不同白油佐劑制備的雞新城疫、 禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗的比較試驗

摘 要：為研究不同白油佐劑制備的滅活疫苗免疫效果，試驗采用2個廠家的3個國外進口白油樣品、1個國產白油樣品，制備4批雞新城疫、禽流感（H9亞型）（La Sota株+WD株）二聯滅活疫苗（以下簡稱：雞新-流二聯滅活疫苗），分別標A、B、C、D，按照現行版《中華人民共和國獸藥典》方法，進行性狀、安全檢驗、抗體檢測以及吸收情況對比。結果表明，4批樣品析出量均小于0.1 mL，穩定性合格。黏度對比結果，進口白油B最低27.6 cP、進口A 48.2 cP、進口C 56.5cP、國產D 52.0 cP，吸收情況D組最好，其次是C、A，B組最差。免疫持續期對比結果B組抗體最好，免疫后28 d抗體最高，ND抗體滴度為9.83log2，H9抗體滴度為11.33log2，直到免疫后154 d，ND抗體滴度為5.1log2，H9抗體滴度為8.6log2，仍可以達到保護效果；其次是D組，ND部分免疫后21 d抗體滴度最高為8.17log2，H9免疫后42 d抗體滴度最高為9.58log2，ND免疫后154 d抗體滴度為4.2log2，H9抗體滴度為7.8log2；最后為C、A兩組。綜合評定B組抗體滴度最高但吸收度最差，蛋雞免疫時可以考慮使用；D組抗體和吸收整體比較好，結合性價比確定為最佳白油佐劑。

關鍵詞：白油佐劑；抗體；吸收；免疫持續期；對比

中圖分類號：S852.5 文獻標識碼：B 文章編號：1673-1085（2024）08-0013-07

接種疫苗是養殖過程中常使用的疾病預防方式，根據疾病流行特點，對不同日齡的雞群進行不同種類疫苗的免疫，包括活疫苗、滅活疫苗、類毒素、亞單位疫苗、多肽疫苗、基因工程疫苗等。目前常用的疫苗主要為活疫苗和滅活疫苗。滅活疫苗主要是選用免疫原性好的細菌、病毒等人工培養后，用物理或化學的方法將其殺死（滅活），使其失去活性，喪失傳染性，但保留免疫原性，具有安全、不散毒、便于貯存和運輸、受母源抗體影響小、產生抗體水平高等優點。實際生產中，滅活疫苗與活疫苗相結合使用往往可以達到理想效果，一般采用活疫苗作基礎免疫，滅活疫苗作加強免疫。

滅活疫苗是由油相和水相（抗原）組成，油相的主要成分是白油，占70%左右，但市場上的白油品質參差不齊，制備出的疫苗穩定性不同，免疫效果也不同，影響雞群的生長性能[1]及抗體水平。本文采用3個國外進口、1個國產白油佐劑分別制備4個雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗樣品[2]，按照現行質量標準[3]進行各項檢驗，對比各項指標，并在此基礎上篩選樣品進行免疫持續期試驗，尋找一種成本低、質量高的白油佐劑。

1" 材料

1.1" 白油

A、B、C組分別為進口白油佐劑；D組為新型國產白油佐劑[4]。

1.2" 滅活疫苗及對照樣品

分別采用不同白油佐劑制備雞新-流二聯滅活疫苗4個樣品，標記為A、B、C、D；對照樣品為生理鹽水，標記E；以上樣品均由豪威生物科技有限公司提供。

1.3" 試驗動物及飼料

SPF雞購于北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司；滅菌飼料購自北京科奧協力飼料有限公司。

1.4" 檢驗用試劑

新城疫抗原和陽性血清購自中國獸醫藥品監察所；陰性血清由豪威生物科技有限公司提供；禽流感病毒（AIV）H9亞型抗原購自哈爾濱維科生物技術開發公司；禽流感病毒（AIV）H9亞型陽性血清購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.5" 主要儀器

正負壓禽用隔離器（型號CC-J-H-I型），天津市津航凈化空調工程公司；移液器，Sartorius、eppendorf。

2 方法

2.1" 疫苗配制

油相（佐劑）與水相（抗原）按一定比例進行配制。

2.2" 乳化

三種佐劑（油相）分別加入乳化桶中，開啟攪拌至2 500 r/min時，緩慢加入水相。攪拌速度調到3 000～3 500 r/min，乳化8 min。

2.3" 物理性狀檢驗

按現行《中國獸藥典》附錄進行測定[2] 。

2.4" 安全檢驗

按現行《中國獸藥典》附錄進行測定。

2.5" 吸收試驗

篩選5日齡SPF雞110只，免疫組隨機分為4組，每組25只，分別頸部皮下注射A、B、C、D" 4組滅活疫苗樣品，0.3 mL/只，標記好注射部位；同時設空白對照組10只，按同樣方法、劑量免疫生理鹽水，每天觀察注射部位的吸收情況。于免疫后14、21、28、35、42 d，每組各剖檢5只，對照組每次剖檢2只，觀察注射部位的吸收情況。

2.6" 免疫持續期試驗

篩選21日齡SPF雞50只，試驗組40只，隨機分為4組，每組10只，分別頸部皮下注射A、B、C、D" 4組滅活疫苗，0.3 mL/只；另設10只未免疫雞作為對照。免疫前采血、免疫后每周采血，按現行《中國獸藥典》附錄HI方法測抗體，至任何一種抗體幾何平均值下降到質量標準，即ND的抗體效價為1：16（4 log2）、AI（H9）為1：64（6 log2）時，停止試驗。

3 結果與分析

3.1" 物理性狀檢測結果

檢測結果顯示，4種白油佐劑配制的疫苗，外觀、劑型、穩定性、黏度均符合獸用生物制品疫苗成品檢驗標準，其中外觀、劑型、穩定性、物理性狀無明顯差異；在疫苗黏度方面，B組疫苗黏度更低、流動性更好，結果見表1。

3.2" 安全檢驗

將4種白油佐劑制備的雞新-流二聯滅活疫苗大劑量免疫接種SPF雞，結果均顯示安全、 無不良反應，結果見表2。

3.3 吸收情況

吸收情況見表3。由表3可知，免疫14、21 d后4種白油的吸收均不完全，免疫28 d后仍有部分未吸收，結果對比為樣品D最好，其次是樣品C、樣品A、樣品B。疫苗未吸收與完全吸收的對照剖檢情況，見圖1。

3.4 免疫持續期抗體水平

由表4、圖2可知，ND抗體平均值水平A、B、C、D" 4組疫苗在免疫7 d內抗體上升不明顯，免疫后7～14 d內迅速上升且在免疫后28 d均達到最高值，之后抗體水平緩慢下降，且在免疫后140 d時A、C兩組下降到質量標準以下，B組抗體水平一直高于其他3組，D組抗體水平下降趨勢平穩。

由表5、圖3可知，H9抗體平均值水平A、B、C、D" 4組疫苗在免疫7 d內抗體上升不明顯，免疫后7～14 d內迅速上升且在免疫后28～42 d分別達到最高值，之后抗體水平緩慢下降，至免疫154 d后4組H9抗體水平均滿足質量標準，B組抗體水平最高，D組抗體水平下降趨勢平穩。

由圖4可知，所有免疫組與空白對照組ND抗體結果差異顯著（Plt;0.05），對照組抗體為陰性，試驗成立。A組與B組差異顯著（Plt;0.05），B組抗體水平遠高于A組，其他組之間相比差異均不顯著（Pgt;0.05）；4組疫苗在免疫后126 d抗體仍保持在4log2以上，ND抗體整體評價順序為Bgt;Dgt;Cgt;A。

由圖5可知，所有免疫組與空白對照組H9抗體結果差異顯著（Plt;0.05），對照組抗體為陰性，試驗成立。所有免疫組之間相比差異均不顯著（Pgt;0.05），4組疫苗在免疫后154 d抗體仍保持在7log2以上，H9抗體整體評價順序為Bgt;Dgt;C=A。

4" 討論與結論

免疫佐劑是指與抗原同時或先于抗原使用，能增強機體對抗原免疫應答能力或改變免疫反應類型的物質[5-6]。注射用白油作為一種重要佐劑，關系到疫苗成品的質量。各疫苗生產廠家均將注射用白油作為一種關鍵原材料。進口白油佐劑是目前公認的質量較好的白油佐劑，但因價格較高，近年來很多疫苗企業正嘗試選擇質優價廉的國產白油佐劑。白油質量對于疫苗安全性及其免疫效力有著重大影響。黏度高低是評價疫苗優劣的一個主要指標，黏度低，更易于注射、臨床使用方便。此外，免疫后的副反應，也就是用戶普遍反應的應激問題，其本質與礦物白油佐劑的內在質量相關[7]。

本試驗采用SPF雞免疫評價方法，可排除雞體自身各種因素的影響，便于疫苗生產企業客觀地評價白油質量，4批樣品析出量均小于0.1 mL，穩定性合格，進口白油B最低黏度27.6cP，與其他組無明顯差異。吸收情況對比：D組最好，其次是C、A、B。免疫持續期對比：B組最好，在免疫后28 d抗體滴度最高，ND抗體滴度為9.83log2，H9抗體滴度為11.33log2；到免疫后154 d，ND抗體滴度為5.1log2，H9抗體滴度為8.6log2，仍達到保護效果；其次是D組，ND部分在免疫后21 d抗體滴度最高為8.17log2，H9在免疫后42 d抗體滴度最高為9.58log2；到免疫后154 d，ND抗體滴度為4.2log2，H9抗體滴度為7.8log2；最后為C、A兩組。綜合評定，B組抗體滴度水平最高，但吸收度較差，蛋雞免疫時可以考慮使用；D組抗體滴度水平和吸收整體比較優秀，確定為最佳白油佐劑。

參考文獻：

[1]" 白軍，劉淑紅. H9 亞型禽流感疫苗研究進展[J].畜牧與飼料科學，2016（11）：102-103.

[2]" 中國獸藥典委員會.獸藥質量標準（生物制品卷）[M].北京：中國農業出版社，2017.

[3]" 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（三部）[M].北京：中國農業出版社，2020.

[4]" 尹秀鳳，丁美娟，黃顯明，等.新型國產白油佐劑與進口 Marcol-52白油佐劑配制疫苗的比較試驗[J].中國畜牧獸醫，2014，41（S3）：245-247.

[5]" 趙坤坤，徐冰冰，賈威陣，等.三種白油用于油乳劑滅活疫苗的安全性和有效性研究[J].黑龍江畜牧獸醫，2020（14） ：121+124+155-156.

[6]" 沈克飛，曹蘭，尹繼剛，等.免疫佐劑研究進展[J].動物醫學進展，2007，28（s1）：34-36.

[7]" 秦玉明，趙耘，李宇，等.國外疫苗佐劑的評價[J].中國獸藥雜志，2005，39（6）： 34-37.

Comparative Test of Newcastle Disease and Avian Influenza

（ H9 subtype ） Inactivated Vaccine Prepared with Different

Ehite Oil Adjuvants

ZHANG Na， SHI Yanfeng， JIANG Dong" "， WANG Yanan， HUANG Liying， MA Tongtong， SU Hui

（ HAOVAC Biotechnology Co.， Ltd.， Wuqing" 301700，China ）

Abstract： In order to study the immune effect of inactivated vaccines prepared with different white oil adjuvants， three foreign white oil samples and one domestic white oil sample from two manufacturers were used to prepare four batches of chicken Newcastle disease and avian influenza （ H9 subtype ） （ La Sota + WD ） bivalent inactivated vaccine （ hereinafter referred to as ：" Newcastle disease and avian influenza bivalent inactivated vaccine ） [ 1 ]， Marks A， B， C， D， respectively according to the current edition of the 'Veterinary Pharmacopoeia of the People 's Republic of China 'method [ 2 ]， the characteristics， safety test， antibody detection and absorption comparison were carried out. The antibody was detected by subcutaneous injection of 0.3 ml in the neck. The results showed that the precipitation amount of 4 batches of samples was less than 0.1ml， and the stability was qualified. The lowest viscosity of imported white oil B was 27.6cP， imported A ： 48.2cP， imported C ： 56.5cP， domestic D ： 52.0cP， and the absorption of group D was the best， followed by group C， A and B， and group B was the worst.Compared with the duration of immunization， the antibody in group B was the best. The highest ND antibody was 9.83 log2 and H9 was 11.33 log2 on the 28 th day after immunization. Until 154 days after immunization， the ND antibody was 5.1 log2 and H9 was 8.6 log2， which could still achieve the protective effect. The second was group D. The highest ND antibody was 8.17 log2 on the 21 st day after immunization， and the highest H9 antibody was 9.58 log2 on the 42 nd day after immunization. Until 154 days after immunization， ND antibody was 4.2 log2， H9 was 7.8 log2， and finally C and A groups. Comprehensive evaluation Although the antibody of group B was the highest but the absorption was the worst， the immune use of laying hens can be considered. The antibody and absorption of group D were better as a whole， and then combined with the cost performance， it was determined as the best white oil adjuvant.

Keywords：" White oil adjuvant; Antibody; absorption; Immune duration; Contrast