高效溶磷菌的篩選、鑒定及其溶磷特性

邵鍇++邱業先++徐婧

摘要：為了從根際土壤中篩選出具有較高溶磷能力的菌株及優化溶磷條件，通過種子萌發初步研究溶磷促生效應。通過稀釋涂布法分離、篩選菌株，并進行ATB細菌鑒定儀及16S rDNA測序鑒定；采用單因子試驗及正交試驗優化菌株溶磷發酵條件，利用種子發芽指標測定菌株的促生能力。結果顯示，篩選出菌株BD-1的溶磷能力最強，經ATB細菌鑒定儀及16S rDNA測序，該菌株被鑒定為路德維希腸桿菌。正交試驗結果表明，在溫度為30 ℃、搖床轉速為180 r/min、接種量為2 mL、初始pH值為7.0的條件下培養7 d的溶磷效果最好，其溶磷量為181.73 g/L。種子萌發試驗結果表明，該溶磷菌對作物種子萌發具有一定的促進作用。

關鍵詞：溶磷菌；微生物肥料；條件優化；解磷能力；種子萌發；鑒定；篩選；溶磷特性

中圖分類號： S154.38+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0253-04

磷是植物生長必需的營養元素之一，植物的光合作用和體內的生化過程都必需有磷參與[1-2]，但其在土壤中主要以難溶性礦物態存在[3]，難溶性礦物態磷無法被作物直接吸收利用。為提高作物產量，超過90 kg/hm2磷肥被施用于土壤中[4]，部分磷肥被作物吸收利用，大部分被轉化成難溶性磷返施于土壤。大量化學磷肥的施用，伴隨土壤板結、土壤酸化、土壤貧瘠化日益嚴重。因此，提高土壤中磷的利用效率對降低化學磷肥的施用量具有十分重要的意義。土壤中存在大量的微生物，能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用形態，具有這種能力的微生物稱為解磷菌或溶磷菌[5]。溶磷微生物作為微生物肥料的開發和利用已經成為人們關注的焦點。土壤中存在的溶磷微生物能夠通過自身生長代謝，轉化難溶性磷為可溶性磷，促使作物吸收利用。但是，微生物僅能夠溶解難溶性磷，還不能被認為就是溶磷菌，溶磷菌還須考慮作物促生效應[6]。目前，有關農作物溶磷微生物的分離和應用也有一定的研究。李倩利用蒙金娜無機溶磷培養基從桂花樹根際黏附土壤中分離篩選出1株高效溶磷菌株，為洋蔥伯克霍爾德氏菌，并測得其溶磷量為 503.53 μg/mL[7]。劉文干等從花生根際土壤樣品中篩選到1株溶磷能力強的菌株黑曲霉，溶磷量達到177.4 mg/L[8]。因此，合理利用溶磷微生物與開發微生物肥料對提高作物產量、減少化學肥料使用、降低環境土壤污染具有巨大前景[9-10]。大多數學者從單一磷源中篩選溶磷菌，而進行多種磷源篩選溶磷菌、提高溶磷菌的質量與特性就尤為重要。本研究以采自作物的根際土壤為研究對象，分離、篩選出溶磷細菌，通過ATB細菌鑒定儀及16S rDNA測序鑒定出溶磷細菌，研究高效溶磷菌的溶磷效果，運用單因素試驗和正交試驗[11-12]對溶磷菌的溶磷效果進行優化，并通過種子萌發進行溶磷促生初步效果驗證，為溶磷菌菌劑開發微生物肥料打下基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤來源于2015年4月15日采集江蘇省揚州市江都區雙溝陳甸果園里長勢良好的扁豆、韭菜、紅薯、毛豆等作物的根際土壤。土樣采集后放置于無菌袋中，于實驗室 4 ℃ 冰箱內保存。

1.1.2培養基有機磷篩選培養基：葡萄糖10 g、CaCO3 5 g、（NH4）2SO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g、FeSO4 0.3 g、KCl 0.3 g、NaCl 0.3 g、卵磷脂0.2 g、MnSO4 0.03 g，無菌水1 000 mL，pH值 7.0～7.2；LB培養基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g，無菌水1 000 mL。

1.2方法

1.2.1溶磷細菌的篩選

1.2.1.1溶磷細菌的分離稱取5 g土樣加入45 mL無菌水，于28 ℃、180 r/min下振蕩0.5 h，充分混勻，制成10-1濃度梯度，按10倍稀釋法制備成10-3、10-4、10-5、10-6 各梯度土樣懸液，各梯度吸取100 μL土樣懸液均勻涂布在有機磷培養基上，每個梯度設3組重復。倒置平板于28 ℃恒溫培養箱中培養4 d，用無菌的牙簽挑取菌落，并通過劃線分離純化得到單菌落，保存于LB斜面培養基中，4 ℃冰箱保存。

1.2.1.2溶磷細菌的篩選（1）將斜面保存的菌種用無菌牙簽挑取出來轉接于固體培養基上，倒置平板于28 ℃恒溫培養箱中培養4 d，用游標卡尺測量菌落的直徑（d）和透明圈的直徑（D），用D/d表征溶磷菌的溶磷能力以作為初篩。（2）將初篩得到的菌種用無菌生理鹽水制備成相應濃度菌懸液，于150 r/min、28 ℃下培養5 d，以接無菌水的搖瓶作對照。培養物轉移至無菌的50 mL離心管中，采用超聲波破碎，處理時間為20 min，使之釋放出細胞內的有效磷。以4 000 r/min的轉速進行離心20 min，留上清液待測，參考張祥勝的鉬銻抗比色法測上清中有效磷含量[13]。

1.2.1.3溶磷細菌對不同磷源的溶磷效果將有機磷的磷源依次替換成等量的磷酸三鈣、磷酸鐵、磷酸鋁，通過上述鉬銻抗比色法測量溶磷細菌對不同磷源的溶磷效果。

1.2.2溶磷細菌的鑒定

1.2.2.1ATB細菌的鑒定參照ATB細菌鑒定手冊對溶磷細菌進行鑒定。

1.2.2.216S rDNA測序分離得到的溶磷細菌BD-1用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA并進行PCR擴增。PCR所用引物為：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系：Taq PCR Master Mix 25 μL、DNA template 1 μL、Primer F 2 μL、Primer R 2 μL、Nuclease-free ddH2O 20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1.5 min，循環 30次；72 ℃ 5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后用試劑盒純化，由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結果輸入到NCBI數據庫中進行BLAST比對，通過CLUSTAL X進行多重序列比對，將比對結果轉換為MEGA格式，輸入到MEGA 5構建系統發育樹探討目的菌株的親緣性。

1.2.3溶磷菌溶磷條件優化采用正交設計對溶磷效果進行優化，根據溶磷細菌溶磷效果響應時間變化，主要考慮溫度、轉速、接種量、初始pH值對溶磷效果的影響，采用4因素3水平進行L9（34）正交試驗，3組重復，正交試驗設計見表1。

1.2.4種子發芽指標的測定根據優化結果培養溶磷菌制備菌懸液，挑選顆粒飽滿的白菜蘇州青種子，先用70%乙醇消毒，再用0.1% HgCl2浸泡1 min，無菌水清洗3次，放入預先滅菌好的培養皿中，每皿50粒，無菌注入稀釋10倍的上述菌懸液10 mL，無菌水處理為對照（CK），于25 ℃恒溫培養 7 d。根據發芽試驗期間的記錄，計算各項發芽指標：發芽勢（GE）=前3 d發芽種子數/種子總數×100%；發芽率（GP）=7 d發芽種子數/種子總數×100%；發芽指數（GI）=Gt/Dt（Gt指在t d內的發芽數，Dt為相應的發芽時間）；活力指數（VI）=Gt/Dt×幼苗生長勢；幼苗生長勢=預選時間內供試種子平均芽長+平均根長（芽長為發芽7 d量取的幼苗芽長；根長為發芽7 d量取的幼苗根長）。

2結果與分析

2.1溶磷細菌的篩選

本研究篩選到有透明圈的菌株為43株，發現透明圈D/d的值與搖瓶復篩并不成線性比列，與許多學者研究結果一樣，所以以搖瓶復篩選取10株D值較大菌株結合不同磷源的液體搖瓶復篩，結果見表2，其中MD-8在初始卵磷脂搖瓶篩選中溶磷量最大，對其他3種磷源溶解效果不是很明顯，而BD-1在不同磷源下的水溶性磷都比較大，所以BD-1被選作進一步研究的菌株。

2.2溶磷細菌的鑒定

2.2.1ATB細菌鑒定結果ATB細菌鑒定儀測定的生化反應譜如表3所示，鑒定結果為腸桿菌屬菌株。

2.2.216S rDNA測序結果根據16S rDNA測序與NCBI數據庫BLAST比對的結果，對溶磷菌BD-1與參比菌株構建系統發育樹。從圖1可看出，BD-1與菌株路德維希腸桿菌（Enterobacter ludwigii）處于同一分支，親緣關系較近，且同源性高達99%，NCBI數據庫登錄號為NR 042349.1，所以菌株

暫鑒定為路德維希腸桿菌。

2.3培養條件的單因素試驗結果

從圖2可以看出，培養基初始pH值對培養基中水溶性磷影響較大，在pH值為7～8的條件下溶磷效果較好；在搖床轉速120～160 r/min下，培養基中溶磷量較高，并在 150 r/min 下達到最佳溶磷效果；隨著溫度升高，培養基中溶磷量先增后減，在30 ℃下溶磷效果最好，所以確定最佳溫度為30 ℃；隨著接種量的增加，培養基中溶磷量也是先增后減，在2.0～2.5 mL下達到穩定。

由圖3 可以看出，溶磷菌隨著培養時間的延長，培養基中溶磷量先緩慢增加，在培養后7 d達到最大值，隨后出現下降趨勢，這主要是因為隨著培養時間的延長，培養基中的營養物質逐步減少，同時微生物代謝副產物出現累積，導致微生物活性下降，從而使培養基中溶磷量下降。因此，最佳發酵時間為7 d。

2.4正交試驗結果

為了優化溶磷菌的培養條件，根據以上單因素試驗，進行正交試驗，所得結果見表3。綜合正交試驗的k值和極差R大小，影響供試菌BD-1溶磷量的主次順序為A>B>C>D，即溫度>轉速>接種量>初始pH值，且最優水平為A2B3C2D2，即溫度30 ℃、轉速180 r/min、接種量2 mL、初始pH值7.0。針對該條件進行驗證試驗，發酵時間為7 d，溶磷量為 181.73 mg/L。證明通過正交試驗優化，調整后的培養條件有利于供試菌BD-1的溶磷效果。

2.5種子發芽結果

從表4、圖4可以看出，BD-1溶磷菌具有一定的促生效

應。溶磷菌液能分別提高發芽勢、發芽率、發芽指數4百分點、8百分點、5.35，促進種子萌發周期，提高作物種子利用效率，說明溶磷菌液對作物根系有促生作用。

3討論與結論

本試驗從作物根際土壤中成功分離篩選到1株耐受不同

磷源的廣譜性磷細菌，通過ATB細菌鑒定儀及16S rDNA測序初步鑒定為路德維希腸桿菌。路德維希腸桿菌溶磷效果少有報道，龔鳳娟等從杜仲中分離到路德維希腸桿菌，發現它具有1-羧基-1-氨基環丙烷（1-aminocy-clop ropane-1-carboxylate，ACC）脫氨酶活性[14]；王西祥等分離得到的路德維希腸桿菌產吲哚乙酸量達148.80 mg/L[15]；王金昌等成功分離篩選到的路德維希腸桿菌既能解鉀又能解磷，還能促進蕹菜的生長[16]；Shoebitz等從多年生黑麥草根際篩選到路德維希腸桿菌，并從固氮酶活性、溶磷特性、IAA分泌以及相關促生長試驗中證實此菌株具有PGRP特性[17]；Walpola篩選出抗殺菌劑的路德維希腸桿菌，并且具有一定的溶磷效果，為生物接種劑提供理論指導[18]；王舒等分離得到的路德維希腸桿菌在NBRIP液體培養基中培養4 d的有效磷含量達 401.56 mg/L[19]。本研究分離得到的菌株BD-1解磷能力稍弱，但本研究以不同磷源作篩選培養基篩選到的菌株具有溶解多種難溶性磷酸鹽的作用，進而能提高溶磷菌株的溶磷寬度。

有關細菌溶磷條件的優化早有研究，多數從碳源、氮源、pH值、溫度、轉速、接種量、裝液量等方面進行研究[20-21]。本研究通過初始pH值、接種量、溫度、轉速這4個因素進行路德維希腸桿菌BD-1溶磷條件的正交優化，并根據溶磷效果相應時間的變化，證明在溫度30 ℃、轉速180 r/min、接種量 2 mL、初始pH值7.0的條件下發酵7 d時，發酵液中的溶磷量最高，達到181.73 mg/L ，然而這種溶磷優化條件還只是試驗性的，要真正應用到微生物肥料工業化生產中還須要進一步生產工藝研究。

該試驗從種子萌發對溶磷菌促生效應進行初步研究，通過種子萌發試驗證明BD-1溶磷菌在發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數等方面對作物有一定的促生效應，較對照組分別提高5.56%、10.26%、7.54%、13.22%，具有一定的研發價值。

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