硫芥與活性硫醇化合物加合特性的分析研究

關鍵詞硫芥；加合物；谷胱甘肽；半胱氨酸；N-乙酰半胱氨酸

硫芥是指一類具有高反應活性的糜爛性化學戰劑，其中芥子氣（HD）素有“毒劑之王”之稱，屬于經典的糜爛性化學戰劑，多次在戰爭和恐怖襲擊事件中使用[1-2]。HD 具有高反應活性、強糜爛性和多靶點共損傷等特性，可通過皮膚、眼睛和呼吸道等多種途徑侵入人體[3-4]，誘發炎癥、氧化應激、多器官中毒損傷及基因毒性等[5-6]。然而， HD 中毒機理至今尚未完全明確，但一般認為是由于其形成的高度親電中間體環硫鎓離子可與人體內的DNA、N-乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-cysteine， NAC）、半胱氨酸（Cysteine，Cys）和谷胱甘肽（Glutathione， GSH）等多種活性成分形成加合物所致[7]。

GSH、Cys 和NAC 等是體內具有較高反應活性的硫醇類解毒分子，也是防御外源性烷化劑損傷的重要屏障。此外， GSH 還是細胞中重要的抗氧化劑，能清除體內的自由基，具有抵御細胞毒性的作用。研究表明，經HD 的常用模擬劑2-氯乙基乙基硫醚（CEES）暴露后，在生物體內尤其是腦組織中檢測到CEES-GSH、CEES-Cys 和CEES-NAC 等系列加合物，并且駐留時間可達14 d 以上，表明CEES 經皮膚暴露后會誘導神經損傷[8-9]。

化學武器公約（Chemical Weapons Convention， CWC）附表1.A.04[10]中涵蓋了9 種糜爛性毒劑（統稱為硫芥），除了經典的HD 外，還有8 種結構類似物（表1），其粗品不需要進一步純化即可作為毒劑使用。研究表明，含有1～5 個亞甲基的硫芥可能具有更強的糜爛性，如1， 2-二（2-氯乙硫基）乙基（Q）和二（2-氯乙基乙基）醚（T）的糜爛性分別約為HD 的5.0 倍和3.5 倍[11]，大鼠口服Q 和T 半數致死劑量（Median lethaldose， LD50）后，采用定量構效關系（Quantitative structure-activity relationship， QSAR）模型計算得其糜爛性分別是HD 的21 和19 倍[12]；或是與HD 混合使用以增加殺傷力，如芥子氣與乙基倍半芥子氣混合物（HQ）、芥子氣與乙基氧聯芥子氣混合物（HT）等混合型戰劑比HD 的糜爛性更強[11]。除此之外， HD 在儲存或暴露于自然環境中，會自發降解為HD 類似物。如一戰和二戰時期的HD 化學彈藥被大量傾棄于海底或深埋于地下后，隨著時間的推移， HD 在外界環境的作用下逐漸轉化為Q 和T 等，對海洋環境、地下水、掩埋土壤和周邊居民都構成了嚴重威脅[13]。然而，目前相關的研究主要針對HD，其類似物的毒性數據亟需填補和進一步完善。

本研究基于微量定向拼接合成策略，制備了8 種硫芥實體參考品，并采用超高效液相色譜-高分辨質譜聯用（UPLC-MS/HRMS）和高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用（HPLC-MS/MS）方法有效地評價了系列硫芥與不同活性硫醇體外加合特性，發現不同硫芥與GSH 和Cys 的反應速率高于NAC，并且在不同基質中各類加合物的種類及豐度均存在顯著差異。本研究結果為硫芥化合物的暴露診斷、毒理學分析以及醫學救援等提供了重要依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DionexUltiMate 3000 型液相色譜儀和QExactive 型質譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；ACQUITY 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Q-TRAP 5500 型三重四極桿-離子阱串聯質譜儀（美國AB Sciex 公司）；Mili-Q A10 型超純水凈化系統（美國Millipore 公司）；RVC 2-33 離心濃縮儀（德國Christ 公司）；恒溫振蕩水浴（瑞士GingKo 公司）；3k30 高速冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）；DL203 精密電子天平（瑞士Mettler 公司）。

HD（純度gt;96%，中國人民解放軍防化指揮工程學院提供）；GSH、Cys、NAC 和甲酸（分析純，美國Acros Organics 公司）；甲醇和乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；多聚甲醛、氯磺酸、2-巰基乙醇、1，2-二溴甲烷、1，2-二溴丁烷、1，2-二溴戊烷、二氯乙醚、二氯丙醚、3，6-二硫雜-1，8-辛二醇、3，7-二硫雜-1，9-壬二醇、磷酸鹽緩沖液干粉（PBS）、HCl、NaOH 及其它試劑（分析純，國藥集團北京化學試劑公司）。人源血漿（中國人民解放軍總醫院第五醫學中心提供，并經相關倫理道德委員會批準）；人源細胞系人永生化表皮細胞（HaCaT 細胞，由中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心提供）。

1.2 實驗方法

1.2.1 系列硫芥實體制備與結構表征

參照文獻[14]的方法，采用定向拼接策略制備表1 中除HD以外的8 種硫芥類似物。采用GC-MS、1H NMR 和13C NMR 對其結構和純度進行表征鑒定，結果表明，制備的系列硫芥實體化合物的純度gt;95%，可滿足后續實驗要求，相關的表征數據見電子版文后支持信息。

1.2.2 硫芥與不同活性硫醇形成加合物的鑒定

稱取適量的GSH、Cys 或NAC 分別溶于PBS 溶液（0.01 mol/L， pH = 7.4）中，配制成2 mg/L 的溶液。分別取1 mL GSH（Cys 或NAC）溶液置于9 個1.5 mL 塑料離心試管中，加入20 μL 硫芥（50 mg/mL，溶劑為乙腈），混勻，調節溶液pH=8～9，在37 ℃條件下水浴孵育過夜。將孵育溶液稀釋至合適濃度后，進行UPLC-MS/HRMS 檢測。

1.2.3 血漿染毒實驗

將濃度為1 mg/mL 的9 種硫芥（50 μL）分別加入到含150 μL 血漿的1.5 mL 離心管中，隨后加入200 μL 乙腈-甲醇（4∶1， V/V）溶液，渦旋30 s，于4 ℃以14000 r/min 離心10 min，取上清液，于50 ℃離心濃縮至干，加入100 μL 5%（V/V）乙腈溶液復溶，靜置10 min 后渦旋30 s， 以14000 r/min 離心5 min， 移取上清液進行檢測，進樣量為5 μL。

1.2.4 細胞染毒實驗

取對數生長期的HaCaT 細胞，細胞計數后調整濃度至2.5×105 cell/mL，按每孔2 mL 鋪6 孔板，于細胞培養箱（37 ℃， 5% CO2）中培養過夜，棄去培養基，向細胞中分別加入含100 mmoL/L HD（溶劑為二甲基亞砜）的完全培養基，繼續培養4 h。采用PBS 溶液收集完成染毒的細胞， 14000 r/min 離心5 min， 棄上清液。取10 μL 收集到的細胞，加入20 μL PBS 溶液使細胞重懸，在液氮和37 ℃水浴中快速凍融2 次，于4℃以14000 r/min 離心5 min，收集上清液（細胞提取液）。將20 μL 乙腈-甲醇（3∶1， V/V）溶液與10 μL 細胞提取液渦旋混勻，以14000 r/min 離心5 min，沉淀蛋白。將上清液用PBS 溶液適當稀釋，使最終體積為100 μL，待測，進樣體積為10 μL。

1.3 實驗條件

1.3.1 UPLC-MS/HRMS 條件

液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）進行樣品分離，柱溫40 ℃，流動相A 為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動相B 為甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min， 1% B;1～7 min， 1%～99% B；7～8.5 min， 99% B；8.5～10 min， 1% B。進樣體積：2 μL。

質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式，噴霧電壓3.2 kV，離子傳輸溫度320 ℃，霧化溫度320 ℃，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb，掃描模式為全掃描-自動觸發二級質譜掃描（Full MS/dd-MS2），一級分辨率為35000 FWHM，二級質譜分辨率17500 FWHM，掃描范圍為m/z 50～1000 Da，常態化碰撞能量（NCE）為20 和35 eV。

1.3.2 HPLC-MS/MS 條件

液相色譜條件 采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm， 1.7 μm）進行樣品分離，柱溫為40 ℃，流動相A 為0.1%（V/V）甲酸溶液，流動相B 為甲醇溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，1% B；1～7 min， 1%～99% B；7～8.5 min， 99% B；8.5～10 min， 1% B。進樣體積：5 μL 或10 μL，流速為0.25 mL/min。

質譜條件 質譜離子源溫度：550 ℃；電離模式：ESI 正離子源；采集模式：多反應監測（Multiplereaction monitoring， MRM）；氣簾氣（Curtain gas， CUR）：20 psi（1 psi=6.895 kPa）；離子化電壓（IonSprayvoltage， IS）：+5500 V；霧化氣（Gas 1）：55 psi；輔助加熱干燥氣（Gas 2）：55 psi；碰撞室出口電壓（Collision cell exit potential， CEX）：15 eV，入口電壓（Entrance potential， EP）：10 eV；去簇電壓（Declusteringpotential， DP）：70 V 或100 V；碰撞能量（Collision energy， CE）如電子版文后支持信息表S1 所示。

1.4 安全說明

9 種硫芥毒劑均為糜爛性的危險劇毒物品，相關操作均由受過培訓的人員穿戴防護設備在通風良好的通風櫥中進行。實驗結束后，所有接觸過硫芥的容器均采用10% KOH-乙醇溶液及時洗消。

2 結果與討論

2.1 硫芥-硫醇加合物的質譜解析

采用UPLC-MS/HRMS 對3 種硫醇與9 種硫芥的加合物生成情況進行靶向篩查鑒定，結合反應機理推測，采用全掃描質譜篩選和特征母離子提取方式，共鑒定出24 種加合物，名稱及結構式如表2 所示。HD、Q 和CEPR 等6 種硫芥均可在5 min 內與GSH、Cys 和NAC 分子中的硫醇發生親電取代反應生成加合物，并且Cys 和GSH 比NAC 生成加合物的速率更快。CECM、CEME 和CEMEE 由于自身反應活性相對較差，孵育30 min 后才檢測到生成的相關加合物。不同硫芥與3 種硫醇分子加合速率存在差異，其原因是CECM 屬于不對稱烷化劑，其烷基氯基團的親電能力相對較弱[15]。此外，在弱堿性條件下， Cys 比GSH 和NAC 更易發生電離，因此可與硫鎓離子更快進行加合（pKa 分別為8.10、8.83、9.52）[16-19]。系列硫芥與GSH 形成加合物的質譜裂解規律解析（Difflt;5 ppm）見圖1，不同加合物均易在碳硫鍵、碳氧鍵或肽鍵處發生斷裂，圖1 中相同色條展示出了共有的裂解位點。（1）硫芥與GSH 加合物都會形成高豐度的碎片離子m/z 177.0328，為GSH 丟失1 分子谷氨酸（Glu）所致。（2）加合物中羥乙基硫代烷基硫代乙基（—CH2CH2S（CH2）nSCH2CH2OH， n=1～5）由于相差—CH2—，二級質譜裂解碎片也呈現一定的規律性：①GSH 脫去1 分子Glu 或Cly，形成質量數相差14.0157 的低豐度特征碎片離子；②硫芥自身碳硫鍵斷裂形成的特異性碎片，如HO—（CH2）2—S—（CH2）n—或HO—（CH2）2—S—（CH2）n—S—（n=1～5），其中，HD、Q、T 與GSH 加合物的基峰均為m/z 105.0374（HO—（CH2）2—S—（CH2）2—）。（3）隨著硫芥碳鏈增長， 2 個碳硫鍵易同時斷裂，如CEPE 的特征碎片離子—S—（CH2）3—S—（m/z 106.9984）。（4）CECM、CEME、CEMEE 與GSH 加合物基峰碎片與其它硫芥存在顯著差異， CEME-GSH 和CEMEE-GSH 加合物中Glu 還會再丟失硫原子而形成基峰m/z 145.0608，而CEME-GSH 的基峰則為GSH 丟失Clu-NH2 所形成（m/z 162.0219）。

此外，不同硫芥與Cys 和NAC 的加合物也呈現出相似的裂解規律（如電子版文后支持信息圖S1 和S2 所示），其中， Cys-硫芥加合物均產生碎片Cys（m/z 120.0120）， NAC-硫芥加合物共有的基峰為m/z 162.0225（NAC）。因此，在進行盲樣分析時，可通過高豐度的共有碎片離子推斷出其加合硫醇種類，再進一步結合硫芥部分碎裂的特征碎片離子精準鑒定具體硫芥化合物的種類。

2.2 染毒血漿中硫芥與硫醇加合物的鑒定

UPLC-HRMS/MS 具有精確度高和分辨率良好等優勢，可用于硫芥與硫醇分子孵育溶液中所形成未知加合物的快速篩查與鑒定。針對復雜基質樣品中低豐度加合物的檢測，需要采用靈敏度更高且定量分析能力更強的HPLC-MS/MS。分別選擇特異性好和質譜響應高的3對離子對（見電子版文后支持信息表S1），采用HPLC-MS/MS，建立MRM 檢測方法。實驗結果表明，血漿染毒樣品孵育1 h 后，一次進樣可同時完成6 種不同硫芥與3 種硫醇分子形成的加合物的篩查。圖2為不同硫芥與硫醇分子加合物的色譜圖，色譜出峰時間主要集中在2～6 min。提取離子色譜峰的峰面積表明，不同硫芥在血漿中與活性硫醇分子生成加合物的種類和豐度差異顯著，其中，與Cys 形成的加合物的含量明顯高于GSH 和NAC，這與前述的不同硫醇分子的反應活性以及血漿中3 種硫醇分子的豐度一致（Cysgt;GSHgt;NAC）[20]。此外，不同硫芥自身反應活性存在差異，導致檢出的加合物的種類不同，如活性較高的Q、T與3種硫醇分子（GSH、Cys和NAC）均可生成加合物；HD、CEPR 和CEBU、CEPE僅可檢測到GSH 和Cys 的加合物；活性較低的CEME 和CEMEE僅檢測到CEME-Cys加合物；活性最差的CECM無加合物檢出。

2.3 染毒細胞中硫芥-硫醇加合物的確證分析

為更準確地預測硫芥與生物體內硫醇分子之間的相互作用，探究潛在的毒理機制，考察了染毒細胞中不同硫芥與硫醇加合物的生成情況。皮膚是硫芥中毒的最主要的靶器官之一，硫芥暴露后會引起皮膚糜爛和壞死等病理變化。前期預實驗結果表明， 100 μmol/L 的染毒劑量不會誘導大量的HaCaT 細胞死亡。基于建立的MRM 分析方法，對染毒細胞提取液進行篩查鑒定，結果如圖3 所示，除CECM、CEME和CEMEE 外，其余5 種硫芥均可與細胞內的GSH 和Cys 形成加合物，并且與GSH 形成加合物的豐度顯著高于Cys，這與血漿加合物的生成情況存在顯著差異，其主要原因可能是由于細胞中GSH 含量（1～10 mmol/L）遠高于Cys（3～5 μmol/L）[20]。其中， Q 與GSH 和Cys 生成加合物的含量最高，預示其可能具有更高的細胞毒性和反應活性。此趨勢與文獻[21-22]中Q 與HSA 的生物標志物鑒定工作中所提及的Q 比HD 更易與HSA 形成加合物的結果相符，其原因可能是Q 更易形成“雙硫鎓”離子過渡態，對巰基具有更強親和力。此外，沒有檢出9 種硫芥與NAC 形成的加合物，此結果與Roser 等[8]在細胞中未檢測到HD 及其模擬劑CEES 與NAC 加合物的結果類似，其原因可能是NAC 與硫芥類毒劑的活性較Cys和GSH 差，并且與其在細胞中含量較低有關。

3 結論

優化了《化學武器公約》中的9 種硫芥的實體參考品微量定向合成方法，并采用UPLC-MS/HRMS 對不同硫芥與GSH、Cys 和NAC 的試管孵育反應液進行分析，共鑒定出24 種加合物。基于Pubmed、WebOf Science、Scopus 和Reaxys 等網絡數據庫，按主題、摘要和結構式對鑒定加合物進行查新檢索（檢索時間跨度為1999～2024 年）。結果表明，除HD 與GSH、Cys 和NAC 形成的3 種加合物已有文獻報道外，其它硫芥與GSH、Cys 和NAC 形成的21 種加合物均為全新結構。進一步建立了基于HPLC-MS/MS 的MRM 分析方法，對染毒血漿樣品中不同硫芥與幾種活性硫醇的加合物進行確證分析，發現不同硫芥反應活性存在顯著差異，其中， Q 和T 反應活性都顯著強于HD，而CECM、CEME 和CEMEE 反應活性較弱；幾種硫芥與NAC 形成加合物的豐度低于GSH 與Cys；而染毒細胞實驗結果表明，不同硫芥與GSH的加合物含量要遠高于Cys 和NAC，其原因是除胞內GSH 含量高于其余兩種硫醇化合物外， Q、T 和其余幾種長碳鏈的硫芥具有更強的細胞膜穿透能力。總之，通過研究不同硫芥與幾種重要硫醇分子的加合特性，發現Q、T、CEBU 和CEPE 的反應活性高于HD，預示其可能具有更強的體內暴露毒性，相關的研究結果為揭示系列硫芥的毒效應及溯源確證等提供了重要依據。