及其在驢肉制品檢測中的應用［J］.食品科學，2023，44（8）：317-323.

［16］ 付理文，張宇，依含，等.Taqman多重實時熒光PCR同步定量檢測6種動物源性成分方法的建立［J］.中國生物工程雜志，2017，37（9）：48-59.

［17］ BALAKRISHNA K，SREEROHINI S，PARIDA M.Ready-to-use single tube quadruplex PCR for differential identification of mutton，chicken，pork and beef in processed meat samples［J］.Food additives & contaminants： Part A，2019，36（10）：1435-1444.

［18］ 李盈諾，王艷雙，苑廣信，等.多重位點特異性PCR快速檢測牛肉中常見摻假動物源性成分［J］.食品工業科技，2019，40（24）：82-87.

［19］ SUL S，KIM M J，LEE J M，et al.Development of a rapid on-site method for the detection of chicken meat in processed ground meat products by using a direct ultrafast PCR system［J］.Journal of food protection，2020，83（6）：984-990.

［20］ KIM M J，KIM H Y.A fast multiplex real-time PCR assay for simultaneous detection of pork，chicken，and beef in commercial processed meat products［J］.LWT-food science and technology，2019，114：1-6.

［21］ 何密鼓，杜鳳，丁盛，等.PCR可視化檢測技術的開發及其在豬源性檢測中的應用［J］.食品研究與開發，2023，44（8）：163-169.