基于BDNF/CREB信號通路探討藏藥十一味維命膠囊的抗抑郁作用機制

摘要：目的 基于BDNF/CREB信號通路對藏藥十一味維命膠囊對抑郁癥小鼠的抗抑郁作用及機制進行研究。方法 將48只小鼠隨機分為正常組（n=12）、造模組（n=36），造模組采用CUMS結合CRS方法造模3周。成模后，將造模組小鼠隨機分為模型組、十一味維命膠囊組（藏藥組）、氟西汀組，各12只，干預4周。采用行為學實驗對抑郁癥小鼠模型進行評估。WB法檢測小鼠海馬BDNF、GDNF、NGF、p-CREB/CREB、PSD-95表達；IHC法檢測小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值。結果 造模3周后，造模組小鼠出現抑郁樣行為，小鼠體質量、糖水偏好率均低于正常組（P<0.01）；不動時間長于正常組（P<0.01）；給藥4周后，模型組小鼠體質量、糖水偏好率低于正常組（P<0.01）；不動時間長于正常組（P<0.01）；藏藥組、氟西汀組小鼠體質量、糖水偏好率均高于模型組（P<0.05或P<0.01）；不動時間均短于模型組（P<0.01）。模型組小鼠海馬BDNF、GDNF、PSD-95蛋白表達及BDNF、GDNF、p-CREB MOD值均低于正常組（P<0.05或P<0.01）。藏藥組、氟西汀組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB/CREB、PSD-95蛋白表達均高于模型組（P<0.05或P<0.01）。藏藥組小鼠BDNF、GDNF MOD值均高于模型組（P<0.05或P<0.01）；氟西汀組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值均高于模型組（P<0.01）。結論 十一味維命膠囊可以改善抑郁癥小鼠的抑郁行為，其作用機制可能與調控BDNF/CREB信號通路有關。

關鍵詞：抑郁癥；十一味維命膠囊；BDNF/CREB信號通路；小鼠

中圖分類號：R749.4+1 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2024）08-0061-07

抑郁癥是臨床上較為常見的慢性精神障礙，其常見癥狀主要包括持續性心境低落、快感缺失、思維遲緩及睡眠障礙等，嚴重者可伴有自殘、自殺傾向，對人類身心健康造成嚴重危害［1-2］。據世界衛生組織（WHO）調查顯示，全球約有3.22億人受到了抑郁癥的困擾，且發病率呈逐年上升的趨勢［3］。因此，如何有效防治抑郁癥是目前醫學界亟待解決的問題之一。藥物治療是目前臨床治療抑郁癥的主要手段，但由于抑郁癥發病機制的復雜性，以及常用的抗抑郁藥物存在起效慢、有效率低、不良反應多等缺陷，導致其治療效果不佳［4］。近年來研究［5-6］顯示神經可塑性障礙參與了抑郁癥的發生，而通過各種方法激活腦內BDNF/CREB信號通路，有助于增強大腦神經可塑性，進而產生抗抑郁的效果［7-9］。

藏醫學是祖國醫學的重要組成部分，對精神類疾病具有其獨特的認識及治療手段。藏藥是藏醫治療疾病的最主要手段，十一味維命膠囊是用于治療抑郁癥的有效藏成藥，但究其發揮抗抑郁作用的機制尚不清楚。因此，本研究通過CUMS結合CRS的造模方法制備抑郁癥小鼠模型，并通過觀察十一味維命膠囊對抑郁癥小鼠模型的行為學以及海馬內BDNF/CREB信號通路的影響，來探討十一味維命膠囊抗抑郁的潛在作用機制，為十一味維命膠囊的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 十一味維命膠囊（青海久美藏藥藥業有限公司，批號：20200601）；百優解（鹽酸氟西汀膠囊）（禮來蘇州有限公司，批號：21201A）；BDNF、GDNF（WB）、GDNF（IHC）、NGF、CREB、p-CREB、PSD-95抗體（美國Abcam公司，貨號分別為ab108319、ab176564、ab18956、ab52918、ab32515、ab32096、ab238135）。β-tubulin、羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG抗體（美國Proteintech公司，貨號分別為66240-1-Ig、SA00001-2、SA00001-1）。

1.2 儀器與設備 電泳儀系統（美國BIO-RAD公司，型號：PowerPac Basic），超聲破碎儀（美國SONICS公司，型號：VCX150），全自動化學發光分析儀（上海天能有限公司，型號：5200），低溫高速離心機（德國Eppendorf公司，型號：5404），病理切片機（中國上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016），全景切片掃描儀（匈牙利3Dhistech公司，型號：800）。

1.3 實驗動物 SPF級 BALB/c小鼠48只（雄性，20±3 g），于北京維通利華實驗動物技術有限公司購買（合格證號：SYXK（京）2020-0033）。實驗前進行為期1周的適應性喂養。本實驗經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準，動物倫理號：BUCM-4-2021091001-3058。

1.4 造模及藥物干預 于正式實驗開始前期，應用糖水偏好實驗剔除糖水偏好率異常的小鼠。將符合條件的48只小鼠以體質量進行隨機分組：正常組（n=12）、造模組（n=36）。結合本課題組前期的抑郁癥造模方法［10］，經過改良后對造模組進行造模，持續3周。具體造模方法如下：（1）CRS：于每日上午9時在離心管中對小鼠進行為期6 h的束縛（離心管規格為50 mL）；（2）CUMS：①晝夜顛倒；②夾尾3 min；③禁食24 h；④潮濕墊料24 h；⑤持續光照24 h；⑥籠體傾斜45°，持續24 h；⑦禁水24 h。每日采用1種CUMS應激源，每種應激源不得連續應用，且禁食與禁水不得連續應用。

造模持續3周后，通過糖水偏好實驗和懸尾實驗對抑郁癥小鼠模型進行評估。成模后，將造模組小鼠以體質量隨機分為3組：模型組（n=12）、十一味維命膠囊組（n=12）、鹽酸氟西汀組（n=12）。給藥劑量以動物與人體之間的等效劑量系數折算法進行計算，并應用蒸餾水進行相應濃度溶液的配制，具體灌胃劑量如下：十一味維命膠囊組小鼠應用十一味維命膠囊溶液灌胃，234.0 mg·kg-1·d-1；氟西汀組小鼠應用鹽酸氟西汀溶液灌胃，5.2 mg·kg-1·d-1。正常組與模型組小鼠，每日應用等體積蒸餾水灌胃。實驗小鼠的灌胃量為0.1mL·10 g-1，2次/d，于每日8時及16時給藥，持續4 W。

1.5 行為學檢測

1.5.1 體質量 計算造模3周末及給藥4周末實驗小鼠的體質量，用以評估小鼠的生長情況。

1.5.2 糖水偏好實驗 計算造模3周末及給藥4周末實驗小鼠的糖水偏好率，糖水偏好率的上升與下降可以反映動物快感缺失的程度。進行正式的糖水偏好實驗前，需要提前對全部實驗小鼠進行糖水訓練。首先給予小鼠兩瓶蔗糖溶液（1%），持續24 h。隨后給予小鼠蔗糖溶液（1%）和蒸餾水各1瓶，持續24 h。接下來將小鼠禁食禁水12 h。正式測試過程中，給予小鼠蔗糖溶液（1%）和蒸餾水各1瓶。2 h后計算各組小鼠2 h內糖水消耗量百分比。糖水消耗量百分比=［蔗糖消耗量·（蔗糖消耗量+蒸餾水消耗量）-1］×100%［11］。

1.5.3 懸尾實驗 計算造模3周末和給藥4周末小鼠懸尾不動時間，不動時間的延長與縮短可以反映動物的行為絕望程度［12］。將實驗小鼠懸掛于觀察箱頂部，使小鼠的頭部自然垂直向下，持續5 min。記錄后4 min內小鼠的不動時間。

1.6 免疫印跡法（western blot，WB）檢測海馬組織BDNF、GDNF、NGF、p-CREB/CREB、PSD-95的蛋白表達 每組選取6只小鼠進行WB檢測。取小鼠海馬組織，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量。隨后上樣、電泳、電轉以及5%脫脂牛奶封閉。封閉完成后，加入對應的一抗：BDNF（1∶1000）、GDNF（1∶1000）、NGF（1∶1000）、CREB（1∶1000）、p-CREB（1∶5000）、PSD-95（1∶1000），β-tubulin（1∶30000），放置于冰箱內以4℃孵育過夜。隨后加入對應的二抗進行孵育：羊抗兔IgG（1∶10000），羊抗鼠IgG（1∶10000），以室溫條件孵育1.5h。采用ECL發光法進行曝光。采用Image J軟件對條帶的灰度值進行分析。

1.7 免疫組化法（Immunohistochemistry，IHC）檢測海馬組織BDNF、GDNF、p-CREB 的MOD值 每組選取6只小鼠進行IHC檢測。將小鼠腦組織制備成石蠟切片。進行IHC檢測時，對小鼠腦組織切片依次進行脫蠟至水、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、封閉。隨后滴加對應的一抗：BDNF（1∶500）、GDNF（1∶200）、p-CREB（1∶100），以4℃孵育過夜。再滴加對應的二抗，以室溫孵育30～50min。隨后，DAB法染色、蘇木素復染、脫水、封片，進行觀察。組織出現褐色或棕褐色為陽性表達。采用Image-pro Plus 6.0軟件進行分析。

1.8 統計分析 數據采用SPSS 26.0軟件進行分析，計量資料以“均數±標準差”表示。當數據符合正態分布且方差齊時，2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析（One-Way Anova），兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合時，則采用非參數檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 模型評價 造模3周后，與正常組比較，造模組小鼠體質量、糖水偏好率均明顯下降（P<0.01）；造模組小鼠不動時間明顯延長于正常組（P<0.01）。（見表1）

2.2 藥效評價 治療4周后，與正常組比較，模型組小鼠體質量、糖水偏好率均明顯下降（P<0.01）；不動時間明顯延長（P<0.01）。與模型組比較，氟西汀組小鼠的體質量、糖水偏好率均明顯上升（P<0.05或P<0.01）；不動時間明顯縮短（P<0.01）。與模型組比較，十一味維命膠囊組小鼠的體質量、糖水偏好率均明顯上升（P<0.01）；不動時間明顯縮短（P<0.01）。（見表2）

2.3 各組小鼠海馬BDNF、GDNF、NGF、p-CREB/CREB、PSD-95蛋白表達比較 治療4周后，與正常組比較，模型組小鼠海馬BDNF、GDNF、PSD-95蛋白表達均明顯下降（P<0.01）；而NGF、p-CREB/CREB蛋白表達暫無明顯統計學差異（P>0.05）。與模型組比較，鹽酸氟西汀組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB/CREB、PSD-95蛋白表達均明顯上升（P<0.05或P<0.01）；而NGF蛋白表達暫無明顯統計學差異（P>0.05）。與模型組比較，十一味維命膠囊組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB/CREB、PSD-95蛋白表達均明顯上升（P<0.05或P<0.01）；而NGF蛋白表達暫無明顯統計學差異（P>0.05）。（見表3、圖1）

2.4 各組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值比較 治療4周后，與正常組比較，模型組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值均明顯下降（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，鹽酸氟西汀組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值均明顯上升（P<0.01）。與模型組比較，十一味維命膠囊組小鼠海馬BDNF、GDNF值均明顯上升（P<0.05或P<0.01），而p-CREB暫無明顯統計學差異（P>0.05）。（見表4、圖2）

3 討論

抑郁癥作為一種慢性精神疾病，因其嚴重時會有自殘或自殺的傾向，所以對人們的生命健康造成嚴重危害。由于目前對于抑郁癥的病因及發病機制尚未完全明確，且臨床常用抗抑郁藥物存在多種不良反應，導致抑郁癥治療受到局限。大量研究顯示，藏醫藥在抑郁癥的治療中具有獨特優勢，且安全性好、副作用少［13-14］。十一味維命膠囊是藏醫臨床用于抑郁癥治療的有效藏成藥，包括肉豆蔻、沉香、廣棗等十一味藥物。通過對十一味維命膠囊藥物成分進行分析發現，方中阿魏含有阿魏酸，阿魏酸能夠顯著上調抑郁癥動物腦內BDNF、PSD-95及p-CREB的含量，增強神經可塑性［15-16］；方中丁香含有丁香酚，同樣具有調節BDNF的作用［17］；方中廣棗含有黃酮、有機酸、甾醇等，其水提液能夠通過刺激星形膠質細胞分泌多種神經營養因子，GDNF作為維護神經可塑性的營養因子，主要來源于星形膠質細胞［18］。

本研究以CUMS結合CRS的方法模擬人類持續性應激所導致的抑郁癥表現，誘導小鼠產生抑郁樣行為。行為學結果顯示：經過3周造模后，造模組小鼠體質量、糖水偏好率較正常組均明顯下降，不動時間較正常組明顯延長，提示抑郁癥小鼠模型制備成功。經過4 W的藥物干預后，兩給藥組的小鼠體質量、糖水偏好率較模型組均明顯上升，不動時間較模型組均明顯縮短。表明十一味維命膠囊對抑郁癥小鼠的抑郁樣行為具有顯著的改善作用。

神經可塑性是指神經系統通過調節其結構、功能及連接進而對各種內外部刺激做出適應性改變的能力。據文獻顯示，神經可塑性障礙是導致抑郁癥發生的重要原因之一［19-21］。而腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質細胞源性神經營養因子（Glial derived neurotrophic factor，GDNF）、神經生長因子（nerve growth factor，NGF）作為腦內重要的神經營養因子，廣泛的參與了腦內神經元發育、成熟、存活及突觸可塑性過程，對神經可塑性的維持具有重要支持作用［22-24］。環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）是神經可塑性以及情緒調節的關鍵因子［25-26］。活化后的CREB能夠進一步激活下游的信號分子，參與到神經樹突的形成與發育過程，并促進突觸傳遞功能等。具體來說，CREB是BDNF發揮作用的重要調節因子，當腦內CREB高表達時，可以促進BDNF的表達，而BDNF又能夠與其高親和力受體緊密結合，進一步介導CREB的功能發揮，二者相輔相成，共同維護神經可塑性過程。突觸后致密物質-95（postsynaptic density-95，PSD-95）是突觸后末端重要標記物，作為突觸重要的結構蛋白，參與突觸后膜受體的激活及下游信號的傳導［27］。實驗結果顯示：WB：治療4周后，模型組小鼠海馬BDNF、GDNF、PSD-95蛋白表達較正常組明顯下降；NGF、p-CREB/CREB蛋白表達則暫無明顯統計學差異。兩給藥組的小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB/CREB、PSD-95蛋白表達較模型組均明顯上升；而NGF蛋白表達暫無明顯統計學差異。IHC：治療4周后，模型組海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值較正常組均明顯下降。氟西汀組小鼠海馬BDNF、GDNF、p-CREB MOD值較模型組均明顯上升；十一味維命膠囊組小鼠海馬BDNF、GDNF MOD值較模型組明顯上升，p-CREB MOD值暫無明顯統計學差異。上述結果提示十一味維命膠囊可以通過激活BDNF/CREB信號通路以及促進神經可塑性相關因子的分泌，發揮抗抑郁的作用。

綜上所述，十一味維命膠囊具有抗抑郁作用，其機制可能與調控BDNF/CREB信號通路，增強神經可塑性密切相關。本研究為十一味維命膠囊的臨床應用提供了實驗依據。

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