GRHL2在子癇前期患者胎盤中的表達及對滋養層細胞增殖、侵襲的影響

［摘 要］目的 探討粒狀頭樣2基因（GRHL2）在子癇前期（PE）患者胎盤中的表達及對滋養層細胞增殖、侵襲的影響。方法 收集2022年1月至6月期間在陜西省人民醫院進行剖宮產分娩的32例PE患者的胎盤組織（PE組），同時收集同期在本院進行剖宮產分娩的32例正常妊娠產婦的胎盤組織（對照組），Western blot檢測胎盤組織中GRHL2蛋白表達；將對數生長期的人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo分為空白組、GRHL2小干擾RNA陰性對照（si-NC）組、GRHL2小干擾RNA（si-GRHL2）組、GRHL2過表達質粒陰性對照（pcDNA）組、GRHL2過表達質粒（pcDNA-GRHL2）組，CCK-8、克隆形成實驗檢測HTR-8/Svneo細胞OD450值、克隆形成率；Transwell實驗檢測HTR-8/Svneo細胞侵襲；Western blot檢測HTR-8/Svneo細胞中GRHL2、增殖細胞核抗原（PCNA）、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt）蛋白表達。結果 PE組患者胎盤組織中GRHL2蛋白表達水平高于對照組，差異有統計學意義（t=57.240，P＜0.05）；與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中GRHL2蛋白表達降低，OD450值、克隆形成率、侵襲細胞數、PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高（t值介于5.477～24.595之間，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中GRHL2蛋白表達升高，OD450值、克隆形成率、侵襲細胞數、PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達降低（t值介于9.295～24.239之間，P＜0.05）。結論 GRHL2在PE患者胎盤組織中高表達，沉默GRHL2可促進HTR-8/Svneo細胞增殖與侵襲，而過表達GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細胞增殖與侵襲，其機制可能與調控PI3K/Akt通路有關。

［關鍵詞］粒狀頭樣2基因；子癇前期；胎盤；增殖；侵襲

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.09.002

［中圖分類號］R173""" ［文獻標識碼］A

［文章編號］1673-5293（2024）09-0007-07

Expression of GRHL2 in the placenta of preeclampsia patients and its impacts

on proliferation and invasion of trophoblast cells

［Abstract］ Objective To investigate the expression of the grainyhead-like 2 （GRHL2） gene in the placenta of preeclampsia （PE） patients and its impacts on the proliferation and invasion of trophoblast cells. Methods Placental tissues were collected from 32 PE patients who underwent cesarean section at Shaanxi Provincial Peoples Hospital from January to June 2022 （PE group）.Placental tissues were also collected from 32 normal pregnant women who underwent cesarean section during the same period at the same hospital （control group）.Western blot was used to detect the expression of GRHL2 protein in placental tissues.Human chorionic trophoblast cells HTR-8/Svneo in the logarithmic growth phase were divided into the blank group，GRHL2 small interfering RNA negative control （si-NC） group，GRHL2 small interfering RNA （si-GRHL2） group，GRHL2 overexpression plasmid negative control （pcDNA） group，and GRHL2 overexpression plasmid （pcDNA-GRHL2） group.CCK-8 and colony formation assays were used to detect the OD450 value and colony formation rate of HTR-8/Svneo cells.Transwell assay was used to detect HTR-8/Svneo cell invasion.Western blot was used to detect the expression of GRHL2，proliferating cell nuclear antigen （PCNA），matrix metalloproteinase （MMP）-2，phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase （p-PI3K），and phosphorylated serine/threonine-protein kinase （p-Akt） proteins in HTR-8/Svneo cells. Results The expression level of GRHL2 protein in the placental tissues of the PE group was significantly higher than that in the control group （t=57.240，P＜0.05）.Compared with the blank group and si-NC group，the expression of GRHL2 protein in HTR-8/Svneo cells of the si-GRHL2 group was decreased，while the OD450 value，colony formation rate，number of invasive cells，and the expression levels of PCNA，MMP-2，p-PI3K，and p-Akt proteins were increased （t value ranged from 5.477 to 24.595，P＜0.05）.Compared with the blank group and pcDNA group，the expression of GRHL2 protein in HTR-8/Svneo cells of the pcDNA-GRHL2 group was increased，while the OD450 value，colony formation rate，number of invasive cells，and the expression levels of PCNA，MMP-2，p-PI3K，and p-Akt proteins were decreased （t values ranged from 9.295 to 24.239，P＜0.05）. Conclusion GRHL2 is highly expressed in the placental tissues of PE patients.Silencing GRHL2 can promote the proliferation and invasion of HTR-8/Svneo cells，while overexpressing of GRHL2 can inhibit the proliferation and invasion of HTR-8/Svneo cells.The mechanism may be related to the regulation of the PI3K/Akt pathway.

［Key words］ grainyhead-like 2;preeclampsia;placenta;proliferation;invasion

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種伴有高血壓和蛋白尿的多系統血管綜合征，通常在妊娠20周后可觀察到［1-2］。全世界PE的發病率約為2%～8%，它是孕婦及其胎兒死亡和發病的主要原因［3］。盡管醫學取得了重大進展，但娩出胎兒和胎盤仍然是唯一已知的治療PE的方法［4］。多項研究提示了PE發病的可能理論：滋養層細胞增殖和侵襲受抑是PE的主要誘因［5］；滋養層侵襲性降低導致蛻膜螺旋動脈重塑失敗，母體供氧不足，導致抗血管生成因子釋放，最終引起內皮細胞功能障礙和全身炎癥，誘發PE［6］。盡管關于PE的研究有很多，但與PE發病機制相關的潛在機制仍有待探索。粒狀頭樣2基因（grainyhead-like 2，GRHL2）是在哺乳動物中發現的GRHL轉錄因子家族成員，其可調控許多生物過程，包括細胞上皮-間充質轉化、侵襲和轉移等［7］。已有研究顯示，PE患者胎盤組織中GRHL2水平顯著上調，且可影響滋養層細胞的增殖與侵襲［8］，但具體機制尚不明確。相關研究顯示，干擾GRHL2基因表達可通過調控磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein-kinase，Akt）通路進而調控腎癌細胞的增殖和遷移行為［9］。但GRHL2對滋養層細胞增殖、侵襲的影響是否與調控PI3K/Akt通路有關尚不可知。因此，本研究主要探究GRHL2對滋養層細胞增殖、侵襲的影響及其可能的機制。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2022年1月至6月期間在陜西省人民醫院進行剖宮產分娩的32例PE患者的胎盤組織，并命名為PE組；同時收集同期在本院進行剖宮產分娩的32例正常妊娠產婦的胎盤組織，并命名為對照組。所有組織立即凍存于-80℃中。該研究得到本院倫理委員會的批準（審批號：SX20220178），所有患者均簽署了知情同意書。

1.2主要試劑及儀器

人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo購自上海弘順生物科技有限公司。GRHL2小干擾RNA（si-GRHL2）及其陰性對照（si-NC）、GRHL2過表達質粒（pcDNA-GRHL2）及其陰性對照（pcDNA）均購自賽默飛世爾科技有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；兔源一抗GRHL2、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質金屬蛋白酶（matrix matalloprotein-ases，MMP）-2、p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt、GAPDH及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司。CB 60型CO2培養箱購自上海錫為科學儀器有限公司；SAF-680T型酶標儀購自上海巴玖實業有限公司；CKX53型光學顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；DYCZ24DN型蛋白電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3細胞培養與分組

將HTR-8/Svneo細胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養。取對數生長期的HTR-8/Svneo細胞，分為空白組（正常培養的HTR-8/Svneo細胞）、si-NC組（轉染si-NC）、si-GRHL2組（轉染si-GRHL2）、pcDNA組（轉染pcDNA）、pcDNA-GRHL2組（轉染pcDNA-GRHL2），轉染48h后，收集各組細胞用于后續實驗。

1.4 CCK-8法檢測HTR-8/Svneo細胞OD450值

以10 000個/孔的密度將HTR-8/Svneo細胞接種于96孔板中，按照1.3所述分組進行對應處理后，向各孔中加入10μL CCK8溶液，在37℃中孵育1h后利用酶標儀測量各孔450nm處的吸光度，吸光度越大表明細胞增殖能力越強。

1.5克隆形成實驗檢測HTR-8/Svneo細胞克隆形成率

將HTR-8/Svneo細胞（500個）接種于6cm細胞培養板中，并在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基中培養14d。然后，除去培養液，將HTR-8/Svneo細胞用甲醇固定、0.1%結晶紫染色，觀察克隆形成情況。克隆形成率（%）=（形成克隆數/接種細胞數）×100%。

1.6 Transwell實驗檢測HTR-8/Svneo細胞侵襲

將1.3中的各組HTR-8/Svneo細胞（2×105個）懸浮在200μL無血清的RPMI1640培養基中，再將細胞懸液加入預先涂覆有基質膠的Transwell上室中，然后向下室中加入500μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養基。孵育24h后，用4%多聚甲醛固定、結晶紫染色侵襲的細胞，利用光學顯微鏡觀察細胞侵襲情況。

1.7 Western blot檢測HTR-8/Svneo細胞中GRHL2、PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達

利用RIPA緩沖液裂解并提取胎盤組織勻漿及HTR-8/Svneo細胞樣品總蛋白。2，2-聯喹啉-4，4-二甲酸二鈉法進行蛋白定量后，取40μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺進行凝膠電泳，將電泳分離的蛋白轉移到PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶封閉膜1h后，在4℃下將膜與一抗GRHL2（1∶4 000）、PCNA（1∶3 000）、MMP-2（1∶5 000）、p-PI3K（1∶4 000）、PI3K（1∶4 000）、p-Akt（1∶4 000）、Akt（1∶4 000）、GAPDH（1∶5 000）孵育過夜，再與二抗（1∶4 000）在常溫下孵育2h。加入ECL試劑觀察蛋白印跡，利用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.8統計學方法

利用SPSS 29.0軟件進行統計分析。所有符合正態分布和方差齊性的計量數據以均數±標準差（x-±s）表示，t檢驗用于兩組間的差異比較，單因素方差分析用于多組間的差異比較，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1 GRHL2在胎盤組織中的表達比較

32例PE組患者胎盤組織中GRHL2蛋白平均表達水平為（1.56±0.13），32例對照組為（0.21±0.03），PE組高于對照組，差異有統計學意義（t=57.240，P＜0.05），見圖1。

2.2沉默GRHL2或過表達GRHL2對HTR-8/Svneo細胞中GRHL2蛋白表達變化的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中GRHL2蛋白表達降低，差異有統計學意義（t值分別為24.595、21.875，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中GRHL2蛋白表達升高，差異有統計學意義（t值分別為12.989、13.145，P＜0.05），見圖2和表1。

2.3沉默GRHL2或過表達GRHL2對HTR-8/Svneo細胞OD450值及克隆形成率的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞OD450值及克隆形成率升高，差異有統計學意義（t值介于5.477～13.950之間，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞OD450值及克隆形成率降低，差異有統計學意義（t值介于10.954～18.424之間，P＜0.05），見表2和圖3。

2.4沉默GRHL2或過表達GRHL2對HTR-8/Svneo細胞侵襲的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞侵襲細胞數升高，差異有統計學意義（t值分別為17.212、17.443，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞侵襲細胞數降低，差異有統計學意義（t值分別為23.702、24.239，P＜0.05），見表3和圖4。

2.5沉默GRHL2或過表達GRHL2對HTR-8/Svneo細胞中PCNA、MMP-2及PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高，差異有統計學意義（t值介于13.327～18.075之間，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達降低，差異有統計學意義（t值介于9.295～20.469之間，P＜0.05），見表4和圖5。

3討論

3.1 PE研究現狀

PE是妊娠的常見并發癥，威脅母嬰健康［10］。目前，胎盤分娩是PE的唯一根治性解決方案，而降壓藥僅對病情穩定的患者有效。如果患者沒有得到適當或及時的治療，可能會發生子癇或致命并發癥，包括中風和肺水腫等［11］。許多研究報道，胎盤基因表達異常可導致子宮螺旋動脈重塑障礙，并調節PE的發生和發展［12］。因此，開發新的用于治療PE的分子標志物具有重要意義。

3.2 GRHL2可影響人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo增殖與侵襲

GRHL2是上皮組織發育和功能的重要轉錄因子，可調控細胞增殖、侵襲等生物學行為［13］。據報道，沉默GRHL2可促進滋養層細胞增殖、遷移與侵襲［14］；GRHL2在PE患者胎盤中過表達，下調GRHL2可促進滋養層細胞遷移［15］；GRHL2可通過調控上皮間質轉化過程促進PE的發生［16］。本研究亦顯示，PE組患者胎盤組織中GRHL2蛋白表達水平顯著高于對照組，與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞OD450值、克隆形成率、侵襲細胞數升高；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞OD450值、克隆形成率、侵襲細胞數降低，表明GRHL2蛋白在PE患者胎盤組織中高表達，沉默GRHL2可促進人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo增殖與侵襲，而過表達GRHL2則呈相反趨勢。PCNA作為支架蛋白在DNA復制和修復中發揮重要作用［17］；MMP-2是細胞侵襲的關鍵調節因子［18］。檢測PCNA、MMP-2蛋白表達水平可從蛋白質水平上衡量HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲能力。本研究顯示，沉默GRHL2可促進HTR-8/Svneo細胞中PCNA、MMP-2蛋白表達，而過表達GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細胞中PCNA、MMP-2蛋白表達，再次從蛋白質水平上證實了GRHL2對HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲的調控作用，提示GRHL2可能成為治療PE的潛在有效靶點。此外，有研究報道，GRHL2通過抑制PI3K/Akt通路抑制結直腸癌細胞中PCNA蛋白表達進而抑制結直腸癌細胞增殖［19］；GRHL2通過抑制TGFβ信號通路抑制胃癌細胞中MMP-2蛋白表達進而抑制胃癌細胞侵襲［20］。以上研究表明GRHL2可通過調控通路影響PCNA、MMP-2蛋白表達進而影響細胞的生物學行為。但GRHL2具體通過哪些通路影響PCNA、MMP-2蛋白表達進而影響HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲，有待后續實驗進一步確定。

3.3 GRHL2調控PI3K/Akt信號通路影響HTR-8/Svneo增殖與侵襲

PI3K/Akt通路是許多細胞功能的調節因子，包括增殖、侵襲、代謝［21］。最近，越來越多的證據表明PI3K/Akt信號通路與PE的發病機制有關。如激活PI3K/Akt信號通路可促進HTR8/Svneo細胞的上皮-間充質轉化過程［22］；激活PI3K/Akt信號通路可增強滋養層細胞的侵襲能力，以預防PE［23］；抑制PI3K/Akt信號通路可抑制滋養層細胞增殖，遷移和侵襲能力［24］；抑制PI3K/Akt信號通路可抑制人絨毛膜滋養層細胞增殖、遷移和侵襲，從而參與PE的發生發展［25］。本研究顯示，與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高，與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達降低，表明沉默GRHL2可激活HTR-8/Svneo細胞中的PI3K/Akt信號通路，而過表達GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細胞中的PI3K/Akt信號通路，提示GRHL2對HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲的促進作用可能與調控PI3K/Akt信號通路有關。未進一步設置PI3K/Akt信號通路激活劑或抑制劑來驗證GRHL2是否真正通過調控PI3K/Akt信號通路影響HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲過程是本研究的不足之一，后期將會深入探究。

綜上所述，GRHL2在PE患者胎盤組織中高表達，沉默GRHL2可促進HTR-8/Svneo細胞增殖與侵襲，而過表達GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細胞增殖與侵襲，其機制可能與調控PI3K/Akt通路有關。該研究可能為PE的臨床治療提供新的思路，未對作用機制進行深入探討是本研究的缺陷之一，后期將繼續研究。

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