MiR-206、TGF-β1和Smad3在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中的表達及意義

［摘 要］目的 探討妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織微小RNA-206（miR-206）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、Sma和Mad相關蛋白3（Smad3）的表達情況及臨床意義。方法 選取2020年6月至2023年1月于河北中石油中心醫院就診的60例妊娠期高血壓患者（妊娠期高血壓組）、60例子癇前期患者（子癇前期組）、60例妊娠晚期健康孕婦（對照組）為研究對象。采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測miR-206、TGF-β1和Smad3的mRNA水平，采用免疫組化法檢測胎盤組織中TGF-β1和Smad3蛋白表達；采用Pearson相關分析妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平與臨床資料的相關性；采用受試者工作特征（ROC）曲線分析產后胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平對妊娠期高血壓疾病孕婦病情的評估價值。結果 對照組、妊娠期高血壓組、子癇前期組的舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白、TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA、TGF-β1蛋白表達陽性率、Smad3蛋白表達陽性率均依次升高，清蛋白、新生兒體重、胎盤重量、miR-206均依次降低，差異有統計學意義（F/χ2值介于39.400～834.610之間，P＜0.05）；妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織miR-206與收縮壓、舒張壓、24h尿蛋白負相關，與清蛋白、新生兒體重、胎盤重量正相關（r值介于－0.514～0.507之間，P＜0.05）；TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA與清蛋白、新生兒體重、胎盤重量負相關，與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白正相關（r值介于－0.512～0.519之間，P＜0.05）；胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平單獨及聯合評估妊娠期高血壓疾病孕婦病情的曲線下面積（AUC）分別為0.781、0.840、0.837、0.951。結論 miR-206在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中低表達，TGF-β1和Smad3高表達，三者可能共同參與了妊娠期高血壓疾病進展。

［關鍵詞］妊娠期高血壓疾病；胎盤組織；微小RNA-206；轉化生長因子β1；Sma和Mad相關蛋白3

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.09.003

［中圖分類號］R173""" ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）09-0014-07

Expression and significance of miR-206，TGF-β1 and Smad3 in placental tissue of

patients with hypertensive disorders of pregnancy

［Abstract］ Objective To explore the expression and clinical significance of microRNA-206 （miR-206），transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and Sma-and Mad-related protein 3 （Smad3） in placental tissue of patients with hypertensive disorders of pregnancy. Methods A total of 60 patients with gestational hypertension （gestational hypertension group），60 patients with preeclampsia （preeclampsia group），and 60 healthy pregnant women in late pregnancy （control group） who were treated at Hebei Petro China Central Hospital from June 2020 to January 2023 were selected as the study subjects.Real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR） was used to detect the mRNA levels of miR-206，TGF-β1 and Smad3，and immunohistochemistry was used to detect the protein expressions of TGF-β1 and Smad3 in placental tissues.Pearson correlation was applied to analysis the correlation between the levels of miR-206，TGF-β1 mRNA and Smad3 mRNA levels in placental tissues and clinical data in patients with hypertensive disorders of pregnancy.Receiver operating characteristic （ROC） curves were used to analyze the value of postpartum placental tissue miR-206，TGF-β1 mRNA and Smad3 mRNA levels in assessing the condition of pregnant women with hypertensive disorders of pregnancy. Results The diastolic blood pressure，systolic blood pressure，24-hour urine protein，TGF-β1 mRNA，Smad3 mRNA，positive expression rate of TGF-β1 protein，and positive expression rate of Smad3 protein in the control group，gestational hypertension group，and preeclampsia group increased in turn，while albumin，neonatal weight，placental weight，and miR-206 decreased sequentially，with significant differences （F/χ2=39.400-834.610，P＜0.05）.In patients with gestational hypertension，miR-206 in placental tissue was negatively correlated with systolic blood pressure，diastolic blood pressure，and 24 h urine protein，and positively correlated with albumin，neonatal weight，and placental weight （r=－0.514-0.507，P＜0.05）.TGF-β1 mRNA and Smad3 mRNA were negatively correlated with albumin，neonatal weight and placental weight，and were positively correlated with systolic blood pressure，diastolic blood pressure，and 24 h urine protein （r =－0.512-0.519，P＜0.05）.The AUC of miR-206，TGF-β1 mRNA and Smad3 mRNA levels in placental tissue for alone and in combination evaluating the condition of pregnant women with hypertensive disorders were 0.781，0.840，0.837 and 0.951，respectively. Conclusion MiR-206 is lowly expressed in placental tissues of patients with hypertensive disorders，while TGF-β1 and Smad3 are highly expressed.The three may be involved in the progression of hypertensive disorders.

［Key words］ hypertensive disorders of pregnancy;placental tissues;micro RNA-206;transforming growth factor β1;Sma-and Mad-related protein 3

妊娠期高血壓疾病是妊娠后期常見的一種妊娠期并發癥，其發病機制尚未明確［1］。妊娠期高血壓疾病患者可從妊娠期高血壓進展為子癇前期，極易增加妊娠不良結局的發生風險，甚至可導致母嬰死亡［2-3］。尋找妊娠期高血壓疾病進展相關的生物因子，進而深入探討妊娠期高血壓疾病的發生機制，是目前產科醫師急需解決的重要問題。Yousefzadeh等［4］研究表明，微小RNA-206（microRNA-206，miR-206）參與子癇前期的調節過程及三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）分解代謝過程。而既往研究顯示，miR-206與轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/Sma和Mad相關蛋白3（Sma-and Mad-related protein 3，Smad3）信號通路間存在密切聯系，miR-206可通過調控TGF-β1/Smad3信號通路影響衛星細胞的增殖和分化，進而對抗骨骼肌萎縮［5］。然而妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中miR-206、TGF-β1和Smad3的表達情況仍待進一步驗證。因此，本研究通過檢測健康孕婦、妊娠期高血壓患者、子癇前期患者產后胎盤組織中miR-206、TGF-β1和Smad3的表達情況，探討三者與疾病進展的相關性，旨在為進一步研究妊娠期高血壓疾病的生物機制提供生物標志物。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2020年6月至2023年1月于河北中石油中心醫院治療的120例妊娠期高血壓疾病患者作為研究對象，其中妊娠期高血壓患者（妊娠期高血壓組）60例和子癇前期患者（子癇前期組）60例，同期匹配60例妊娠晚期的健康孕婦作為對照組。收集患者一般資料，包括年齡、孕前體質量指數（body mass index，BMI）、孕周、孕次、產次、肌酐、血小板計數、舒張壓、收縮壓、清蛋白、24h尿蛋白、新生兒體重、胎盤重量。

納入標準：①妊娠期高血壓疾病的診斷均依據2019年專家共識［6］；②患者資料完整，患者本人知情同意并簽署知情同意書；③均為單胎妊娠；④健康孕婦無妊娠期并發癥，且最終分娩健康胎兒。排除標準：①出現宮內死胎或胎兒染色體檢測異常；②妊娠期間存在飲酒、吸煙等不良生活習慣，或依從性較差者；③患者妊娠期間合并其他妊娠內科合并癥或有營養不良、產前感染等病理狀況者；④有甲狀腺功能亢進、肺結核等急慢性病史或心、肝、腎等嚴重臟器功能障礙；⑤合并傳染性疾病孕婦。

1.2儀器與試劑

RNA提取試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司（貨號：K1101）。紫外分光光度計購自美國賽默飛世爾科技（型號：NanoDrop 2000）。反轉錄試劑盒購自北京康瑞納生物科技有限公司（貨號：R3564）。

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存

胎兒娩出后采集新鮮胎盤，無菌操作取胎盤組織各200mg左右分別用于免疫組織化學和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測，避開鈣化、出血及梗死區，放入冷凍管（經焦炭酸二乙酯處理）中，－80℃保存待測。

1.3.2 miR-206、TGF-β1和Smad3半定量檢測

采用RNA提取試劑盒提取胎盤組織總RNA，總RNA經紫外分光光度計檢測后取吸光度（A260/280）比值在1.8～2.1間的標本用于后續實驗，反轉錄試劑盒反轉錄得模板cDNA。采用qRT-PCR法檢測miR-206、TGF-β1和Smad3的mRNA水平。反應條件：95℃，5min；95℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，循環40次。反應體系：上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，模板cDNA（50ng/μL）1μL，qPCR SYBR Green Master Mix 5μL，ddH2O 3.2μL。各樣品設3個重復孔，采用2-ΔΔCT法計算胎盤組織miR-206、TGF-β1和Smad3相對表達量，軟件設計引物后交由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.3.3 TGF-β1和Smad3蛋白表達檢測

采用免疫組織化學法檢測胎盤組織中TGF-β1和Smad3蛋白表達，依照試劑盒說明書進行免疫組化染色，其中PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。每張切片取10個視野，每個視野觀察200個細胞。免疫組化結果判定：結果由兩名經驗豐富的病例醫師共同閱片判定，最終結果評估采用Adams等于1999年制定的半定量評分，依據染色強度及陽性細胞所占比例進行綜合判定，陽性細胞比例：＜1%為0分、1%～10%為1分、11%～50%記為2分、51%～80%記為3分、＞80%為4分。染色強度：無著色記為0分、淺黃色記為1分、棕黃色記為2分、棕褐色記為3分。兩項乘積＜2分則為陰性表達，兩項乘積≥2分則為陽性表達。

1.4統計學方法

采用SPSS 25.0軟件分析數據。計數資料用例數（n）和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（x-±s）表示，三組間比較行單因素方差分析檢驗，進一步組間兩兩比較行SNK-q檢驗；采用Pearson相關性分析檢驗妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平與臨床資料的相關性；采用受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線分析產后胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平對妊娠期高血壓疾病孕婦病情的評估價值，采用Z檢驗進行曲線下面積（area under the curve，AUC）比較。P＜0.05表示為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組一般資料比較

各組年齡、孕前BMI、孕周、孕次、產次、肌酐、血小板計數比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；對照組、妊娠期高血壓組、子癇前期組的舒張壓、收縮壓、24h尿蛋白均依次升高，清蛋白、新生兒體重、胎盤重量均依次降低，差異有統計學意義（F值介于44.096～834.610之間，P＜0.05），見表2。

2.2各組胎盤組織miR-206、TGF-β1和Smad3半定量檢測結果比較

對照組、妊娠期高血壓組、子癇前期組胎盤組織TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA均依次升高，miR-206依次降低，差異有統計學意義（F值介于80.929～111.880之間，P＜0.05），見表3。

2.3各組胎盤組織TGF-β1、Smad3免疫組化檢測結果比較

對照組、妊娠期高血壓組、子癇前期組胎盤組織TGF-β1蛋白表達陽性率、Smad3蛋白表達陽性率均依次升高，差異有統計學意義（χ2值分別為39.400、54.180，P＜0.05），見表4和圖1。

2.4妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平與臨床資料的相關性

Pearson相關分析結果顯示，妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織miR-206與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白負相關，與清蛋白、新生兒體重、胎盤重量正相關（r值介于－0.514～0.507之間，P＜0.05）；TGF-β1 mRNA、Smad3 mRNA與清蛋白、新生兒體重、胎盤重量負相關，與收縮壓、舒張壓、24 h尿蛋白正相關（r值介于－0.512～0.519之間，P＜0.05），見表5。

2.5產后胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平對妊娠期高血壓疾病孕婦病情的評估價值

以產后胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平單獨檢測值及聯合預測概率值為檢驗變量，以是否發生妊娠期高血壓疾病為狀態變量繪制ROC曲線，結果顯示，胎盤組織miR-206、TGF-β1 mRNA和Smad3 mRNA水平單獨及聯合評估妊娠期高血壓疾病孕婦病情的AUC分別為0.781、0.840、0.837、0.951，三者聯合評估AUC高于單獨評估AUC，差異有統計學意義（Z值分別為3.830、2.788、2.863，P＜0.05），見表6、圖2。

3討論

3.1妊娠期高血壓疾病發病特點及機制

妊娠期高血壓疾病作為臨床一種常見妊娠期疾病，主要分為四類：妊娠期高血壓、子癇前期、慢性高血壓和慢性高血壓并發子癇前期［7-8］。妊娠期高血壓疾病通常在妊娠20周之后發病，主要特征為內皮細胞損傷、全身小血管痙攣、局部缺血［9-10］。子癇前期癥狀與母體高血壓、腎功能不全伴蛋白尿、內皮功能障礙、滋養細胞浸潤不良和胎兒結局異常等均存在密切聯系［11］。目前研究顯示，胎盤淺著床導致的胎盤組織局部缺血缺氧是子癇前期疾病進展的公認機制［12-14］。

3.2妊娠期高血壓疾病患者miR-206、TGF-β1和Smad3表達趨勢及生物機制

臨床若能通過相關指標及時診斷妊娠期高血壓疾病并評估其疾病進展，則有利于在孕婦妊娠早期進行有效預防和逆轉。張麗等［15］研究結果顯示，TGF-β1、血管內皮生長因子、糖基化終末產物與妊娠期高血壓疾病嚴重程度相關。Qi等［16］發現，miR-146a、Smad3在嚴重子癇前期中分別低表達和高表達，其表達異常可通過影響滋養層細胞增殖、凋亡等參與疾病進展。以上研究均可通過相關指標評估患者疾病進展，然而妊娠期高血壓疾病是一種受多因素影響的復雜疾病，其指標變化可能不具有特異性，需在臨床中探索更多有效指標對其預防和治療進行指導。

既往研究中，miR-142-3p可通過調控TGF-β1/Smad3信號通路抑制滋養細胞的侵襲和遷移，從而在人類胚胎發育中發揮重要作用，而滋養細胞浸潤不足可造成子宮螺旋小動脈重鑄僅限于蛻膜段，從而導致胎盤缺血缺氧和淺著床，引發子癇前期的一系列病理生理改變［17］。本研究結果顯示，子癇前期患者胎盤組織中TGF-β1和Smad3表達水平顯著高于妊娠期高血壓患者和健康孕婦，miR-206顯著低于妊娠期高血壓患者和健康孕婦，與龔寶蘭等［18］和陳亞玲等［19］研究結果基本一致。基于既往研究推測本研究結果中TGF-β1和Smad3在妊娠期高血壓疾病進展中可能發揮促進作用，miR-206可能發揮抑制作用，分析認為miR-206病理性降低可能影響TGF-β1/Smad3信號通路相關因子及TGF-β1和Smad3蛋白表達水平，進而造成滋養層細胞分化及侵襲能力下降，侵入子宮螺旋動脈和子宮蛻膜的能力減弱，造成胎盤淺著床，母體對胎盤供血量出現下降，造成內皮細胞損傷和胎盤血管功能異常，推動子癇前期疾病進展。此外，Awobajo等［20］研究顯示，TGF-β1的異常表達，可促發血管內皮細胞氧化應激，導致組織損傷。基于上述研究推測本研究中miR-206、TGF-β1和Smad3亦可能通過相關作用增加血管內皮細胞炎癥損傷和氧化應激，而胎盤血管抵抗炎癥作用減弱，進一步加劇血管內皮損傷，引發子癇前期等妊娠期高血壓疾病。但上述結論均為本研究依據miR-206、TGF-β1、Smad3在既往研究中的生理作用而做出的推測，其具體生物機制仍需進一步探討。

3.3 miR-206、TGF-β1和Smad3在妊娠期高血壓疾病中的臨床評估價值

本研究中miR-206、TGF-β1、Smad3與收縮壓、舒張壓、尿蛋白等指標呈顯著相關性，提示miR-206、TGF-β1和Smad3表達異常可能進一步影響患者血壓水平，使其血壓控制不佳，推測miR-206表達越低，TGF-β1和Smad3表達越高，動脈血管的壓力越大，使得胎盤組織缺血缺氧更加嚴重。本研究ROC曲線結果進一步顯示，產后胎盤組織中miR-206、TGF-β1和Smad3三者聯合后可有效評估妊娠期高血壓疾病進展，聯合評估的AUC可達0.951。進一步反映miR-206、TGF-β1和Smad3可能與妊娠期高血壓疾病進展有關，當miR-206低于0.87、TGF-β1高于1.31、Smad3高于1.23時，患者病情進展的風險較高，可為今后妊娠期高血壓疾病的臨床診治提供參考。

綜上，miR-206在妊娠期高血壓疾病患者的胎盤組織中呈低表達，TGF-β1和Smad3高表達，推測三者可能通過相互作用參與妊娠期高血壓疾病進展，均有望作為妊娠期高血壓疾病進展的生物指標，具有重要的臨床價值。然而本研究并未對生物機制進行探究，其涉及的相關信號通路將在今后進一步深入探討。

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