3′tRF-PheGAA對AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用及其機制

程雪麗 王凱 趙炎 王昆

［摘要］ 目的

探討3′tRF-PheGAA對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用及其機制。

方法 獲取小鼠乳鼠的原代心肌細(xì)胞，培養(yǎng)24 h以后分為A～G組。其中A組使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞36 h；B組使用NC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h；C組使用agomir-3′tRF-PheGAA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h；D組使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞84 h；E組在心肌細(xì)胞中加入終濃度為1 μmol/L的AngⅡ處理48 h；F組使用anta-NC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h，隨后加入終濃度1 μmol/L的AngⅡ處理48 h；G組使用anta-3′tRF-PheGAA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h，隨后加入終濃度1 μmol/L的AngⅡ處理48 h。采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測各組心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及心房鈉尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、β-重鏈肌球蛋白（β-MHC）基因表達水平；使用羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽對各組心肌細(xì)胞中F-肌動蛋白進行染色并計算心肌細(xì)胞骨架表面積。

結(jié)果 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，A～C組心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因水平差異具有顯著性（F=137.10～1 061.00，P＜0.05），其中與A組相比，C組3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因水平顯著上調(diào)（P＜0.05）；D～G組心肌細(xì)胞3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因表達水平差異有顯著性（F=117.60～572.30，P＜0.05），其中與E組相比，G組3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因表達水平顯著降低（P＜0.05）。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，A～C組心肌細(xì)胞骨架表面積差異有顯著性（F=35.06，P＜0.05），其中與A組相比，C組細(xì)胞骨架表面積顯著增加（P＜0.05）；D～G組心肌細(xì)胞骨架表面積差異有顯著性（F=48.05，P＜0.05），其中與E組相比，G組細(xì)胞骨架表面積顯著減少（P＜0.05）。

結(jié)論 3′tRF-PheGAA通過抑制自身表達，從而緩解AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

［關(guān)鍵詞］ RNA，非翻譯小片段；血管緊張素Ⅱ；肌細(xì)胞，心臟；心臟擴大

［中圖分類號］ R541??? ［文獻標(biāo)志碼］ A

近年來隨著社會工作節(jié)奏加快和人民生活水平提高，青年人心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。心肌肥厚是由于心臟為適應(yīng)超負(fù)荷工作而導(dǎo)致的病理性肥厚，其最終可導(dǎo)致患者心律失常、心力衰竭甚至死亡。隨著高通量RNA測序廣泛應(yīng)用，越來越多的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)。tsRNA是一種新發(fā)現(xiàn)的功能性非編碼小RNA，是tRNA的衍生片段（tRFs），由特定的核酸酶裂解而成[2]。根據(jù)前體或者成熟tRNA的切割位置不同，tsRNA一般可分為5′RNA半體、3′tRNA半體、tRF-1、5′UtRF、3′tRF、5′tRF和tiRNA[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)tsRNAs可以調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的基因表達、蛋白質(zhì)翻譯及應(yīng)激反應(yīng)，并在細(xì)胞周期、細(xì)胞間通訊、表觀遺傳及抗細(xì)胞凋亡等基本生物學(xué)過程中發(fā)揮作用[5-8]， 同時tsRNAs可能參與心肌細(xì)胞肥大的病理生理過程[9]。血管緊張素（Ang）是心臟肥大和心力衰竭的生物標(biāo)志物，也屬于核糖核酸內(nèi)切酶家族，可調(diào)節(jié)tsRNAs的生物發(fā)生和降解[9]。本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)3′tRF-PheGAA在肥大心肌組織及AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中均呈高表達，但其具體作用尚不清楚。本研究旨在探究3′tRF-PheGAA在AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大中的調(diào)控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1～3日齡雌雄不限的小鼠乳鼠購自青島大任富城畜牧有限公司，DMEM/F12培養(yǎng)基購自武漢譜諾賽生物科技有限公司，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自杭州艾科瑞生物科技有限公司，SYBR Green qPCR Master Mix購買于蘇州莫納生物科技有限公司，GAPDH和U6購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑購自上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽購自上海翊圣生物科技有限公司，胎牛血清購自蘇州依科賽生物科技股份有限公司，Ⅱ型膠原酶購買于美國Worthington公司，胰液素購自美國西格瑪公司，青/鏈霉素購自北京索萊寶生物科技有限公司，4%多聚甲醛購自廣州賽國生物科技有限公司。

1.2 小鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)

使用體積分?jǐn)?shù)0.75的乙醇溶液清潔小鼠乳鼠，并置于冰磚上低溫麻醉，接著使用彎剪剪開小鼠左胸腔，取出小鼠心臟置于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中清洗，然后剪碎并收集到錐形瓶中。在錐形瓶中加入5 mL由2 mL Ⅱ型膠原酶（0.2 g/L）、700 μL胰液素（0.14 g/L）和47.3 mL PBS配制的消化液，將錐形瓶在37 ℃水浴鍋中消化7 min，收集上清液至裝有體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清的離心管中，置于冰上備用。重復(fù)上述消化步驟7～8次至組織塊消失以后，將收集的所有上清液以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入DMEM/F12培養(yǎng)液重懸。再以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)0.05的胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)0.01的青/鏈霉素混合液）重懸。使用300目過濾網(wǎng)過濾重懸液，收集濾液至培養(yǎng)皿，在37 ℃含體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2的培養(yǎng)箱中差速貼壁培養(yǎng)1.5 h，未貼壁的上清液即為小鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞，已貼壁的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。將兩種細(xì)胞根據(jù)后續(xù)實驗需求接種于培養(yǎng)皿中，貼壁24 h后換液，用于后續(xù)實驗。

1.3 小鼠乳鼠心肌細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染

將小鼠乳鼠心肌細(xì)胞分別接種于6、24孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達70%～80%時，按照Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。具體步驟如下：A組使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠乳鼠心肌細(xì)胞36 h；B組使用NC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h；C組使用agomir-3′tRF-PheGAA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h；D組使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)心肌細(xì)胞84 h；E組在心肌細(xì)胞中加入終濃度1 μmol/L的AngⅡ處理48 h[10]；F組使用anta-NC轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h，隨后加入終濃度1 μmol/L的AngⅡ處理48 h；G組使用anta-3′tRF-PheGAA轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞36 h，隨后加入終濃度1 μmol/L的AngⅡ處理48 h。另取一部分1.2中得到的成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞，分別接種于6孔板中，使用DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h以后，用于實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測。

1.4 RT-qPCR技術(shù)檢測各組小鼠乳鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及心肌肥大標(biāo)志物基因表達水平

使用Trizol法提取1.3中得到的A～G組心肌細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后使用RT-qPCR技術(shù)檢測心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA（U6為內(nèi)參）和心肌肥大標(biāo)志物心房鈉尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）、β-重鏈肌球蛋白（β-MHC）（GAPDH為內(nèi)參）mRNA表達水平。提取1.3中培養(yǎng)24 h的成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后檢測3′tRF-PheGAA的表達水平。結(jié)果取3次實驗均值。引物名稱及序列見表1。

1.5 小鼠乳鼠心肌細(xì)胞骨架表面積計算

將步驟1.3的24孔板中各組心肌細(xì)胞用PBS洗滌3次后，使用4%多聚甲醛固定15 min，根據(jù)羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽說明書中的要求進行染色，封片后于-20 ℃條件下保存，通過普通熒光顯微鏡觀察細(xì)胞骨架并拍照，使用Image J軟件測量纖維狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）染色表面積以評估心肌細(xì)胞肥大情況。實驗重復(fù)5次，結(jié)果取均值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Turkey檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)? 果

2.1 小鼠乳鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中3′tRF-PheGAA相對表達水平比較

RT-qPCR結(jié)果顯示，3′tRF-PheGAA在心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中表達水平分別為1.00±0.02、0.26±0.03，心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA表達水平較成纖維細(xì)胞顯著升高（t=35.90，P＜0.05）。

2.2 A～C組小鼠心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達水平及細(xì)胞骨架表面積比較

RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，三組心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC表達水平差異有顯著性（F=137.10～1 061.00，P＜0.05），其中與A組相比，C組上述指標(biāo)表達水平均顯著增加（P＜0.05）。羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，三組心肌細(xì)胞骨架表面積分別為（1.00±0.10）、（1.03±0.10）和（1.66±0.19）μm2，三組比較差異有顯著性（F=35.06，P＜0.05），其中與A組相比，C組細(xì)胞骨架表面積顯著增加（P＜0.05）。見表2、圖1A～C。

2.3 D～G組小鼠心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達水平及細(xì)胞骨架表面積比較

RT-qPCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示，D～G組細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC的mRNA表達水平差異有顯著性（F=117.60～572.30，P＜0.05）；與E組相比，G組上述指標(biāo)表達水平顯著降低（P＜0.05）。羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果示，D～G組心肌細(xì)胞骨架表面積分別為（1.00±0.13）、（1.65±0.13）、（1.68±0.07）和（1.26±0.07）μm2，四組比較差異具有顯著意義（F=48.05，P＜0.05），其中與E組相比，G組細(xì)胞的骨架表面積顯著減小（P＜0.05）。見圖1D～G、表3。

3 討? 論

我國目前是全球心血管疾病負(fù)擔(dān)最重的國家之一[11]。由于現(xiàn)在人類生活方式的改變，心血管疾病流行情況也在發(fā)生變化，農(nóng)村居民較城鎮(zhèn)占比更高，發(fā)病人群也越來越年輕化[12]。心臟肥厚分為病理性肥厚和生理性肥厚，病理性肥厚多由高血壓、心肌梗死、結(jié)構(gòu)性心臟疾病等造成[13]，此時心肌肥大細(xì)胞中ANP、BNP、β-MHC表達水平會明顯上調(diào)，細(xì)胞表面積變大[14]。然而，持續(xù)病理超負(fù)荷會引起心臟適應(yīng)不良及重塑，導(dǎo)致心力衰竭[15]。目前對心肌肥大機制的研究還不夠深入，因此對心肌肥大分子機制的研究具有重要意義。

近年來，新類別的非編碼RNA正在逐漸被發(fā)現(xiàn)[16-17]。長期以來，tRNA被認(rèn)為是參與蛋白質(zhì)翻譯過程的重要組分，其衍生片段tsRNA包括tiRNA和tRFs，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，以及基因的調(diào)控、轉(zhuǎn)座子抑制等細(xì)胞生物學(xué)過程，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[7，18-19]。tsRNA調(diào)節(jié)mRNA的失穩(wěn)、翻譯及逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后過程。SHEN等[21]研究發(fā)現(xiàn)，tRF-5在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠肥大心肌中高表達，而tRFs1和tRFs2的過表達則導(dǎo)致了心肌肥大標(biāo)志物ANP、BNP、β-MHC基因的上調(diào)。在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中，過表達的tsRNA通過競爭性結(jié)合細(xì)胞色素C，可抑制成纖維細(xì)胞凋亡[20]。SHEN等[21]研究表明，tRFs在異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心臟肥大中可能參與了心肌肥大的代際遺傳，且tRFs對于心肌肥大的影響在大鼠后代中更加明顯。低蛋白飲食小鼠父系睪丸生殖細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生增加，可通過激活A(yù)TF7和H3K9me2的表達調(diào)節(jié)tsRNA轉(zhuǎn)錄[22]。有研究也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激反應(yīng)條件（如氧化應(yīng)激、缺氧、衰老和代謝紊亂等等）可誘導(dǎo)人及小鼠心肌組織中tsRNA異常表達[23-25]。在心臟肥大、心肌缺血、動脈粥樣硬化、靜脈曲張和肺動脈高壓等疾病中，心臟組織tsRNA表達水平均發(fā)生變化[9]。根據(jù)特定類型tsRNA在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的積極或消極作用，tsRNA可能為該類疾病新型治療靶點或特定生物標(biāo)志物的研究提供新思路。但是目前心血管疾病中的tsRNA的作用靶點、結(jié)合位點、誘導(dǎo)劑和調(diào)節(jié)因子仍不清楚，其結(jié)合方式、修飾類型、作用機制更是知之甚少。

本研究前期實驗發(fā)現(xiàn)，3′tRF-PheGAA在AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠乳鼠心肌肥大細(xì)胞中表達明顯上調(diào)，并且心肌細(xì)胞比成纖維細(xì)胞中的表達水平更高。本研究通過表達以及抑制小鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞的3′tRF-PheGAA，通過檢測心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC mRNA表達水平及測量心肌細(xì)胞骨架表面積大小等指標(biāo)，探討心肌細(xì)胞肥大與3′tRF-PheGAA表達的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，C組心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA表達明顯上調(diào)，心肌細(xì)胞肥大指標(biāo)ANP、BNP、β-MHC mRNA也明顯上調(diào)，且C組心肌細(xì)胞骨架表面積較A組表面積明顯增大，表明過表達3′tRF-PheGAA可誘導(dǎo)小鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大。在D～G組中，G組心肌細(xì)胞中3′tRF-PheGAA表達相較于E組明顯下調(diào)，心肌肥大指標(biāo)ANP、BNP、β-MHC mRNA也明顯下調(diào)，細(xì)胞骨架表面積相較于E、F組則明顯減小，表明抑制3′tRF-PheGAA表達可緩解AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大。

綜上所述，抑制小鼠乳鼠原代心肌細(xì)胞當(dāng)中的3′tRF-PheGAA表達能夠緩解AngⅡ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大，3′tRF-PheGAA可能是潛在的治療心肌細(xì)胞肥大的靶點，但其具體分子機制還有待后續(xù)深入研究。

倫理批準(zhǔn)和動物權(quán)利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學(xué)實驗動物福利倫理委員會的審核批準(zhǔn)（文件號20220220-C579020230725017）。所有實驗過程均遵照《青島大學(xué)動物福利倫理守則》的條例進行。

［參考文獻］

[1]ANTZA C， GALLO A， BOUTARI C， et al. Prevention of cardiovascular disease in young adults： Focus on gender differences. A collaborative review from the EAS Young Fellows[J]. Atherosclerosis， 2023，384：117272.

[2]WEN J T， HUANG Z H， LI Q H， et al. Research progress on the tsRNA classification， function， and application in gynecological malignant tumors[J]. Cell Death Discov， 2021，7（1）：388.

[3]SELITSKY S R， SETHUPATHY P. tDRmapper： Challenges?and solutions to mapping， naming， and quantifying tRNA-derived RNAs from human small RNA-sequencing data[J]. BMC Bioinformatics， 2015，16：354.

[4]LI S Q， XU Z P， SHENG J H. tRNA-derived small RNA： A novel regulatory small non-coding RNA[J]. Genes， 2018，9（5）：246.

[5]CHEN Q， ZHANG X D， SHI J C， et al. Origins and evolving functionalities of tRNA-derived small RNAs[J]. Trends Biochem Sci， 2021，46（10）：790-804.

[6]ZHANG Y F， ZHANG X D， SHI J C， et al. Dnmt2 mediates intergenerational transmission of paternally acquired metabolic disorders through sperm small non-coding RNAs[J]. Nat Cell Biol， 2018，20（5）：535-540.

[7]CHEN Q， YAN M H， CAO Z H， et al. Sperm tsRNAs contribute to intergenerational inheritance of an acquired metabolic disorder[J]. Science， 2016，351（6271）：397-400.

[8]YOSHIDA K， MAEKAWA T， LY N H， et al. ATF7-dependent epigenetic changes are required for the intergenerational effect of a paternal low-protein diet[J]. Mol Cell， 2020，78（3）：445-458.e6.

[9]WANG S X， LUO Z Y， YUAN L D， et al. tRNA-derived small RNAs： Novel insights into the pathogenesis and treatment of cardiovascular diseases[J]. J Cardiovasc Transl Res， 2023，16（2）：300-309.

[10]ZHOU Q L， PAN L L， XUE R C， et al. The anti-microbial peptide LL-37/CRAMP levels are associated with acute heart failure and can attenuate cardiac dysfunction in multiple preclinical models of heart failure[J]. Theranostics， 2020，10（14）：6167-6181.

[11]THE WCOTROCHADIC. Report on cardiovascular health and diseases in China 2022：An updated summary[J]. Biomed Environ Sci， 2023，36（8）：669-701.

[12]ZHAO D， LIU J， WANG M， et al. Epidemiology of cardiovascular disease in China： Current features and implications[J]. Nat Rev Cardiol， 2019，16（4）：203-212.

[13]OKA T， AKAZAWA H， NAITO A T， et al. Angiogenesis and cardiac hypertrophy： Maintenance of cardiac function and causative roles in heart failure[J]. Circ Res， 2014，114（3）：565-571.

[14]CAMACHO LONDOO J E， TIAN Q H， HAMMER K， et al. A background Ca2+ entry pathway mediated by TRPC1/TRPC4 is critical for development of pathological cardiac remodelling[J]. Eur Heart J， 2015，36（33）：2257-2266.

[15]ZHUANG L F， JIA K N， CHEN C， et al. DYRK1B-STAT3 drives cardiac hypertrophy and heart failure by impairing mitochondrial bioenergetics[J]. Circulation， 2022，145（11）：829-846.

[16]GIRALDEZ M D， SPENGLER R M， ETHERIDGE A， et al. Erratum： Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling[J]. Nat Biotechnol， 2018，36（9）：899.

[17]LIU Q， DING C J， LANG X Q， et al. Small noncoding RNA discovery and profiling with sRNA tools based on high-throughput sequencing[J]. Brief Bioinform， 2021，22（1）：463-473.

[18]PENG E Y， SHU Y， WU Y K， et al. Presence and diagnostic value of circulating tsncRNA for ovarian tumor[J]. Mol Cancer， 2018，17（1）：163.

[19]KIM H K， FUCHS G， WANG S C， et al. A transfer-RNA-derived small RNA regulates ribosome biogenesis[J]. Nature， 2017，552（7683）：57-62.

[20]WANG H J， ZHU J， JIANG L P， et al. Mechanism of Heshouwuyin inhibiting the Cyt c/Apaf-1/Caspase-9/Caspase-3 pathway in spermatogenic cell apoptosis[J]. BMC Complement Med Ther， 2020，20（1）：180.

[21]SHEN L Y， GAN M L， TAN Z D， et al. A novel class of tRNA-derived small non-coding RNAs respond to myocardial hypertrophy and contribute to intergenerational inheritance[J]. Biomolecules， 2018，8（3）：54.

[22]ZHANG X D， CHEN Q. A twist between ROS and sperm-mediated intergenerational epigenetic inheritance[J]. Mol Cell， 2020，78（3）：371-373.

[23]FU H J， FENG J J， LIU Q， et al. Stress induces tRNA cleavage by angiogenin in mammalian cells[J]. FEBS Lett， 2009，583（2）：437-442.

[24]WANG J， HAN B， YI Y C， et al. Expression profiles and functional analysis of plasma tRNA-derived small RNAs in children with fulminant myocarditis[J]. Epigenomics， 2021，13（13）：1057-1075.

[25]YANG Z Y， LI P F， LI Z Q， et al. Altered expression of transfer-RNA-derived small RNAs in human with rheumatic heart disease[J]. Front Cardiovasc Med， 2021，8：716716.