文冠果組織培養再生體系的建立

摘 要：【目的】建立文冠果體細胞胚胎發生及再生植株體系，所建立的高效再生體系可為培育文冠果優良株系以及文冠果的遺傳轉化的基因工程奠定基礎。【方法】以文冠果幼齡胚、中期胚、成熟胚為外植體，設計不同濃度生長素、細胞分裂素的正交實驗，通過正交實驗，確定文冠果外植體、激素濃度配比對提高愈傷組織誘導率的影響，確定文冠果愈傷組織誘導增殖、不定芽分化、伸長和生根培養最適基本培養基及其中各激素的濃度配比，建立文冠果組織培養再生體系。【結果】在1 mg/L 6-BA 和0.5 mg/L NAA 的激素配比中，誘導出嫩綠色的、結構致密的愈傷組織，誘導率為80.46%，誘導愈傷組織形成的最佳品種為‘WF15’的中期胚；在1 mg/L6-BA 和0.3 mg/L IBA 的激素配比中，大量的愈傷組織出現嫩綠色的芽點，部分產生叢生芽，不定芽最高誘導率為75%；在1.0 mg/L TDZ 和0.2 mg/L IAA 的激素配比中，能促進分化出的不定芽繼續良好生長，繼代30 d，每個不定芽可分化3 ～ 4 個枝條，枝條高度可達5 cm，最佳品種是‘WF19’；0.3 mg/L IBA 誘導生根率最高，最高為88.35%，生成的根長約9 cm；開瓶時間為36 h 時，幼苗生長良好，移栽成活率為73.33%，顯著高于其他開瓶時間【結論】誘導愈傷組織形成的最佳培養基為：MS+1 mg/L 6-BA+0.5 CmxnNWIoSYLetC0tY5BaSxTMmWPfvxOizjTIOBoxh7w=mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂；誘導不定芽形成的最佳培養基為：WPM+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/LIBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂；誘導不定芽增殖分化的培養基為：MS+1.0 mg/L TDZ+0.2 mg/L IAA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂；誘導生根的最佳培養基為：1/2MS+0.3 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+7 g/L 瓊脂。

關鍵詞：文冠果；外植體；組織培養 ；再生體系

中圖分類號：S668 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2024）02—0158—09

文冠果Xanthoceras sorbifolium Bunge， 無患子科文冠果屬植物，單屬單種。文冠果屬落葉灌木或小喬木，耐干旱、貧瘠，抗風沙[1]，具有很強的適應性，是中國特有多用途的木本油料樹種[2]，其種子含油率高[3]，籽油既可作生物柴油，又可作為食用油[4]。但是，文冠果屬異花授粉植物，后代性狀分離現象嚴重，在文冠果發展過程中，因為存在著缺乏良種、坐果率低、扦插不易生根等問題[5]，導致利用常規育種手段大量培育高產、優質、性狀穩定的文冠果株系困難大，因此，急需建立高效穩定的文冠果再生體系。

植物組織器官培養是指在無菌的條件下，通過選取植物的器官或分生組織作為外植體，將其在培養基上培養，直接獲得組培苗的方法。文冠果的生殖器官（種子）和營養器官（根、莖和葉）均可以作為誘導愈傷組織發生的外植體。目前，基于文冠果種胚為外植體進行組織培養的研究已經具有一定成果，顧玉紅等[6] 已經將文冠果種胚接種在初代培養基上，成功獲得愈傷組織。柳金鳳等[7] 在文冠果細胞懸浮培養技術研究中發現NAA 對文冠果愈傷組織萌芽培養有較大的促進作用。臧國忠利用文冠果種子子葉進行實驗，在MS 固體培養基上可大量產生胚性愈傷組織[8]，李晶等[9] 通過對3 個發育期果實的種胚在愈傷組織誘導方面能力的比較和分析發現，果實發育中期的種胚對誘導愈傷組織的效果最佳，但對進一步繼代生根的研究還不是很充足[10-13]。上述研究表明，以種胚為外植體進行組織培養實驗具有較高的可行性，然而不定芽繼代以及組織培養過程中生根移栽的問題仍然沒有解決，文冠果誘導、萌發、增殖和轉化成苗的效率低是目前存在的最大問題。因此，仍有必要繼續優化文冠果的組培快繁體系。

本研究以文冠果幼齡胚、中期胚、成熟胚為外植體，探究文冠果不同外植體、不同激素濃度配比對文冠果愈傷組織誘導增殖、不定芽分化、伸長和生根培養的影響，以建立簡單高效的文冠果體細胞胚發生及再生植株體系，所建立的高效再生體系可為培育文冠果優良株系以及文冠果的工廠育苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料來源

試驗材料為文冠果種子不同發育時期的種胚，均于2021 年6—7 月取自山東農業大學林學試驗站（36°10′19.2″N，117°09′01.3″E），選擇長勢良好，無病蟲害的優良株系‘WF15’‘WF19’‘46321’作為母樹，取生長狀況良好的幼齡胚、中期胚和成熟胚作為外植體。采果分3 個時期進行：6 月初為幼果期，果實大小接近成熟時的50%，種皮是白色柔軟的，內溶物呈無色透明稠密液，結構分化還不明顯；7 月初為中期，果實大小已接近成熟時的80％，種皮白色、較柔軟，種胚淡黃綠色子葉和胚軸已發育完全；7 月中為果實成熟期，果皮綠色較硬，種皮也變為棕黑色、很硬。

1.1.2 材料處理

將采集到的文冠果種子用洗滌劑水漂洗，再用自來水沖洗干凈。把清洗過的種子放入60 ℃的自來水中浸泡3 ～ 4 h。在超凈工作臺上，先用75% 的乙醇消毒2 min，無菌水沖洗3 次，每次2 ～3 min，再用50% 的次氯酸鈉溶液浸泡20 min，無菌水沖洗3 次，每次2 ～ 3 min。在超凈工作臺上剝去種皮，取出種胚。在無菌條件下，用75% 的酒精浸泡種胚30 s，無菌水沖洗3 次，每次2 ～ 3 min。用無菌濾紙吸干表面水分備用。