水稻秸稈降解菌系的篩選及其菌群組成分析

張蘊琦+徐鳳花++張書敏++吳優++張晴

摘要：將崩解濾紙能力強的菌系1在30 ℃條件下以水稻秸稈為唯一碳源連續馴化41代，25代后羧甲基纖維素鈉（CMC）酶活力、濾紙酶活力和秸稈失重率基本穩定，較第1代提高了59.7%、61.0%和62.4%。利用PCR-DGGE對馴化進程中菌系1細菌組成多樣性及優勢菌群的變化動態進行分析，原始樣品共檢測到13個主要條帶，優勢菌群由Solitalea sp.、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）和一些不可培養微生物組成。經濾紙及水稻秸稈馴化，部分細菌被淘汰，微生物多樣性減少，濾紙和水稻秸稈馴化穩定期優勢菌群均包括多形擬桿菌屬（Bacteroides sp.）、梭菌屬（Clostridium sp.）和假單胞菌屬，表明這些優勢菌群對濾紙纖維素和水稻秸稈纖維素均有較強的降解能力，此外，條帶10（Uncultured Clostridium sp. Clone 3-2）在水稻秸稈馴化33代顏色變深成為優勢菌，推測在水稻秸稈降解過程中具有一定的作用。

關鍵詞：菌系1；馴化；水稻秸稈；變性梯度凝膠電泳；多樣性；優勢菌群

中圖分類號： X172文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0257-04

2013年黑龍江省水稻秸稈量為2 400萬t，約占秸稈總量的39.3%[1]。由于水稻秸稈木質素縮聚單元比例較高，與纖維素和半纖維素結合較緊密，硅質化程度高[2]，同時黑龍江年均氣溫較低，因此其自然降解速度緩慢，資源化利用率低，大量焚燒嚴重污染環境。

近年來國內外學者選育出一些能夠降解水稻秸稈的菌株，主要包括木霉菌、青霉菌和一些細菌，但是，研究發現單菌株產酶能力有限[3]，且水稻秸稈結構復雜，很難被高效降解，而菌系通過多種微生物協同作用對水稻秸稈降解效果更好，然而，目前對菌系的研究較少。本試驗在30 ℃下以6種不同來源的樣品為菌源，采用限制性篩選的方法，利用水稻秸稈定向馴化培養，獲得能夠高效穩定降解水稻秸稈的菌系，并通過分子生物學技術揭示該菌系細菌組成多樣性及優勢菌群的變化動態。

1材料與方法

1.1樣品來源（表1）

1.2培養基

富集培養液[4]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，微量元素液0.5 mL，土壤浸汁100 mL，蒸餾水900 mL，121 ℃滅菌30 min。

微量元素溶液成分：ZnSO4 0.29 g，CaCl2 0.24 g，CuSO4 025 g，MgSO4 0.17 g。

土壤浸汁：土壤與去離子水以質量比1 ∶1，攪拌混合，過濾，滅菌后備用。

蛋白胨纖維素培養液（PCS）[5]：蛋白胨5.0 g，纖維素（新華濾紙/水稻秸稈）5.0 g，NaCl 5.0 g，CaCO3 2.0 g，酵母粉 1.0 g，蒸餾水1.0 L，121 ℃滅菌30 min。1.3試劑

EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸鈉）、CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、磷酸二氫鈉、異丙醇、蛋白酶K、磷酸氫二鈉、異戊醇、溶菌酶、Tris-飽和酚、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、尿素、冰乙酸、過硫酸銨、DNA膠回收試劑盒，試劑均為分析純。

DNA提取液的配制[6]：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.1 mol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB，pH值為8.0。

1.4試驗方法

1.4.1樣品富集稱取1～6號樣品各10 g，分別加入 150 mL 富集培養液中，30 ℃恒溫振蕩培養，富集3代，10 d/代，傳代接種量為15%。

1.4.2菌系初篩采用濾紙條崩解法，向150 mL蛋白胨纖維素培養基（濾紙）中接入20 mL富集培養液，30 ℃靜置培養，馴化5代，10 d/代，選擇濾紙崩解的樣品，繼續多代馴化。

1.4.3菌系復篩待菌系降解濾紙能力穩定后，采用蛋白胨纖維素培養基（水稻秸稈）繼續定向馴化培養，第4天測定CMC酶活及濾紙酶活，第7天測定樣品中秸稈失重率。

1.4.4纖維素酶活性測定采用DNS法[7]測定CMC酶活性和濾紙酶活性。

1.4.5秸稈失重率測定將水稻秸稈發酵液離心，棄上清，加入鹽酸和硝酸混合液，過濾，再用蒸餾水反復沖洗，將剩余物轉入培養皿，于105 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干至恒質量，稱質量。按照公式計算失重率[8]。

失重率ω=[（m1-m2）/m0]×100%。

其中，m0為水稻秸稈初始質量（g），m1為培養皿與樣品烘干恒質量（g），m2為培養皿質量（g）

1.4.6菌系DNA提取及PCR-DGGE分析

1.4.6.1菌系總DNA提取及純化取原始樣品以及濾紙和水稻秸稈馴化中期、穩定期的發酵液為樣品，置于離心管（樣液為10 mL），-20 ℃凍存。按照呂新等報道的高鹽法[6]提取DNA，得DNA粗提液，取5 μL作瓊脂糖凝膠電泳檢測，并選用OMEGA生物技術公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行膠回收，純化DNA。

1.4.6.2菌系16S rDNA V3可變區PCR擴增用于DGGE電泳的 PCR 擴增產物引物序列為[9]338F （5′-CGCCCGCCG

CGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGG

GAGGCAG-3′）和518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）；反應體系[10]：模板DNA 1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，正反引物各0.5 μL，5 U/μL Taq聚合酶 0.25 μL，加雙蒸水至25 μL；PCR反應條件[11]：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性1 min，65 ℃復性8 min，72 ℃延伸2 min，共40次循環；72 ℃延伸10 min，PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.4.6.3變性梯度凝膠電泳采用Bio-Rad變性梯度凝膠電泳對PCR產物進行分離，丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性劑梯度為35%～65%，電泳緩沖液為1×TAE，上樣量為30 μL PCR產物和10 μL 6×溴酚藍二甲苯氰溶液，在60 ℃、60 V條件下電泳14 h。紫外凝膠成像系統分析結果，并對DGGE圖譜上的優勢條帶和差異條帶進行割膠回收，將其放入滅菌的200 μL離心管中，加入20 μL滅菌的去離子水中，4 ℃放置過夜。取2 μL DNA浸出液為模板進行PCR擴增，并再次進行變性梯度凝膠電泳，對單一條帶進行切膠回收及PCR擴增，擴增產物送交華大基因公司測序。

2結果與分析

2.1菌系馴化

將不同來源的6個樣品在PCS培養基（濾紙）中馴化至第5代，僅1號和3號樣品濾紙條部分崩解，其他樣品濾紙無明顯崩解現象。對1號和3號樣品馴化至23代，第7天1號樣品濾紙均崩解為片狀，3號中濾紙斷裂；第10天1號濾紙完全降解，菌液呈淡黃色，3號濾紙崩解為片狀，表明隨著馴化代數的增加，樣品中菌系對濾紙崩解能力逐漸增強。

2.2菌系復篩

為得到能夠快速穩定降解水稻秸稈的菌系，將菌系1和菌系3在以水稻秸稈為唯一碳源的PCS培養基中定向馴化培養，不同馴化代次CMC酶活性與濾紙酶活性如圖1所示。1～25代酶活性均逐漸提高，第25代菌系1 CMC酶活性與濾紙酶活性分別為59.4、29.3 U/mL，較第1代提高了59.7%、61.0%，菌系3為50.2、25.6 U/mL，較第1代提高了49.9%、56.1%，菌系1較菌系3高18.3%、14.5%，表明馴化培養對提高菌系1酶活性效果明顯，且菌系1酶活性強于菌系3。楊冰從長期耕種的水稻田中篩選出水稻秸稈降解復合菌系 I-D，37℃條件下培養2 d，CMC酶活最高為 24.2 U/mL[12]。

由圖2可見，在各代次馴化培養第7天時，1～25代水稻秸稈失重率逐漸增加，第25代菌系1和菌系3秸稈失重率為39.3%、31.0%，較第1代提高62.4%、62.3%，菌系1較菌系3高26.8%，表明菌系1對水稻秸稈降解能力強于菌系3。劉甲峰等從免耕多年還田的土壤中馴化獲得1組纖維素降解菌系，第7天稻秸失重率為30.0%[13]。朱虹等從稻草堆底土壤篩選的纖維素降解菌系第7天稻秸失重率為39.6%[14]。

2.3DGGE監測菌系1群落結構

2.3.1菌系1總DNA提取由于菌系1降解能力強于菌系3，因此采用PCR-DGGE技術對菌系1優勢菌群變化動態進行分析。總DNA電泳結果見圖3，各樣品基因片段大小均約為23 kb，5條主帶清晰較亮，表明DNA完整性較好，但各條帶存在拖尾現象，且點樣孔處均不同程度地發亮，說明樣品中含有未除去的蛋白質等雜質。以純化后的總DNA為模板進行PCR擴增，擴增產物大小為200 bp左右，條帶清晰單一（圖4），可用于DGGE分析。

2.3.2菌系1菌群組成變化動態DGGE圖譜中1個條帶可能代表1種微生物，同時顏色相對較深的條帶是優勢菌，菌系1不同時期條帶的數目及顏色深淺存在差異，如圖5所示，在馴化過程中，微生物組成發生變化。原始樣品共檢測出13個主要條帶，說明微生物多樣性較豐富，條帶2、4、5、6、7、11、12、13顏色較深，代表菌系的優勢細菌。濾紙馴化過程中，條帶2、4、5、11、12、13顏色持續變淺，對濾紙降解能力較弱，馴化9代，與原始樣品相比，條帶1、8、9顏色變深，條帶3、10、11顏色深淺沒有明顯變化，第23代條帶3、6、7變深，條帶1、3、6、7、8、9代表的細菌成為優勢菌，表明這些細菌逐漸適應濾紙培養環境并趨于穩定，對濾紙降解能力較強。

水稻秸稈馴化培養13代的樣品檢測出9個主要條帶，菌系微生物多樣性減少。與濾紙馴化23代相比，條帶2、4、5代表的細菌被淘汰，條帶1、10、11、12、13深淺無明顯變化，條帶3、6、7、8、9變淺，表明水稻秸稈馴化初期，菌系中微生物由于未能適應碳源的變化，活性降低，當培養33代時，條帶11消失，條帶1、3、6、7、8、9、10較深，代表的細菌為優勢細菌，說明這些條帶代表的細菌對水稻秸稈降解能力較強，共同組成一個能穩定降解水稻秸稈的菌系。

DGGE圖譜條帶測序后與GenBank數據庫同源性比對結果見表2，除條帶4、5、10、11、12、13與某些不可培養微生物相似外，其他各主要條帶的近緣菌分別歸屬于多形擬桿菌屬（Bacteroides sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、梭菌屬（Clostridium sp.）和Solitalea sp.。原始樣品優勢菌群為Solitalea sp.、Pseudomonas sp.和一些不可培養微生物，經濾紙馴化優勢菌群變化較大，演替為Bacteroides sp.、Clostridium sp. 和Pseudomonas sp.，水稻秸稈馴化穩定期優勢菌群包括Bacteroides sp.、Clostridium sp.、Pseudomonas sp.和Uncultured Clostridium sp. Clone 3-2。

3討論

菌系1 DGGE圖譜中條帶1與多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482）同源率為97%，馴化各時期均為優勢菌，多形擬桿菌是一種碳水化合物降解細菌，Kim等研究發現Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482含有1個編碼糖苷轉移酶的基因，能夠降解纖維素等多糖物質[15]。條帶3、6序列與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens Pf0-1）相似性達到99%，條帶7與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa PAO1）相似性為100%，在不同時期樣品中均存在。目前已有研究顯示，熒光假單胞菌和銅綠假單胞菌均具有纖維素降解能力，尹礎等分離出1株產酶能力較強的纖維素降解菌，其與熒光假單胞菌16S rDNA核苷酸同源率達到99%以上[16]。李平等將篩選的5株細菌構建1組高效纖維素降解菌系，經