5種消毒劑對微生物實驗室環境分離菌的消毒效果驗證及應用

摘要：研究5種消毒劑對微生物實驗室環境分離菌的消殺效果，為微生物實驗室合理有效地使用消毒劑提供依據。采用懸液定量殺菌試驗法，觀察75%乙醇、70%異丙醇、2 g·L?1新潔爾滅、400 mg·L?184消毒液和過氧化氫銀離子消毒劑（4.5%H2O2、80 mg·L?1Ag+）對微生物實驗室環境分離菌的殺滅效果。結果表明：75%乙醇、70%異丙醇、2 g·L?1新潔爾滅和400 mg·L?184消毒液作用2 min ，對細菌繁殖體的殺滅對數值均大于5.00，達到消毒合格的要求。過氧化氫銀離子消毒劑（4.5%H2O2、80 mg·L?1 Ag+）作用60 min ，對真菌的殺滅對數值大于4.00，對巨大芽孢桿菌的殺滅對數值大于5.74，達到消毒合格要求；對枯草芽孢桿菌的殺滅對數值為2.36，未達到消毒合格要求。綜上分析，環境分離菌更能真實地反映實驗室微生物污染情況。實驗室應根據環境監測數據，進行消毒劑效能驗證，依據效能驗證結果，合理地篩選和輪換使用至少2種以上的消毒劑。

關鍵詞：環境分離菌；懸液定量殺菌試驗法；消毒劑；效果

中圖分類號：TQ421文獻標志碼：A文章編號：0253?2301（2024）04?0039?07

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.04.007

Verification and Application of Disinfection Effect of Five Disinfectants on the EnvironmentalIsolated Bacteria from Microbiology Laboratories

LIN Meng-dan，ZHAN Qing，ZHOU A-rong，JIE Xiao-ling，ZHENG Xiao-xian，WANG Hai-long，FANG Dong-sheng *

（Fujian Institute of Microbiology， Fuzhou， Fujian 350000， China）

Abstract： The study the germicidal efficacy of five chemical disinfectants on the environmental isolated bacteria from the microbiology laboratory could provide a basis for the rational and effective use of disinfectants in the microbiology laboratories. The suspension quantitative germicidal test was used to observe the germicidal efficacy of 75% ethanol， 70% isopropanol， 2 g·L?1 benzalkonium bromide， 400 mg·L?184-aerosol and hydrogen peroxide silver ion disinfectant （4.5% H2O2， 80 mg·L?1 Ag+） ontheenvironmentalisolatedbacteriafrommicrobiologylaboratory. Theresults showed that the killing logarithm values of bacterial propagules exposed to 75% ethanol， 70% isopropanol， 2 g·L?1 benzalkonium bromide and 400 mg·L?184-aerosol for 2 min were all greater than 5.00， which met the requirements of qualified disinfection. When the hydrogen peroxide silver ion disinfectant （4.5% H2O2， 80 mg·L?1 Ag+） was used for 60 min， the killing log values of fungi were greater than 4.00， and the killing log values of Bacillus megatherium was greater than 5.74， which met the requirements of qualified disinfection， while the killing log values of Bacillus subtilis was 2.36， which did not meet the requirements of qualified disinfection. In summary， the bacteria isolated from theenvironmentcouldmoretrulyreflectthemicrobialcontaminationinthelaboratory. Itwassuggestedthatthe laboratory should verify the efficacy of disinfectants based on the environmental monitoring data. According to the results of efficacy verification， at least two or more disinfectants should be reasonably screened and used in rotation.

Key words： Environmental isolated bacteria ；Suspension quantitative germicidal test；Disinfectant；Efficiency

微生物實驗室是進行微生物相關科研、教學以及檢驗檢測等的實驗場所。為了減少微生物的污染，獲得準確的試驗結果，同時保護環境及實驗人員的安全，應定期對微生物實驗室進行消毒，使環境維持在可接受的微生物污染風險水平。

目前，市售消毒劑種類繁多，消毒效果存在一定程度的差異，實驗室管理員在選擇和使用消毒劑時，存在一定的盲目性。而且，消毒劑的生產商一般采用標準方法規定的微生物做效力評價測試，這些特定菌株可能與微生物實驗室的環境分離菌有較大差別[1]。王似錦等[2]提出可根據潔凈區環境菌庫中的某些典型微生物作為挑戰菌株，用于消毒劑效果評價。欒玲[3]研究醫院5種常用消毒劑對醫院感染菌的殺滅作用，并根據懸液定量殺菌試驗結果進行消毒現場試驗，結果表明5種消毒劑按照說明書的使用劑量和使用范圍對醫院感染菌進行消毒，能達到很好的消毒效果。劉亞茹等[4]提出多種類多數量的環境菌株更能代表制藥環境真實的微生物污染狀況，并結合潔凈區實際環境監測數據，開展了5種消毒劑的效能驗證，研究發現環境分離菌對不同種類的消毒劑敏感性差別大，企業應合理選擇、定期輪換消毒劑。因此，本試驗依據福建省微生物研究所分析檢測實驗室的環境微生物數據，選用在該環境中長期生存的微生物作為測試菌株，研究幾種常用的消毒劑對環境分離菌的消殺效果，實現對不同類型消毒劑效能的準確評價，為微生物實驗室合理有效地使用消毒劑提供依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株從福建省微生物研究所分析檢測實驗室的環境分離菌[5]中選取出現頻率較高，并且較難消殺的14種菌株作為消毒劑效能驗證的試驗菌株（表1）。綜合考慮微生物種類、消毒劑的殺菌性能和適用范圍，菌株1～9的細菌繁殖體作為75%乙醇、70%異丙醇、2 g·L?1新潔爾滅和400 mg·L?184消毒液的測試對象；菌株10和11的細菌芽胞，以及菌株12～14的真菌孢子作為過氧化氫銀離子消毒液（4.5%H2O2、80 mg·L?1 Ag+）的測試對象。

1.1.2主要儀器HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋（HIRAYAMA）， MIR-154-PC 低溫恒溫培養箱（松下健康醫療器械株式會社），CX 31生物顯微鏡（OLYMPUS）， SW-CJ-1CU 潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），UH5300紫外可見分光光度計[日立科學儀器（北京）有限公司]，MIKRO 220R 高速冷凍離心機（Hettich）等。1.1.3試劑與培養基乙醇（西隴科學股份有限公司），異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司），新潔爾滅（山東利爾康醫療科技股份有限公司），84消毒液（山東利爾康醫療科技股份有限公司），過氧化氫銀離子消毒劑（濟南辰宇環保科技有限公司），吐溫80（阿拉丁），硫代硫酸鈉（西隴科學股份有限公司），卵磷脂（羅恩試劑），過氧化氫酶（北京華邁科生物技術有限公司），消毒劑中和肉湯（青島高科園海博生物技術有限公司），牛血清白蛋白（國藥集團化學試劑有限公司），芽胞染色液（廣東環凱生物科技有限公司），麥芽浸膏營養肉湯（青島高科園海博生物技術有限公司）， TPS（廣東環凱生物科技有限公司）， TSA（廣東環凱生物科技有限公司）， SDA（廣東環凱生物科技有限公司）等。

1.2菌懸液制備

1.2.1細菌繁殖體懸液制備將菌株1～9分別接種于營養瓊脂斜面，置37℃培養18～24h 后，取3～5 mL TPS 加入試管，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，將洗液轉移至另一個試管中，電動混勻器混勻20 s ，初步制成的菌懸液，先用細菌濃度比濁測定法粗測其含菌濃度，然后用 TPS 稀釋至所需濃度。細菌繁殖體應保存在4℃冰箱內備用，當天使用，不得過夜。

細菌濃度比濁測定法：由于細菌懸液的濃度與光密度（OD 值）成正比，因此，可利用紫外可見分光光度計測定一系列已知菌數的菌懸液 OD600 nm 吸光度值，做出光密度與菌數的標準曲線。然后，以樣品液所測的光密度，從標準曲線中查出對應的菌數。

1.2.2細菌芽胞懸液制備將菌株10、11分別接種于10 mL 營養肉湯培養基，置37℃培養18～24 h 后，吸取肉湯培養物5 mL ，接種到裝有營養瓊脂的茄子瓶中，搖勻使菌液布滿培養基表面，將多余的肉湯培養物液體吸出，置37℃培養7～14 d ，取上述培養物進行芽胞染色法鏡檢。當芽胞形成率達90%以上后，進行以下處理：加10 mL 無菌蒸餾水于茄子瓶中，用接種鏟輕輕刮取菌苔。洗凈菌苔，將洗下的菌液移至含玻璃珠的無菌錐形瓶中，振搖5 min 后，放置45℃水浴中24 h 。用2層紗布過濾芽胞懸液，清除瓊脂。將芽胞懸液轉移至無菌離心管，4000 r·min?1離心30 min ，棄去上清液，加蒸餾水吹吸使芽胞重新懸浮，此步驟重復3遍。將洗凈的芽胞懸液放入含玻璃珠的錐形瓶內，60℃水浴30 min ，以殺滅殘余的細菌繁殖體。恢復室溫，進行活菌培養計數并用 TPS 稀釋至試驗所需濃度。芽胞懸液搖勻分裝保存于4℃冰箱內備用，有效期為半年。

1.2.3真菌孢子懸液制備將菌株12～14分別接種于10 mL 麥芽浸膏營養肉湯培養基，置30℃培養42～48h 后，吸取肉湯培養物5 mL ，接種到裝有 SDA 培養基的茄子瓶中，搖勻使菌液布滿培養基表面，將多余的肉湯培養物液體吸出，置30℃培養7～8 d 。用0.05%（體積分數）吐溫80生理鹽水溶液刮洗真菌孢子于溶液中，將孢子懸液用2層紗布過濾，并移至無菌離心管，6000 r·min?1離心20 min ，棄去上清液，用生理鹽水重新懸浮孢子，在顯微鏡下觀察是否仍有菌絲存在，必要時重復上述步驟。活菌計數并稀釋至試驗所需濃度。真菌孢子懸液在4℃保存，有效期為2 d ，使用前，應在顯微鏡下觀察孢子是否出芽，若有則棄之。

1.3中和劑鑒定試驗

中和劑是指一類在微生物殺滅試驗中，用以消除試驗微生物與消毒劑的混懸液中和微生物表面上殘留的消毒劑，使其失去對微生物抑制和殺滅作用的試劑。選擇中和劑的三大原則[6]：（1）快速有效去除殘留的消毒劑；（2）中和劑與中和產物不影響微生物的生長繁殖；（3）中和劑不會破壞培養基的營養成分，也不影響其物理性狀。

消毒劑在對微生物進行殺滅試驗前，所用中和劑應按消毒劑的種類和濃度進行選擇，并針對14株試驗菌株分別進行中和劑鑒定。按照1.2分別制備14株試驗菌株的菌懸液，將菌懸液用等量6 g·L?1的 BSA 稀釋成2.5×103～1.5×104 CFU·mL?1，制成含有機干擾物質的試驗菌懸液。中和劑鑒定試驗參考 GB/T 38502—2020《消毒劑實驗室殺菌效果檢驗方法》[7]的中和劑懸液定量鑒定試驗操作程序，分4組進行：

第1組：中和劑+試驗菌懸液，驗證中和劑是否抑菌。取0.4 mL 標準硬水于試管內，加入4.5 mL 中和劑，混勻，置20℃±1℃水浴中5 min 后，再加入0.1 mL 試驗菌懸液，混勻，作用10 min，分別吸取1.0 mL 接種于兩個平皿中，做活菌培養計數。

第2組：（消毒劑+中和劑）+試驗菌懸液，驗證中和產物或未被完全中和的殘留消毒劑對試驗菌的生長繁殖是否有影響。取0.4 mL 消毒劑于試管內，加入4.5 mL 中和劑混勻，置20℃±1℃水浴中5 min 后，再加入0.1 mL 試驗菌懸液，混勻，作用10 min ，分別吸取1.0 mL 接種于兩個平皿中，做活菌培養計數。

第3組：稀釋液+試驗菌懸液，作為菌數對照。取0.4 mL 標準硬水于試管內，加入4.5 mL 稀釋液（TPS），混勻，置20℃±1℃水浴中5 min 后，再加入0.1mL 試驗菌懸液，混勻，作用10 min，分別吸取1.0 mL 接種于兩個平皿中，做活菌培養計數。

第4組：稀釋液+中和劑+標準硬水+培養基，作為陰性對照。分別吸取稀釋液（TPS）、中和劑與標準硬水各0.5 mL 于無菌平皿內，倒入15～20 mL 培養基，培養觀察。

試驗結果應同時符合以下3個條件，則判定所測的中和劑合格：（1）第1、2和3組有相似量試驗菌生長，平皿生長的菌量在50～300 CFU·mL?1，其組間菌落數誤差率（PZ）不超過15%。（2）第4組無菌生長。若有菌生長，說明試劑受到污染，需更換試劑重新試驗。（3）試驗重復3次，每次試驗均應符合（1）、（2）的要求。

1.4懸液定量殺菌試驗

按照1.2分別制備14株試驗菌株的菌懸液，用 TPS 調整細菌（繁殖體和芽胞）濃度為1.0×108～5.0×108 CFU·mL?1，真菌孢子濃度為1.0×107～5.0×107 CFU·mL?1，按以下分組開展試驗：（1）試驗組：取無菌試管，先加入0.5 mL 試驗菌懸液于試管中，再加入0.5 mL 6 g·L?1的 BSA，混勻，置20℃±1℃水浴5 min 后，加入4.0 mL 消毒液，混勻作用至預定時間。取0.5 mL 試驗菌與消毒劑混合液加入4.5 mL 中和劑中，混勻后水浴10 min ，分別吸取1.0 mL 樣液于兩個平皿中，做活菌培養計數。（2）陽性對照組：用標準硬水替代消毒劑，進行平行試驗。所得結果代表菌液原有濃度，即消毒劑殺滅對數值的初始濃度。計算各組的活菌濃度（CFU·mL?1），并換算成對數值（N），計算殺滅對數值。每次試驗用的中和劑、稀釋液、標準硬水和培養基應進行無菌檢查。每個條件下的試驗重復3次。

消毒合格評價：細菌繁殖體和芽胞殺滅對數值≥5，真菌殺滅對數值≥4。

1.5數據處理

組間菌落數誤差率計算公式為：

組間菌落數誤差率（PZ）=（三組間菌落平三組菌落平均數之和（均數-各組菌落平均數））的絕對值之和根100%

殺滅對數值計算公式為：

殺滅對數值（KL）=陽性對照組平均活菌濃度的對數值（N0）-試驗組活菌濃度對數值（NX）

2結果與分析

2.1中和劑鑒定試驗結果

從表2可知，中和肉湯在中和75%乙醇、70%異丙醇、2 g·L?1新潔爾滅和400 mg·L?184消毒液時，絕大多數菌株的組間菌落數誤差率小于15%，說明中和肉湯作為一種廣譜中和劑能有效中和醇類、含氯消毒劑、季銨鹽類等多種常用的消毒劑；劑，菌、用。用卵磷脂與吐溫-80復配的 TPS 溶液作為中和能有效地中和2 g·L?1新潔爾滅[6]對里拉微球表皮葡萄球菌和頭葡萄球菌的殘留抑殺菌作且上述各組中和劑和中和產物對試驗菌的生長和培養基均無不良影響。

從表3可知，用含1.5 g·L?1卵磷脂、10 g·L?1吐溫?80、2.5 g·L?1硫代硫酸鈉、和5 g·L?1過氧化氫酶的 TPS 溶液作為中和劑，能有效地中和過氧化氫銀離子消毒劑（4.5%H2O2、80 mg·L?1 Ag+）對細菌芽孢和真菌殘留抑殺菌作用，且上述各組中和劑和中和產物對試驗菌的生長和培養基均無不良影響。

2.2懸液定量殺菌試驗結果

從表4可知，75%乙醇和70%異丙醇作用2 min 后對9株細菌繁殖體的平均殺滅對數值均大于5.00，達到消毒合格要求。75%乙醇作用1 min 后對海考克氏菌和頭葡萄球菌的平均殺滅對數值小于5.00，而70%異丙醇作用1 min 和2 min 對9株細菌繁殖體的平均殺滅對數值均大于5.00，說明海考克氏菌和頭葡萄球菌對75%乙醇的敏感性較低。2 g·L?1新潔爾滅作用2 min 和3 min 對9株細菌繁殖體的平均殺滅對數值均大于5.00；作用1 min 時，對海考克氏菌、表皮葡萄球菌和頭葡萄球菌的平均殺滅對數值小于5.00，說明海考克氏菌、表皮葡萄球菌和頭葡萄球菌對2 g·L?1新潔爾滅敏感性低。400 mg·L?184消毒液作用2 min 對9株細菌繁殖體的平均殺滅對數值均大于5.00；作用1 min 時，對海考克氏菌和玫瑰考克氏菌的平均殺滅對數值小于5.00，說明考克氏菌屬對400 mg·L?184消毒液敏感性低。

從表5可知，過氧化氫銀離子消毒劑（4.5% H2O2、80 mg·L?1 Ag+）作用45 min 、60 min ，對巨大芽孢桿菌、青霉菌、枝孢霉菌的平均殺滅對數值均大于5.00；作用60 min 時，對黑曲霉的平均殺滅對數值為4.85；作用60 min 時，對枯草芽孢桿菌的平均殺滅對數值為2.36，未達到消毒合格的要求。

3結論與討論

本研究結果表明，延長作用時間，各種消毒劑對環境分離菌的殺滅效果差別顯著。75%乙醇、70%異丙醇、2 g·L?1新潔爾滅和400 mg·L?184消毒液作用2 min 對9株細菌繁殖體達到消毒合格要求。過氧化氫銀離子消毒劑（4.5% H2O2、80 mg·L?1 Ag+）作用60 min 對巨大芽孢桿菌、青霉菌、枝孢霉菌和黑曲霉達到消毒合格的要求，但對枯草芽孢桿菌未達到消毒合格的要求。因此，實驗室后續可積極研究其他消毒劑對枯草芽孢桿菌的殺滅效果。

醇類消毒劑屬于中效消毒劑，適用于手和普通物體表面消毒。70%異丙醇對本研究所選目標菌的殺滅效果優于75%乙醇，這是因為異丙醇較乙醇多了一個羥基，具有更大的親脂性[8]；新潔爾滅（苯扎溴銨）是實驗室常用的季銨鹽類消毒劑，屬于低效消毒劑，不能殺滅細菌芽孢。此類消毒劑性質穩定，容易儲存，毒性腐蝕性小，刺激性小，可廣泛地用于實驗室的桌面、儀器設備表面、地板、實驗服[9]的消毒；84消毒液是一種以次氯酸鈉為主要成分的高效消毒劑，可用于普通物體表面消毒，但因其易散發刺激性氣味、腐蝕金屬和漂白織物等，不適合于碳鋼和鋁制品設備、皮膚的消毒，使用過程注意個人防護；過氧化氫銀離子消毒劑是過氧化氫和銀離子混合而成的高效消毒滅菌劑，結合了過氧化氫殺菌高效，與銀離子抗菌長效、穩定的優點，銀離子能阻止過氧化氫緩慢分解，提高過氧化氫消毒效果，兩者結合發揮增強殺菌的協同作用[10]。該消毒劑對人體呼吸道黏膜、皮膚刺激小，對物體表面腐蝕小，由于作用完畢后分解成水和氧氣，所以無殘留毒性，對環境友好[11]，可廣泛應用于實驗室的儀器、物體表面、地板、空氣等的消毒和滅菌。

綜上所述，為了降低實驗室微生物污染風險，實驗室應長期進行環境監測。依據環境監測的數據，驗證消毒劑的效力，選擇更適合當前環境的消毒劑，確保消毒劑的使用能達到預期的效果。同時，考慮到長時間使用同一種消毒劑會使微生物產生耐藥性，造成消毒效果下降[12]，實驗室應有計劃地輪換使用至少2種以上的消毒劑，密切關注國內外化學消毒劑技術領域的發展，以便不斷提高實驗室環境微生物污染控制的管理水平。

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（責任編輯：林玲娜）