基于預涂納米碳-十二烷基硫酸鈉復合基質的基質輔助激光解吸電離質譜分析與豬腦組織切片質譜成像

關鍵詞基質輔助激光解吸電離質譜；納米碳基質；十二烷基硫酸鈉；組織切片；質譜成像

基質輔助激光解吸電離質譜（MALDI-MS）作為一種軟離子化技術，具有高選擇性、高靈敏度和信號峰易于解析等優勢[1]。在MALDI-MS 分析中，基質是用于促進分析物脫附和離子化的化合物，理想的基質在紫外區域具有高吸收系數，能夠高效分離和提取目標物質，不產生或產生很小的分析物碎片，對檢測結果的影響極小[2]。因此， MALDI-MS 的優異性能在很大程度上取決于基質的選擇。然而，傳統的有機基質，如2，5-二羥基苯甲酸（DHB）[3]、α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）[4]和芥子酸（SA）[5]等的分子量低，易電離，在質譜檢測過程中產生的分子和碎片離子峰會抑制低質量區域的分析物信號[6]。因此，無機納米材料被用做MALDI-MS 的基質，其中，碳納米材料因具有成本低、紫外吸收強、表面官能團和電子性質可調等優點而得到廣泛應用。Chen 等[7]以碳納米點為基質建立了MALDI-MS 方法，對十八烷酸具有極低的檢出限（0.2 fmol），并且在正負離子兩種模式下均獲得了清晰的鈉和鉀加合物（正離子）以及脫質子（負離子）的MS 峰。Wang 等[8]以蠟燭不完全燃燒產生的碳煙納米顆粒作為MALDI-MS 基質，分析葡萄糖、脂肪酸和染料等分子時顯示出較高的靈敏度和重現性。Xu 等[9]將單層氧化石墨烯懸浮液吸附于導電玻璃表面制備預涂基質薄膜，并將大鼠腦組織切片置于預涂薄膜上開展MALDI-MS 實驗，檢測到60 余種脂質和小分子，包括磷脂、環磷酸腺苷、肌苷和膽固醇等。這種預涂基質法不需要使用基體覆蓋物，可以減少樣品成分擴散，提高重復性，并簡化實驗步驟。

然而，將碳納米材料直接分散于溶劑中通常會出現納米顆粒團聚情況，團聚嚴重時會使基質涂覆不均勻，影響MALDI-MS 實驗的重復性。表面活性劑常用于輔助納米材料在溶劑中的分散，不僅可以避免溶劑中的納米材料團聚，而且有助于納米材料作為基質預涂在靶板或均勻涂覆在切片上，改善MALDI-MS分析的重復性。Yazdabadi 等[10]分別以十二烷基硫酸鈉（SDS）和辛基硫酸鈉（SOS）兩種表面活性劑作為基質，研究了MALDI-MS 分析不同氨基酸加合Na+的差異。Guo 等[6]將十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）添加到α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA）中抑制基質相關離子的干擾信號，分析了氨基酸、肽、藥物、環糊精及其混合物等小分子成分。Grant 等[11]將CTAB 作為CHCA 的基質離子抑制劑，分析了高糖能量飲料中的B 族維生素和咖啡因。Kosanam 等[12]在CHCA 和2，5-二羥基苯甲酸（DHB）中添加CTAB 抑制基質相關的背景離子，但測試化合物的信號也會被抑制。Banstola 等[13]在芥子酸中添加3 種表面活性劑（SDS、Triton X100 和Tween 20），考察添加劑對大鼠腦組織中大分子蛋白的峰數量和峰強度的影響。上述研究中，表面活性劑作為基質或者與常規基質復合，可用于MALDI-MS 分析。

基于上述表面活性劑運用于常規基質的研究，以及表面活性劑在納米顆粒中的作用，本研究選擇納米碳-SDS 復合基質作為預涂基質，用于MALDI-MS 分析。SDS 改善了基質溶液穩定性，降低了納米碳基質的背景干擾峰，增強了目標峰離子強度和信噪比，獲得了較好的峰強度重復性，具有良好的定量分析能力。最后，將納米碳-SDS 復合預涂基質用于豬腦局部組織中的小分子化合物和脂類成分的質譜成像分析。本研究為在MALDI 基質中合理使用表面活性劑提供了新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SolariX 7.0 型傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT-ICR-MS，瑞士Bruker 公司），配備Nd∶ YAG 二極管泵浦固體激光器（波長為355 nm）；ZS90 型Zetasizer Nano 納米粒度電位儀（英國馬爾文儀器有限公司）；Tecnai F20 型場發射透射電子顯微鏡（荷蘭菲利浦公司）；UV-3900 型紫外可見近紅外分光光度計（日本島津公司）；BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；PS-100A 型超聲波清洗機（東莞市潔康超聲波設備有限公司）；HD-180 型噴槍（寧波浩盛氣動機械有限公司）；Milli-Q 純水儀（默克密理博實驗室設備（上海）有限公司）。

納米碳（99.5%， 30 nm）、Triton X 100 和安息香（上海麥克林生化科技有限公司）；DHB（99%，北京百靈威科技有限公司）；CHCA（99%）、L-苯丙氨酸（99%）、腺苷、SDS、CTAB 和明膠（上海泰坦科技股份有限公司）；1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿（DPPC，美國Avanti Polar Lipids 公司）；膽固醇（上海玻爾化學試劑有限公司）；環磷腺苷（上海畢得醫藥科技有限公司）。包埋劑Tissue-Tek OCT Compound（美國Sakura Finetek 公司）；帆船牌玻璃載玻片（76.2 mm×25.4 mm×1 mm， 上海泰坦科技股份有限公司）。實驗用水為經Milli-Q 系統處理的超純水（18.2 MΩ·cm）。新鮮豬腦購自本地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 基質溶液和標準品溶液的配制

（1）納米碳-表面活性劑復合基質分別按照質量比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、10∶1、16.5∶1 和20∶1 制備納米碳-SDS 復合基質；分別按照CTAB 與Triton X 100 表面活性劑質量比為2∶1 和16.5∶1 制備納米碳-表面活性劑復合基質。將5 mg/mL 納米碳與表面活性劑分別按比例分散于水中，超聲振蕩20 min 后，以10000 r/min 磁力攪拌100 min；將混合溶液轉移至帶蓋離心管，冷藏，備用。復合基質使用前超聲振蕩20 min，防止納米碳團聚。（2）有機基質、純納米碳基質和SDS 基質的制備將CHCA 溶于乙腈-水（50∶50， V/V）中，配制成10 mg/mL 溶液。將DHB 溶于甲醇-水（50∶50， V/V）中，配制成10 mg/mL 的溶液。將純納米碳直接超聲分散于水中，配制方法與納米碳-表面活性劑復合基質相同，濃度為5 mg/mL。將SDS 溶于水中（SDS 的用量與質量比16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質中的SDS 用量相同）。（3）標準品溶液的制備將標準品L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、環磷腺苷和腺苷溶于水，膽固醇和三油酸甘油酯溶于甲醇， DPPC 溶于二氯甲烷，超聲5 min 使其充分溶解，分別配制成1 mg/mL 的溶液。

1.2.2 基質噴涂與樣品準備

納米碳基質預涂移取200 μL 基質于噴槍中，噴槍噴嘴垂直于載玻片，距離約10 cm， 流量旋鈕調至最小值，待溶液噴完后，靜置5 min 晾干，取2 μL 標準品溶液直接點樣于基質涂層，用于后續檢測。

有機基質用移液槍移取2 μL CHCA 或DHB 基質，點樣在載玻片上，完全干燥后，取2 μL 標準品溶液點樣在基質溶液上，用于后續檢測。

1.2.3 組織切片和MALDI-MS分析參數

新鮮豬腦切分成小塊，利用明膠溶液（10%， m/V）包埋，于?20 ℃冷凍保存，備用。使用石蠟切片機對冷凍的豬腦局部組織進行切片，切片厚度為15 μm， 固定于覆有預涂基質的載玻片上，在真空干燥器中干燥20 min 后，進行質譜分析。

MALDI-MS 儀器參數：質譜測定均采用正離子模式，檢測范圍為m/z 53～1500，飛行時間設置為0.8 ms， 平均光譜累積35 次，激光能量為75%，選擇“Minimum”模式。質譜成像時步長為150 μm。

2 結果與討論

2.1 基質比例和種類的選擇

如圖1A 和1B 所示，在相同質譜條件下，使用不同質量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、10∶1、16.5∶1 和20∶1）的納米碳-SDS 復合基質對腺苷和環磷腺苷進行MALDI-MS 分析。基于[M+Na]+和[M+K]+峰的信號強度，采用質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質檢測的腺苷和環磷腺苷信號峰均以[M+Na]+峰為主，其峰值明顯高于其它質量比的納米碳-SDS 復合基質。除質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質外，質量比為2∶1 的納米碳-SDS 復合基質獲得的峰強度高于其它質量比的納米碳-SDS 復合基質。因此，本研究選用質量比為2∶1 和16.5∶1 的納米碳-表面活性劑復合基質檢測L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、腺苷、環磷腺苷和膽固醇，采用的表面活性劑包括Triton X 100、SDS 和CTAB，如圖1C、圖1D 和電子版文后支持信息圖S1 所示，采用質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質檢測各標準品時所獲得的峰強度最高。對比發現，質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質用于MALDI-MS 分析時產生的背景干擾峰少于質量比為2∶1 的納米碳-SDS 復合基質。如圖1E 和1F 所示，在相同質譜條件下，基于[M+Na]+和[M+K]+峰表現出的信號強度，使用質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質檢測腺苷和環磷腺苷的信號強度明顯高于其它納米碳-表面活性劑復合基質和常規基質。具體峰強度和信噪比結果見電子版文后支持信息表S1和S2。基于此，本研究選用質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質用于后續實驗。

以SDS 為基質，采用MALDI-MS 檢測基質背景峰和環磷腺苷，結果如圖2A 和2B 所示。其中SDS 濃度與電子版文后支持信息表S2 中的納米碳-SDS 復合基質（16.5∶1）中SDS 的濃度相同，在m/z 311 處出現SDS 較強的[M+Na]+峰，這會影響m/z 300 的分析物的檢測。如圖2C 所示，使用質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質檢測時， m/z 311 處的SDS 基質峰強度減弱，對目標化合物的干擾也相應減小，同時提升了峰強度和信噪比。采用SDS 基質檢測L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、腺苷和膽固醇驗證了此結論，結果如電子版文后支持信息圖S2 和表S3 所示。上述結果表明，納米碳-SDS 復合基質是性能良好的MALDI-MS 基質，其性能優于單獨納米碳基質或單獨SDS 基質。

2.2 基質溶液的穩定性

在相同的實驗條件下，觀察新制備得到的納米碳-SDS 復合基質溶液和純納米碳基質溶液，二者均分散均勻，無團聚情況。放置14 d 后，納米碳-SDS 復合基質溶液仍保持穩定均勻的狀態，而純納米碳基質溶液出現分層，底部出現團聚。這表明加入表面活性劑SDS 有助于納米碳分散，可提高其穩定性。

2.3 納米碳-SDS 復合基質的表征

納米碳-SDS 復合基質的透射電子顯微鏡（TEM）圖如圖3A 所示。圖3B 為納米碳-SDS 復合基質、納米碳-Triton X 100 復合基質和納米碳-CTAB 復合基質在250～500 nm 處的吸收光譜， 3 種基質的最高吸收峰均在325 nm 附近，其中，納米碳-SDS 復合基質的吸收峰最高，在這個范圍內的吸收響應最好。如圖3C和3D 所示，純納米碳基質的Zeta 電位為15.9 mV， 納米碳-SDS 復合基質的Zeta 電位為?28.6 mV。向納米碳顆粒中加入SDS 后， Zeta 電位的絕對值變大，分散性提高，表明納米碳-SDS 復合基質的分散性優于純納米碳基質。

2.4 MALDI-MS 實驗條件的選擇

選擇膽固醇、三油酸甘油酯、DPPC、硬脂酸和蔗糖5 種標準品，激光能量以10% 的間隔從85% 降低到35%，考察激光能量對峰強度的影響。如圖4A 所示，不同化合物的質譜峰強度與激光能量的關系存在差異，當激光能量為75%時， 5 種樣品的響應均比較高，因此后續實驗選擇激光能量為75%。

在激光能量為75%時，選擇上述5 種標準品，掃描次數以5 次為間隔從20 次增至40 次，考察掃描次數對質譜峰強度的影響。如圖4B 所示，掃描35 次后，各樣品峰強度增加緩慢。綜合考慮質譜響應和檢測時間，后續實驗選擇掃描次數為35 次。

2.5 重復性考察

在激光能量為75%、掃描次數35 次的條件下，考察標準品的[M+Na]+峰強度的點內和點間重復性。評價點內重復性時，將一個標樣點按“井”字劃分為9 個區域，每個區域采集圖譜3 次并取平均值，最后計算9 個區域的峰強度平均值的相對標準偏差（RSD）；點間重復性是同一片預涂基質上分別點樣9 個標樣點，每個樣品點采集3 次數據并取平均值，計算9 個樣品點的峰強度平均值的RSD。

如圖5A 和5B 所示，采用純納米碳基質檢測三油酸甘油酯標準品的峰強度點內重復性（RSD）為6.21%，點間重復性為13.66%。如圖5C 和5D 所示，采用質量比為16.5∶1 的納米碳-SDS 復合基質檢測膽固醇、DPPC 和三油酸甘油酯的點內重復性分別為4.0%、5.0%和3.3%，點間重復性分別為5.2%、6.7%和5.7%。點內和點間重復性均低于7.0%，表明納米碳-SDS 復合基質用于MALDI-MS 分析具有較好的重復性。采用不添加SDS 的純納米碳基質檢測三油酸甘油酯時，點間重復性較差，這可能是納米碳團聚導致；加入SDS 后重復性提高，這是因為SDS 對納米材料的分散作用降低了納米碳團聚。

2.6 峰強度與濃度的線性關系考察

分別移取2 μL 不同濃度（0.05～1.00 mg/mL）的環磷腺苷和DPPC 溶液，點樣于覆有納米碳-SDS 復合基質鍍層的載玻片上，測定質譜峰強度，考察環磷腺苷和DPPC 的濃度與峰強度的線性關系。每個濃度標準樣品的質譜峰強度為通過重復3 次實驗求平均值所得，質譜峰強度均以[M+Na]+峰測定， 3 次質譜峰強度的標準偏差均小于3%。如圖6 所示，各標準品濃度與質譜峰強度具有較好的線性關系，線性相關系數R2gt;0.993。按照3.3 倍截距標準差除以斜率估算檢出限[14]，環磷腺苷和DPPC 的檢出限分別為75 和79 μg/mL。

2.7 對豬腦局部組織的質譜成像

將豬腦局部組織固定于覆有納米碳基質鍍層的載玻片上，在真空干燥箱中干燥20 min， 進行MALDI-MS分析及質譜成像。

利用HMDB（http：//www.HMDB.ca）數據庫并參考文獻[5，15]方法對化合物進行初步識別，共識別出97 個質譜峰，包括谷氨酰胺（Glutamine）、肌苷（Inosine）、磷脂酰甘油（PG）和磷脂酰絲氨酸（PS）各1 種，固醇類、環磷脂酸（CPA）、脂酰肉堿（Carnitine）、溶血磷脂類和鞘磷脂（SM）各2 種， 3 種神經酰胺（Cer），4 種脂肪酸（FA）， 5 種磷脂酰膽堿（PC）， 6 種甘油二酯（DG）， 9 種己糖神經酰胺（HexCer）， 19 種磷脂酸（PA）， 21 種磷脂酰乙醇胺（PE），誤差在±6 ppm（×10–6）以內。表1 總結了識別出的部分化合物成分，全部數據見電子版文后支持信息表S4。豬腦中脂質含量豐富，本研究中檢出的化合物以脂類為主。

由圖7 中的光學圖可見，此豬腦組織分為腦白質和腦灰質兩部分。成像結果顯示， PA （34∶1）、PA （36∶2）和PE （38∶4）主要集中在腦灰質部分，在腦白質中含量較少；PA （38∶2）、HexCer （d40∶1 （2OH））和HexCer （d42∶2）在腦白質中含量較多，尤其是HexCer （d42∶2 （2OH））、HexCer （d42∶1 （2OH））在腦白質中的含量非常豐富。此外， PE （40∶6）在腦白質和腦灰質中含量都十分豐富，在腦白質中更多。上述結果表明，納米碳-SDS 復合基質可用于質譜成像，具備觀察生物成分分布的潛質。

3 結論

相較于常規基質、納米碳-CTAB 復合基質和納米碳-Triton X 100 復合基質，納米碳-SDS 復合基質在檢測氨基酸、環磷腺苷和膽固醇等小分子化合物以及生物組織成像方面具有獨特優勢，如降低背景峰離子、增強目標峰強度和提升目標峰信噪比。本研究將納米碳-SDS 復合預涂基質用于豬腦組織切片的MALDI-MS 成像，可以觀察到其腦白質和腦灰質中的成分分布存在差異。相較于單一納米碳基質，表面活性劑SDS 的加入有助于提高基質的穩定性，減少納米顆粒團聚，因此可以增強測試的重復性及穩定性。結合預涂基質方法，有助于簡化MALDI-MS 實驗操作，擴大其應用范圍。