甜椒幼苗低溫脅迫的生理響應與轉錄組分析

摘要：為了闡明甜椒響應低溫脅迫的分子機制，對低溫脅迫時甜椒幼苗的 MDA 含量、SOD 活性以及光合作用相關參數(shù)進行了測定，并結合轉錄組測序分析。結果表明：低溫脅迫3d 時甜椒 MDA 含量顯著升高，SOD 活性顯著降低，光合相關參數(shù)顯著下降；與低溫處理前相比，轉錄組測序分析結果顯示檢測出差異基因主要涉及酶系統(tǒng)、光合作用、信號傳導以及相關轉錄因子，其中SOD相關基因CaSOD呈示上調表達，光合作用關鍵基因 CaCP4與CaHCR的表達量則顯著下調。研究結果為深入解析甜椒幼苗響應低溫脅迫的分子機制及甜椒抗低溫育種奠定了基礎。

關鍵詞：甜椒；低溫脅迫；轉錄組；差異表達基因

中圖分類號：S641.3文獻標志碼：A文章編號：0253?2301（2024）04?0006?11

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.04.002

Physiological Response and Transcriptome Analysis of Sweet Pepper SeedlingsUnder Low Temperature Stress

MA Xin-yi1 ，LIN Yi-hui1 ，YU Song-jin1 ，NI Hui2 ，LIN Wei3 ，WEI Mi1 ，CHEN Han-xin1*

（1. Zhangzhou Institute of Agricultural Sciences， Zhangzhou， Fujian 363005， China;2. School of Marine Food andBiotechnology， Jimei University， Xiamen， Fujian 361021， China;3. Subtropical Agriculture Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences， Zhangzhou， Fujian 363005， China）

Abstract： In order to clarify the molecular mechanism of sweet pepper in response to low temperature stress， the MDA content， SOD activity of sweet pepper seedlings and the relative parameters of photosynthesis under the low temperature stress were determined， and the transcriptome was sequenced and analyzed. The results showed that the contentofMDAinsweetpepperincreasedsignificantly，theactivityofSODdecreasedsignificantly，andthe photosynthetic relative parameters decreased significantly under the low temperature stress for 3 days. Compared with those before the treatment of low temperature， the transcriptome sequencing analysis showed that the differentially expressedgenesweremainlyinvolvedintheenzymesystem，photosynthesis，signaltransductionandrelated transcription factors. Among them， the expression of SOD-related gene CaSOD was up-regulated， and the expression of photosynthesis key genes CaCP4 and CaHCR was significantly down-regulated. The results laid a foundation for the further analysis of the molecular mechanism of sweet pepper seedlings in response to the low temperature stress and the anti-low temperature breeding of sweet pepper.

Key words： Sweet pepper；Low temperature stress；Transcriptome；Differentially expressed genes

低溫脅迫作為植物常見的非生物脅迫之一，對其生長與發(fā)育有著較為嚴重的影響。植物在遭遇低溫脅迫時，葉片常常表現(xiàn)為皺縮萎蔫、光合效率降低等特征，植株則整體表現(xiàn)出生長受阻與產(chǎn)量下降，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響深遠[1]。相關研究常以超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）等生理生化指標作為植物面對低溫脅迫的應答。低溫下植物活性氧代謝系統(tǒng)受到影響，超氧陰離子自由基（O2?）等活性氧（ROS）含量增加，因此作為活性氧清除劑的 SOD 活性下降[2]。與此同時，植物在逆境脅迫下 MDA 含量會提高[3]。此外，對紫花苜蓿等植物的研究結果表明，低溫可導致1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（RuBPcase）等光合反應的相關酶降解或活性降低，從而影響植物的凈光合速率[1]。但是，有關低溫脅迫對植物生長影響的信號傳導途徑及基因表達調控機制還不明確。

近年來，高通量測序技術逐漸成為研究植物應對低溫脅迫的分子調控機制的普遍技術途徑。相關研究采用組學技術揭示了低溫信號通過植物激素或者 Ca2+及 ROS 等第二信使向下傳遞。ROS 會激活包括 MAPK 級聯(lián)、鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）、鈣調神經(jīng)磷酸酶 B 型蛋白（CBLs）、與 CBL 相互作用的蛋白激酶（CIPK）等蛋白激酶（PKs）以及蛋白磷酸酶（PPs）。隨后，PKs 和 PPs傳遞的信息至下游并引發(fā)一系列包括轉錄因子（TF）在內(nèi)的磷酸化或去磷酸化級聯(lián)，最終完成植物在低溫逆境中信號傳導和與低溫脅迫有關基因的表達調控[4]。

甜椒 Capsicum annuum var.grossumL.又名青椒、菜椒、燈籠椒，屬于茄科 Solanaceae辣椒屬 Capsicum ，富含豐富的維生素 C 、多酚以及β-胡蘿卜素等[5]，是我國常見的設施栽培作物。甜椒屬于冷敏感作物，當溫度低于7℃時，可導致葉表面點蝕、葉片發(fā)黃等生理現(xiàn)象，進而嚴重影響其產(chǎn)量[6]。目前，對于甜椒低溫脅迫的研究多集中在生理生化等方面[7]。近年來已有部分針對甜椒在低溫逆境下轉錄組測序的研究。例如，Li 等[8]利用 RNA 測序技術研究甜椒幼苗在低溫脅迫應答時發(fā)現(xiàn)鈣離子（Ca2+）信號傳導相關基因如 CBL 等下調，多數(shù)轉錄因子如 WRKY 等也下調。而 Shin 等[9]卻發(fā)現(xiàn)甜椒在低溫時次生代謝過程中的一些轉錄因子如 WRKY40、MKK9、MYB77等顯示上調，同時相關低溫脅迫響應基因如 POD 等也顯著上調。Kong 等[10]測序發(fā)現(xiàn)甜椒果實中 AP2、MYB 、bHLH、WRKY 等轉錄因子也參與了低溫反應。然而，甜椒整體響應低溫脅迫機制以及關鍵基因尚不充分。因此，本研究以冷敏感甜椒品種博頓方椒 F1為試驗材料，基于轉錄組測序技術結合生理生化指標對低溫脅迫下的甜椒基因調節(jié)進行深入研究，探究甜椒及其他植物低溫脅迫的分子響應機制。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗甜椒品種博頓方椒 F1為冷敏感品種，購自漳州美利德生物工程有限公司。

1.2試劑與儀器

主要試劑：液氮購于漳州市新興氣體有限公司；植物丙二醛（MDA）測試盒購于南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司

主要儀器：人工氣候箱（RON-500C ，寧波揚輝儀器有限公司）；分光光度計（L5S ，上海儀電分析儀器有限公司）；便攜式光合作用儀（GFS-3000，德國 WALZ）。

1.3試驗方法

低溫脅迫試驗于2023年在漳州市農(nóng)業(yè)科學研究所進行。種子經(jīng)過溫水浸泡催芽后，播種于50孔育苗盤內(nèi)。當幼苗長至6～7片真葉時定植于小方盆中，并放置于人工氣候箱，以溫度28℃/18℃（晝/夜）、光照強度240μmol? m?2?s?1、濕度70%的條件下緩苗3 d 。之后進行低溫處理，光照強度與濕度不變，溫度控制在15℃/5℃（晝/夜），處理7 d 。分別在處理后的0、3、5、7 d 時取功能葉（從上往下數(shù)第3～4葉）測定生理生化指標以及轉錄組測序，每次隨機選取10株取樣，重復3次。所有樣品在采樣后均在液氨中快速冷凍，并于?80℃中保存。

1.3.1生理指標測定使用植物丙二醛（MDA）測試盒和超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒測定甜椒葉片在低溫處理0、3、5、7 d 時 MDA 含量及 SOD 活性，方法按照試劑盒說明書進行測定。每個處理重復3次。

1.3.2葉片光合氣體交換參數(shù)測定利用便攜式光合作用儀 GFS-3000對功能葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、胞間 CO2濃度進行測定。測定時間為08：00～11：30，測定光照度為800μmol·m?2·s?1，流速為500μmol·s?1， CO2濃度為400μmol·mol?1。每個處理重復3次。

1.3.3轉錄組測序委托深圳華大基因科技服務有限公司對0 d（ck）與3 d（cold）低溫處理的甜椒葉片，共6個樣品（各3個重復，分別為 ck1、ck2、 ck3、cold1、cold2、cold3）中總 RNA 進行提取，用 Agilent 2100檢測提取結果，RIN（RNA integ- rity， RIN）≥8，結果 A 類；基于 DNBSEQ 平臺進行轉錄組測序并對原始數(shù)據(jù)去冗余過濾。

1.3.4轉錄組差異表達基因qRT-PCR 驗證為驗證轉錄組測序的準確性，本研究選擇了20個差異表達的低溫相關基因進行熒光定量 PCR 驗證。基于基因組數(shù)據(jù)庫獲得的基因全長信息，使用 primer 5.0設計熒光定量特異引物（表1），內(nèi)參基因為 ACTIN ，qRT-PCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）反應體系包括10μL 2×SYBR GreenPro Tap HS premix ，1μL 上下游引物，1μL 稀釋后的 cDNA 模板（100 ng·μL?1），無菌水補充至20μL，反應步驟：95℃變性30 s， 95℃退火5 s ，60℃延伸20 s ，40個循環(huán)。最后以2?△△CT 計算差異表達基因的相對表達量。

1.4數(shù)據(jù)分析

1.4.1生理及光合參數(shù)數(shù)據(jù)分析使用 R 語言對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，使用 Origin 2021及 GraphPad Prism 10.1.2繪制柱形圖。

1.4.2轉錄組數(shù)據(jù)分析使用過濾軟件 SOAP- nuke 過濾掉低質量、接頭污染以及未知堿基 N 含量大于5%的 reads ，得到 clean reads 。不使用參考基因，使用 Trinity 對 clean reads 進行組裝得到Unigene，用 BUSCO 對組裝的轉錄本進行質量評估。之后對Unigene進行功能注釋、SSR 檢測，之后每個樣品在 All-Unigene的基礎上使用 Bowtie2將 clean reads 比對到基因組序列上，然后使用RSEM 計算各個樣品的基因表達水平計算表達量。使用 DESeq2分析基因差異表達顯著性，并使用 R 軟件中的phyper對差異表達基因（DEGs）做 GO 和 KEGG 富集分析，以Qvalue≤0.05的功能視為顯著富集。最后使用 R 軟件的 ggplot2繪制基因統(tǒng)計柱狀圖、火山圖、氣泡圖、GO 及 KEGG 富集圖。

2結果與分析

2.1低溫脅迫對甜椒葉片 MDA 含量和 SOD活性的影響

MDA 作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量植物低溫逆境下細胞膜受損程度的常用理化指標之一。MDA 含量測定發(fā)現(xiàn)（圖1a），在3 d 時甜椒幼苗葉片 MDA 含量與處理前相比顯著提高，在5 d 和7 d 時又降低，并趨于穩(wěn)定。孟雅寧等[11]發(fā)現(xiàn)甜椒低溫脅迫時 MDA 含量在7 d 后才開始下降，而劉凱歌等[12]則發(fā)現(xiàn)在10 d 。本研究發(fā)現(xiàn) MDA 含量在低溫脅迫后迅速上升，說明甜椒產(chǎn)生了低溫脅迫損傷，這與劉凱歌等研究結果相似。

植物在面對低溫等逆境脅迫時，葉片中的 ROS 含量會提高，攻擊其細胞膜，引起膜脂過氧化[13]。而 SOD 作為生物體內(nèi)的活性氧清除劑，在植物面臨逆境脅迫時處于重要地位，其活性隨著 ROS 含量的增高而下降[14]。本試驗 SOD 活性分析（圖1b）表明，葉片中 SOD 在低溫脅迫后先下降，在3 d 時甜椒幼苗葉片 SOD 活性與處理前相比顯著下降，在7 d 時 SOD 活性恢復至處理前水平。本研究顯示葉片中 SOD 在低溫脅迫后先下降，說明產(chǎn)生了低溫脅迫損傷；后期升高可能是 SOD 合成量增加。

2.2低溫脅迫對甜椒葉片光合作用的影響

對低溫肋迫下甜椒葉片的光合相關參數(shù)測定（圖2）發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下，甜椒葉片的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度及胞間 CO2含量均發(fā)生顯著下降。其中，凈光合速率在3 d 時顯著降低，5 d 時小幅提高，但7 d 時又降至3d 時的水平；胞間 CO2含量在3 d 時顯著降低，5 d 時開始緩慢上升，但是7 d 時仍顯著低于處理前；蒸騰速率與氣孔導度在3 d 時顯著下降后一直保持在同一地位水平，并無明顯回升。莫億偉等[15]認為低溫逆境下，光合速率主要受到相關酶活的影響，RuBPcase活性降低導致 ATP 供應不足，暗反應受到影響；果糖-1，6-二磷酸酯酶（FBPase）在低溫下也受到抑制，使電子傳遞速率降低；參與卡爾文循環(huán)的其他酶活也隨之降低，影響葉綠素含量及 CO2固定能力，最終影響光合速率。本試驗中低溫脅迫對甜椒葉片的光合作用的影響較大，無法自行調節(jié)回到常溫狀態(tài)下的水平，這與相關研究報道的低溫脅迫損傷導致光合作用下降的現(xiàn)象具有相似性。

2.3甜椒低溫脅迫轉錄組結果分析

2.3.1低溫脅迫下甜椒轉錄組數(shù)據(jù)質控及序列比對分析采用低溫處理0 d（ck）及3 d（cold）的甜椒葉片共6個樣本進行轉錄組測序（表2），一共測得38.48 Gb 數(shù)據(jù)。各樣品過濾后堿基數(shù)均達到6.35 Gb 以上，Q20堿基百分比均在98.09%以上， Q30堿基百分比均在93.37%以上，過濾后 Reads 比例均在96.9%以上。由表3可知，對 clean reads 進行組裝并去冗余后得到163349個Unigene，總長度、平均長度、N50以及 GC 含量分別為168775018 bp 、1033 bp 、1804 bp 和39.02%。以上指標數(shù)據(jù)說明本次測序質量良好，可進行下一步分析。將 clean reads 對比到參考基因序列得到對比序列，總對比率達90.13%以上。

2.3.2低溫脅迫下甜椒轉錄組差異表達基因篩選

以 P＜0.05、Qvalue≤0.05、|Log2FC|≥1為篩選條件，進一步對 ck 、cold 組間的 DEGs進行統(tǒng)計分析。結果顯示，本次轉錄組測序 DEGs共有21862個，其中12156個 DEGs 上調（55.6%），9706個 DEGs 下調（44.4%）（圖3）。從本次篩選出的 DEGs 中在蛋白/酶系統(tǒng)、光合作用、信號傳導與轉錄因子等幾個方面進一步篩選出低溫脅迫相關基因（表4）。在酶相關 DEGs 中， SOD 差異表達基因CaSOD（ID ：DN1491）、過氧化物酶（POD）基因（ID： DN338、DN39066、DN9372）、椒谷胱甘肽轉移酶（GST）基因（ID： DN1851，ID ： DN340、DN7501等）、肌醇半乳糖苷合成酶（GolS）（ID：DN13841、 DN2302）均呈現(xiàn)上調表達上調；在光合作用相關 DEGs 中，甜椒葉綠素 a/b 結合蛋白（CAB）4基因 CaCP4（ID ：DN25）與7-羥甲基葉綠素 a 還原酶（HCR）基因CaHCR（ID ： DN1414）呈現(xiàn)下調表達；信號傳導相關 DEGs 中，鈣依賴性蛋白激酶（CDPK）基因（ID ：DN-10103、DN11238）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）基因（ID：DN124、DN895、DN1474等）呈現(xiàn)上調表達；甜椒類鈣調磷酸酶亞基 B 蛋白質（CBL）基因 CaCBL1（ID： DN3892）與 CaCBL3（ID ： DN2025）上調；轉錄因子作為植物脅迫的主要調節(jié)因子也在本試驗中篩選出大量 DEGs ，其中甜椒 AP2基因 CaAP2（ID：DN11723）等上調，而 CaAP2 ANT（ID： DN790）下調；甜椒 MYB 基因（ID ： DN2522、DN1151等）上調；甜椒bHLH轉錄因子基因（ID： DN52、DN303、DN433等）上調；甜椒 WRKY 基因（ID ：DN1758、DN7795等）上調；甜椒 CAMTA 轉錄因子全部基因（ID：DN415、 DN5968、DN395）上調。

2.3.3低溫脅迫下甜椒轉錄組差異基因 GO 、KEGG 富集分析將篩選出的Unigene進行 NR 注釋，統(tǒng)計不同的物種比例。由圖4可知，注釋上共計70.40%的基因屬于甜椒/辣椒（Capsicum annuum）。將在 NR 數(shù)據(jù)庫上比對的Unigene結果注釋到 GO 數(shù)據(jù)庫3個方面：生物過程（Biological Process）、細胞組成（CellularComponent）、分子功能（Molecular Function）的分類圖，見圖5。其中，在生物過程中，細胞過程（cellular process）與代謝過程（metabolic process）這兩個亞類占比最大；在細胞組成中，僅有細胞解剖實體（cellular anato- mical entity）與蛋白質復合物（protein-containingcomplex）這兩個亞類；在分子功能中，結合（binding）與催化活性（catalytic activity）這兩個亞類占比最大。對比 DEGs 與 KEGG 數(shù)據(jù)庫，富集結果見圖6。結果顯示，本試驗 DEGs 主要富集在碳代謝（Carbon metabolism）途徑、植物激素信號轉導（Plant hormone signal transduction）、氨基酸合成（Biosynthesis of amino acids）途徑、輔助因子生物合成（Biosynthesis of cofactors）途徑等。

2.3.4低溫脅迫下甜椒轉錄組差異表達基因qRT- PCR 驗證為了驗證轉錄組數(shù)據(jù)的準確性，對20個低溫相關 DEGs進行qRT-PCR 驗證，結果表明這20個基因在甜椒葉片低溫脅迫中的變化趨勢與轉錄組的測序結果基本相符（圖7）。

3結論與討論

在甜椒生物酶系統(tǒng)中，SOD 及 POD 的 DEGs- CaSOD與CaPOD在低溫脅迫時上調，與以往試驗中水稻非生理脅迫[16]與甜椒低溫脅迫[9]結果相符。這是因為植物在遇到低溫時會引起其氧化應激產(chǎn)生過量的如 O2?、OH?等 ROS ，導致細胞損傷。而為防止其引起的氧化損傷，植物進化出了一些酶或者非酶的系統(tǒng)，其中就包括 SOD 及 POD 等[9]。當 O2?過量產(chǎn)生時， SOD 能將其轉化為 H2O2， POD 能進一步的使其轉化為水[17]。因此，本試驗中上調表達的CaSOD與CaPOD證明了甜椒在低溫脅迫時已啟動相關保護機制。本研究中甜椒在低溫環(huán)境下光合作用受到較大影響，而轉錄組結果也證實了這一點。甜椒葉綠素 a/b 結合蛋白（CAB）作為植物葉綠體中的重要組成成分之一，具有吸收光能并將其能量傳遞至光反應 I（PSI）與光反應 II（PSII）中等重要作用[18]。本次測序檢測到甜椒中 CAB 的調控基因 CaCP4表達顯著下調，與以往研究顯示 CAB 在低溫脅迫下調結果相似[19?20]，說明甜椒葉片在低溫脅迫時光合作用的光能吸收與傳遞受到影響。與此同時，植物進行光合作用時，葉綠素 a 能夠吸收光能并將其轉化成化學能，但是其本身不直接參與光合作用，需要被還原成一種更加活躍的酶，而 HCR 就是植物體內(nèi)主要還原葉綠素 a 的酶[21]。作為光合作用中關鍵酶 HCR 的調控基因，CaHCR在本次測序結果中顯著下調，說明甜椒葉片中光合反應中的電子傳遞鏈受阻，進而影響了光合作用中的化學反應。

甜椒在應對低溫脅迫時，其對低溫信號的傳導也是脅迫應答的重要環(huán)節(jié)之一。此次轉錄組測序結果表明，甜椒低溫脅迫時多數(shù)信號傳導基因上調。其中，CDPK 與 CBL 作為鈣結合蛋白，在植物低溫脅迫下鈣傳遞通路中發(fā)揮重要作用[22]。大米中 OsCDPK7過表達可提高其在低溫等逆境下的抗性[23]，這與本試驗中 CaCDPK7上調結果相似，說明甜椒中 CDPK 對于傳遞低溫信號有著重要的作用。除 CDPK 外，甜椒 CBL 調控基因 CaCBL1過表達。根據(jù)Conglin等[24]研究結果，CBL 相互作用蛋白激酶7（CIPK7）與 CBL1一同作用于低溫信號傳導，而 CBL1的功能缺失可導致植物對低溫的敏感以及抗寒能力的降低。本次實驗發(fā)現(xiàn)甜椒中 CaCBL1上調，說明低溫脅迫時已啟動相關抗寒基因。

轉錄因子（TF）是植物應對生物與非生物脅迫的重要調節(jié)因子[25]。在本試驗中，甜椒轉錄因子bHLH、WRKY 與 CAMTA 等調控基因多數(shù)上調。其中，bHLH是 CBF1與 CBF2的調控因子，廣泛存在于各種真核生物中[4， 24]。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH-92、bHLH49與 AabHLH35在植物非生物脅迫中起到了重要作用[26]。這與本試驗篩選出的 CabHLH-92、CabHLH35、CabHLH49等在低溫環(huán)境中上調結果一致，證明了其在甜椒低溫脅迫的作用。而 WRKY 作為綠色植物中常見的 TF ，常參與到植物的非生物脅迫中[4]。以往研究中， AtWRKY15、 WRKY25被證實在擬南芥非生物脅迫中作用顯著[27?28]，本研究中多數(shù) WRKY 上調，與以往研究基本相似。除此之外，本試驗還檢測出CaCA- MTA2、CaCAMTA3與 CaCAMTA4這3個 CAMTA 轉錄因子基因在低溫時過表達。在擬南芥中這3種 CAMTA 調控基因都對低溫做出迅速反應， CAMTA3更是被證明能快速對 DREB1B 做出調控，而 DREB 也被認為是低溫反應轉錄級聯(lián)的第一步[29]，由此可以看出 CAMTA 在植物尤其是甜椒低溫脅迫反應中的重要性。

綜上，本試驗通過生理生化及轉錄組測序技術，比較分析甜椒幼苗在低溫脅迫下的理化指標的變化及相關差異基因表達。理化試驗從側面證明了低溫導致甜椒脂膜過氧化，活性氧含量增高，細胞膜受到損傷。轉錄組測序分析結果表明，低溫促進了CaSOD的表達，消除了 ROS 等對細胞的毒性作用，提高了甜椒在低溫環(huán)境下的適應性。轉錄組篩選出的光合作用關鍵基因 CaCP4與CaHCR顯著下調，說明光合作用的下降可能是由于光能吸收與能量傳遞受阻。除上述差異基因外，轉錄組測序還發(fā)現(xiàn)甜椒在低溫脅迫時其信號傳導與轉錄因子中均存在大量差異性表達基因，且多數(shù)顯著上調。本研究為甜椒低溫脅迫下生理代謝及防御機制提供了更加全面的見解，為今后鑒定其低溫脅迫過程中的關鍵基因和損傷機制提供理論基礎。

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（責任編輯：柯文輝）