骨碎補(bǔ)研究進(jìn)展

摘 要 骨碎補(bǔ)是水龍骨科植物槲蕨[Drynaria fortune （Kunze） "J. Sm.]的干燥根莖，是骨傷治療常用中藥，具有治療疼痛、補(bǔ)腎強(qiáng)筋骨的功效，所含化學(xué)成分有黃酮類、酚酸類、木質(zhì)素、甾體類和苷類等，被廣泛用于治療骨科相關(guān)疾病，藥用價(jià)值高。通過對骨碎補(bǔ)的生物學(xué)習(xí)性、植物學(xué)特征、繁育技術(shù)等進(jìn)行綜述，以期為骨碎補(bǔ)的研究和進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞 骨碎補(bǔ)；種苗繁育；化學(xué)成分；藥理作用

中圖分類號：Q949.36 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.15.019

骨碎補(bǔ)（Drynariae Rhizoma）是水龍骨科槲蕨屬植物槲蕨[Drynaria fortune （Kunze） "J. Sm.]的干燥根及根莖[1]，被廣泛用于中醫(yī)臨床治療，并被收錄到《中華人民共和國藥典》[2]。骨碎補(bǔ)始載于唐代的《本草拾遺》，其味甘、辛，性溫，具有治療疼痛、補(bǔ)腎強(qiáng)筋骨的功效[3]。《中華人民共和國藥典》記載其具有治療疼痛、補(bǔ)腎強(qiáng)筋骨、祛斑的功效，是中醫(yī)臨床治療骨關(guān)節(jié)炎常用藥物之一。骨碎補(bǔ)的化學(xué)成分主要包括黃酮類[4]、生物堿、酚酸類、苯丙素類和木脂素類等[5-8]。野生骨碎補(bǔ)附生于樹干或石上，偶生于墻縫，其分布范圍廣[3]。據(jù)文獻(xiàn)記載，20世紀(jì)80年代和90年代，江西和浙江曾是骨碎補(bǔ)的主要產(chǎn)地[9]。廣西、貴州、云南及湖北4省（區(qū)）的地理?xiàng)l件和生態(tài)環(huán)境都極為適宜槲蕨的生長[10]。此外，還分布于我國長江以北的湖北和安徽及長江以南的貴州和云南等省份[11]。當(dāng)然，國外也有分布，如老撾、柬埔寨和泰國北部地區(qū)[12]。

骨碎補(bǔ)作為我國的常用中藥，其應(yīng)用領(lǐng)域廣泛，主要中成藥相關(guān)產(chǎn)品有骨碎補(bǔ)藥丸、骨碎補(bǔ)液體散和骨碎補(bǔ)復(fù)方片等。盡管骨碎補(bǔ)野生資源分布廣泛，并且具有良好的資源條件。但是，由于骨碎補(bǔ)藥材大多來源于野生環(huán)境，因此，其供需狀況仍然十分緊張。雖然《中華人民國和藥典》（2020版）明確規(guī)定骨碎補(bǔ)藥材僅來源于槲蕨一種，但地理、價(jià)格、名稱和地域等因素可能會(huì)導(dǎo)致種類混淆情況較為頻繁。因此，由于人們對于骨碎補(bǔ)藥材的大量使用和對野生槲蕨的過度采集和開發(fā)，導(dǎo)致槲蕨野生資源匱乏和生態(tài)環(huán)境惡化。同時(shí)，由于混淆種的使用，骨碎補(bǔ)種質(zhì)資源的質(zhì)量也受到了極大的影響。槲蕨已于2002年被建議列入珍稀植物三級保護(hù)[13]，同時(shí)在2013年，它也被列入了《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》[7]的近危名單。為了保障基本的藥用需求，需要加大對骨碎補(bǔ)野生資源的保護(hù)力度，并合理利用這些資源。這也對骨碎補(bǔ)的細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)和外植體快繁技術(shù)等方面的研究提出了要求。骨碎補(bǔ)人工繁殖技術(shù)研究與生產(chǎn)化、規(guī)模化已經(jīng)成為骨碎補(bǔ)生產(chǎn)的瓶頸。通過收集種質(zhì)資源和發(fā)展組織繁育技術(shù)，可以為骨碎補(bǔ)的人工種植和野生資源保護(hù)提供幫助[14]。雖然已有學(xué)者以骨碎補(bǔ)根莖為材料，在分株繁殖、扦插繁殖和抽穗繁殖等方面的研究取得了一定進(jìn)展。但是在自然環(huán)境條件下，分株繁殖系數(shù)低、生長緩慢，無法在短期內(nèi)獲得大量的新植株，無法滿足生產(chǎn)的需求[15]；扦插繁殖對插株有一定的要求，其壽命通常比實(shí)生苗短，根系較弱，需要精細(xì)的管理，較為耗費(fèi)人工[16]。由于以上這些原因，骨碎補(bǔ)的規(guī)模化生產(chǎn)問題尚未得到解決[17-19]，骨碎補(bǔ)資源仍然面臨著嚴(yán)重的瀕危問題。

綜上，本文就骨碎補(bǔ)的資源狀況、生物學(xué)生境特征、植物學(xué)特征、種苗種植繁殖技術(shù)、化學(xué)組分及有效成分的藥用價(jià)值等方面進(jìn)行全面綜述，希望為瀕危物種之一的蕨類植物骨碎補(bǔ)的種苗種植栽培繁育、野生種質(zhì)資源庫的建立和野生資源的適度開發(fā)及其可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 "生物學(xué)習(xí)性和植物學(xué)特征

骨碎補(bǔ)通常附生于巖石上，呈匍匐狀生長，或附生于樹干之上，呈螺旋纏繞狀攀援。骨碎補(bǔ)的根狀莖肉質(zhì)粗壯，并橫向伸長[20]，外表覆蓋著棕色鱗片，這些鱗片邊緣不均勻地分布著彎曲、分叉的鱗齒，呈現(xiàn)出盾狀著生形態(tài)。骨碎補(bǔ)的葉分為育性和不育性兩種類型。基部生長不育葉呈現(xiàn)圓形，基部為心形，淺裂生長，邊緣呈現(xiàn)三色，分別為棕色、黃色或綠色，葉片質(zhì)地偏厚，膜質(zhì)結(jié)構(gòu)，少有蠟質(zhì)，葉片下表面常有絨毛[21]。正常生長葉，葉柄具明顯的窄翅；葉片綠色，具葉柄，呈長圓形，羽狀分裂，向形態(tài)學(xué)上端生長，針形，邊緣有不明顯的鋸齒狀，頂端或尖、或鈍；大小葉脈顯著分布于上下表面；葉片干燥后呈現(xiàn)紙質(zhì)狀，僅上面中肋略有短毛[22]。在骨碎補(bǔ)的葉片成熟時(shí)，主葉脈會(huì)形成孢子囊群。這些孢子囊群呈現(xiàn)兩種規(guī)則的形狀，即圓形與橢圓形，它們有規(guī)律地分布于下葉面的主葉脈兩側(cè)[12， 23]。

蕨類植物的孢子繁殖是其擴(kuò)大繁殖的常規(guī)方法。而孢子的萌發(fā)、絲狀體、片狀體、原葉體、孢子體的蕨類生活史過程的順利進(jìn)行，則是實(shí)現(xiàn)孢子成功繁殖的關(guān)鍵。在骨碎補(bǔ)從孢子萌發(fā)到重新形成孢子的整個(gè)生長發(fā)育循環(huán)過程中，不同的發(fā)育階段具有各自的特征。在孢子萌發(fā)階段，孢子從開裂處突出，形成假根和綠色細(xì)胞。隨后，含葉綠體的原葉體原始細(xì)胞開始分裂形成絲狀體，絲狀體前端細(xì)胞分裂分化形成片狀體[24]，在其一側(cè)的分生組織通過縱向和橫向分裂形成原葉體[24- 25]。與其他植物不同的是骨碎補(bǔ)有毛狀體階段，毛狀體是在片狀體之后的一個(gè)階段，分布于原葉體的邊緣或腹葉，成熟毛狀體頂端呈球形[26]。原葉體在經(jīng)過較長時(shí)間的生長發(fā)育之后，會(huì)形成心臟形狀的成熟原葉體，并在其葉緣有毛狀的假根，而隨后發(fā)育的精子器和頸卵器出現(xiàn)時(shí)間并不一致，可能會(huì)在一定程度上對孢子體的形成產(chǎn)生影響[27]。瘤蕨雖然也有毛狀體，但其毛狀體出現(xiàn)在原葉體時(shí)期，也常分布于原葉體邊緣，假根則分布于原葉體基部。星蕨毛狀體多存在于原葉體腹面[28]。闊磷瘤蕨（水龍骨科）毛狀體發(fā)育較晚，存在于原葉體腹面，形狀較為穩(wěn)定，與骨碎補(bǔ)一樣，它的頸卵器發(fā)生時(shí)間也晚于精子器[29]。

2 "種苗繁育

槲蕨植物具有肉質(zhì)、密被鱗片的根狀莖，可利用其孢子、塊莖、葉片、葉柄等作為外植體進(jìn)行繁殖。組織培養(yǎng)、扦插繁殖及分株繁殖都是蕨類植物常用的繁殖方法[14]，不同的繁殖方法有其特殊的作用，如組織培養(yǎng)，這種繁殖方法對于大多數(shù)的植物而言都是適用的，是利用植物的組織、細(xì)胞、器官等為外植體，利用細(xì)胞全能性的特點(diǎn)，進(jìn)行再生植物的技術(shù)。分株繁殖，是利用植物的分株或芽，進(jìn)行再生植物的方法。扦插繁殖則是利用植物的枝條、頂芽或側(cè)芽作為插枝進(jìn)行繁殖的方法。

2.1 "組織培養(yǎng)

在自然情況下，由于骨碎補(bǔ)面臨著孢子難以萌發(fā)、幼苗存活率低、生長周期長等問題，使得骨碎補(bǔ)在人們的生活中供不應(yīng)求。如何提高骨碎補(bǔ)的繁殖效率、縮短生長周期成為了必要解決的問題，而組織培養(yǎng)技術(shù)可以在一定程度上緩解這一情況。通過組織培養(yǎng)解決孢子難以萌發(fā)和生長周期長的問題，可從多個(gè)方面著手進(jìn)行，如培養(yǎng)基的種類、外源激素、幼苗形成方式、蔗糖、溫度、活性炭、外植體消毒、無機(jī)鹽等。在激素利用方面，以槲蕨孢子為材料，使用不同濃度的植物激素處理。研究發(fā)現(xiàn)，槲蕨孢子體誘導(dǎo)以MS基本培養(yǎng)基為最好，誘導(dǎo)率能達(dá)到122.5%。在基本培養(yǎng)基為MS、7.5 g·L-1瓊脂、30 g·L-1蔗糖、pH值5.6～5.8、0.5 mg·L-1 6-BA、0.1 mg·L-1 NAA、0.1 mg·L-1 IBA的條件下，孢子體增殖系數(shù)最高能達(dá)到3.03，且在此條件下，孢子體苗最高能達(dá)到2.7 cm。此外，1/4MS、0.2 mg·L-1 IBA的生根培養(yǎng)基效果較好[30]。低濃度下的6-BA和NAA相比于高濃度能更好地提高配子體的增殖系數(shù)，而中性pH也可以使得配子體的增殖系數(shù)提高[31]。在扇葉體鐵線蕨的孢子萌發(fā)過程中，隨著GA3濃度的升高，萌發(fā)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（GA3濃度最高為1.0 mg·L-1），當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mg·L-1時(shí)，除配子體生長效果減弱之外，還出現(xiàn)不同程度的褐化，這對植物來說是不利的[32]。改變誘導(dǎo)過程可以在一定程度上縮短育種周期，在骨碎補(bǔ)片狀體培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，槲蕨GTB（綠色瘤狀體）著生在配子體中肋處可能是槲蕨植物所特有，這與其他蕨類植物外植體誘導(dǎo)所產(chǎn)生的GGB（蕨類植物外植體誘導(dǎo)出來的綠色球狀體）都有著相似的作用，可以提高繁殖效率[33]。闊葉骨碎補(bǔ)孢子萌發(fā)后會(huì)形成孢子體，孢子體接入含有6-BA、NAA激素的培養(yǎng)基中會(huì)誘導(dǎo)GGB，GGB最后會(huì)分化幼苗[34]。這一誘導(dǎo)方法改變了正常的從孢子萌發(fā)到絲狀體、片狀體、原葉體、孢子體的生長階段，能在一定程度上縮短育種周期，更快地獲取幼苗。巢蕨通過孢子萌發(fā)產(chǎn)生孢子體，然后孢子體誘導(dǎo)GGB，0.5 mg·L-1 6-BA、0.2 mg·L-1 NAA、30 g·L-1蔗糖、4 g·L-1瓊脂混合制成的PH值為5.8的MS培養(yǎng)基是GGB誘導(dǎo)和分化幼苗的最優(yōu)培養(yǎng)基；1 mg·L-1 IBA、30 g·L-1蔗糖、4 g·L-1瓊脂混合制成的pH值為5.8的培養(yǎng)基是生根最優(yōu)培養(yǎng)基[35]。扇蕨孢子體誘導(dǎo)GGB，誘導(dǎo)率可高達(dá)100%，BBG誘導(dǎo)孢子體在低濃度的生長素條件下即可進(jìn)行[36]。除了通過GGB誘導(dǎo)提高繁殖率外，也可以通過外植體誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)而分化孢子體，從而獲得大量的蕨類孢子體幼苗。骨碎補(bǔ)根狀莖接種在不同濃度的生長素中都可以生長，但是最合適的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS、0.3 mg·L-1 6-BA、0.6 mg·L-1 NAA、 0.6 mg·L-1 2，4-D、150 mg·L-1 NH4H2PO4的混合培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率可以達(dá)到98%[37]。以骨碎補(bǔ)葉片和葉柄為外植體不能誘導(dǎo)出愈傷組織，以根狀莖為外植體，添加不同的激素配比均可誘導(dǎo)愈傷組織的形成，在8 d就可以達(dá)到50%左右的誘導(dǎo)率[38]。當(dāng)然，過高或過低的蔗糖濃度對于蕨類植物的生長影響有所差異，將1/2MS培養(yǎng)基中的蔗糖濃度調(diào)節(jié)為2.5%～3.0%時(shí)，槲蕨的生長狀態(tài)良好，在此濃度下，配子體性器官受精率也得到提高，這對植株受精是有利的。也在一定程度上說明，在1/2MS、2.5%蔗糖條件下，槲蕨孢子萌發(fā)率最高[39]。在扇蕨的組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中的鹽濃度和蔗糖濃度也會(huì)對孢子體的誘導(dǎo)和配子體的增殖產(chǎn)生影響，隨著B5培養(yǎng)基的濃度降低，以B5培養(yǎng)基和1/2B5培養(yǎng)基的配子體增殖效果最好，而隨著蔗糖濃度的上升，孢子體誘導(dǎo)率以20 g·L-1的蔗糖為最好[40]。在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭可以在一定程度上提高蕨類植物孢子體的誘導(dǎo)率[41]。也有研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中添加不同濃度的多壁碳納米管母液后，在低濃度（0.5 mg·L-1）下就能促進(jìn)孢子萌發(fā)；高濃度（5.0 mg·L-1）不利于孢子萌發(fā)，還在一定程度上抑制孢子體的生長；而適宜濃度（1.0～2.5 mg·L-1）對于片狀體、原葉體和孢子體都具有相對較好的促進(jìn)作用[42]。張銀麗以槲蕨孢子為對象，觀察無機(jī)鹽和溫度對孢子萌發(fā)的影響，低濃度無機(jī)鹽有利于孢子的萌發(fā)，而高濃度無機(jī)鹽有利于配子體發(fā)育；溫度過高或過低都不利于孢子的萌發(fā)，在25 ℃時(shí)，孢子的萌發(fā)效果最佳[25]。

2.2 "人工繁育

人工繁育，因其操作簡單、節(jié)約成本，是一種簡單易行的繁殖方法，常常用于植物的大規(guī)模繁殖，以解決植物的供不應(yīng)求問題。同時(shí)，也受到一些外界因素的影響，如環(huán)境溫度、光照、植物質(zhì)量、基質(zhì)、生長調(diào)節(jié)劑、重金屬等。當(dāng)溫度為24±1 ℃、每日光照13 h[光照強(qiáng)度為（2 100±400）lx]、環(huán)境相對濕度大于90%時(shí)，孢子、原絲體、原葉體的生長過程只需要45 d左右。通過人工輔助受精，可以將受精率提高到75%[31]。對孢子質(zhì)量進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)當(dāng)在瓶中孢子懸濁液數(shù)為每毫升1萬到2萬個(gè)時(shí)，幼孢子體成活率高，并將成活后的孢子體移栽到腐殖土中，雖然其萌發(fā)率相比于在培養(yǎng)基中較低，但是成活率卻較高[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，槲蕨孢子生長15 d會(huì)出現(xiàn)綠色；在一段時(shí)間后，將其移栽到相同基質(zhì)中，在60%的濕度和15～20 ℃的溫度條件下，槲蕨的成活率可以達(dá)到90%以上[25]。不同的生長調(diào)節(jié)劑組合及其濃度的改變會(huì)對移栽后的蕨類植物產(chǎn)生有利或不利的影響。隨著鈣離子濃度的增加，移栽后的槲蕨葉片相關(guān)生理生化指標(biāo)都呈現(xiàn)下降趨勢，并出現(xiàn)不同程度的黃化現(xiàn)象[43]。將組培瓶中增殖培養(yǎng)的巢蕨片狀體種植在泥炭土和泥炭土、蛭石體積比為2∶1的土壤之中，噴施不同的營養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)1 g·L-1 KH2PO4營養(yǎng)液噴施的片狀體小苗誘導(dǎo)率較高，且相較于對照組顏色亮麗，長勢均勻，定植后能生長到11 cm[34]。鳥巢蕨原葉體被均勻切分種植到草炭基質(zhì)之中，分別噴施多種營養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)1g·L-1 KH2PO4能提高孢子體的誘導(dǎo)率，其誘導(dǎo)率能達(dá)到90%，而水、鐵鹽、液體MS誘導(dǎo)率較低（低于50%）[43]。蕨類植物大多數(shù)都有較為強(qiáng)勁的根莖可以進(jìn)行扦插繁殖，而骨碎補(bǔ)雖然具有強(qiáng)壯的根狀莖，但其在扦插繁殖過程中也會(huì)受到各種環(huán)境因素的影響。將骨碎補(bǔ)種植于7種基質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)對植物的生長有著不一樣的效果。砂石可以提高生根效率，而砂石、土壤體積比為1∶1可以提高根系指數(shù)和插枝生長發(fā)育；而不同生長調(diào)節(jié)劑隨著處理時(shí)間的延長，發(fā)現(xiàn)低濃度（50 mg·L-1）的單一生長素對生根效果并不顯著，但1.5 h生根粉處理的插枝生根效果較好[19]。不同扦插方式也會(huì)對骨碎補(bǔ)的成活率產(chǎn)生影響，利用不同部位莖段，扦插于3種基質(zhì)之中，發(fā)現(xiàn)斜插的植株存活率高于平鋪[18]。此外，隨著NAA濃度的上升，在合適的NAA激素濃度下（50 mg·L-1），即使骨碎補(bǔ)定植方式不同，組合配比的激素對其生長也有促進(jìn)作用[44]。重金屬對蕨類植物的影響，也使得其在自然界處于劣勢。研究發(fā)現(xiàn)，隨著重金屬離子濃度的增加，澤瀉蕨的性器官出現(xiàn)的損傷情況愈加嚴(yán)重，配子體與光和器官出現(xiàn)嚴(yán)重的損害，這導(dǎo)致了孢子體的形成受到了嚴(yán)重的影響[45]。重金屬離子對開蕨的影響也集中體現(xiàn)在原葉體和性器官產(chǎn)生階段，隨著Cd2+、Pb2+濃度的上升，性器官也出現(xiàn)不同程度的黃化，形態(tài)結(jié)構(gòu)及其配子體也發(fā)生了嚴(yán)重的變化[46]。

3 "化學(xué)成分分析和藥理作用

骨碎補(bǔ)中所含的化學(xué)成分種類較多。目前，已經(jīng)從骨碎補(bǔ)中分離出的主要化學(xué)成分包括黃酮類、苯丙素、萜類、酚酸類、甾體類、木質(zhì)素、脂肪酸及其苷類等[8， 47-48]。其中，脂肪酸的含量最多，而黃酮類物質(zhì)則是骨碎補(bǔ)的重要活性成分[49]，該物質(zhì)主要包含新北美圣草苷、二氫黃酮類和黃烷醇類等黃酮類成分[6]。二氫黃酮類物質(zhì)柚皮苷是藥典中含量檢測的指標(biāo)性成分，已被廣泛的研究[2， 50-52]。對于苷類，研究者首次得到木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷[53-54]、紫云英苷、阿福豆苷[55]、咖啡酸4-O-β-D-葡萄糖苷[56]、巢菜苷、epiafzelechin-3-O-beta-D-allopyranoside、epiafzelechin等化合物。酚酸是骨碎補(bǔ)重要的活性物質(zhì)之一。骨碎補(bǔ)根莖的甲醇提取物中多酚物質(zhì)與其抗氧化能力呈現(xiàn)正相關(guān)，說明該提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力[57]。骨碎補(bǔ)中含有的甾體類物質(zhì)有β-谷甾醇、β-胡蘿卜苷[58]、5-豆甾烯-3-醇及5-豆甾烯-3-酮。

此外，黃酮類物質(zhì)具有廣泛的藥理作用，如治療骨質(zhì)疏松[59]、促進(jìn)成骨新骨愈合[60]、治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎[61]、治療軟骨發(fā)育不良[62]、治療血脂異常[63]、治療骨折[64-65]等。

4 "展望

骨碎補(bǔ)的觀賞和藥用價(jià)值日漸優(yōu)異，人們的需求量日漸增加，但人類過度濫砍濫伐及骨碎補(bǔ)對其生境的要求等原因，使得骨碎補(bǔ)的野生資源正在受到破壞，被寫入珍稀保護(hù)植物，因此，要加強(qiáng)骨碎補(bǔ)的保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展。值得注意的是，該中藥材的主要來源還是人工種植品。現(xiàn)階段對骨碎補(bǔ)的人工栽培技術(shù)還不夠成熟，要獲取相當(dāng)數(shù)量的人工栽培苗還是比較困難。在未來，可以合理使用繁殖系數(shù)高、生長時(shí)間短、生長環(huán)境條件便于管理等特點(diǎn)的組織快速繁殖技術(shù)獲得大量移栽苗后，再進(jìn)行小苗的移栽試驗(yàn)，從而獲取相當(dāng)數(shù)量的種植苗，推進(jìn)骨碎補(bǔ)的智慧生產(chǎn)，以滿足人們對骨碎補(bǔ)中藥材的需求。此外，也需要切實(shí)落實(shí)珍稀瀕危植物的保護(hù)措施，加強(qiáng)人們對野生資源的保護(hù)及責(zé)任意識(shí)，促進(jìn)人與自然和諧健康發(fā)展，繼續(xù)推動(dòng)野生植物資源保護(hù)，最終實(shí)現(xiàn)可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：易 "婧）

收稿日期：2024-05-22

作者簡介：向聰聰（1997—），在讀碩士，主要從事資源開發(fā)與利用研究。E-mail：1930758324@qq.com。

*為通信作者，E-mail：divinekh@163.com；358360697@qq.com。