細胞外基質硬度對人前列腺癌細胞可塑性調控作用的研究

鄭雨 馬磊 李睿智 牟潔 李菁 王棟 祝海

［摘要］ 目的

探討細胞外基質硬度對人前列腺癌細胞LNCaP可塑性調控的作用。

方法 將人LNCaP細胞分別于楊氏模量為3 GPa（A組）、20 kPa（B組）、6 kPa（C組）和1 kPa（D組）四種不同硬度細胞外基質培養皿中培養1周。采用明場顯微鏡及熒光顯微鏡觀察各組細胞在不同硬度基底上的形態；采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）技術檢測各組細胞的管腔細胞標志物基因AR、CK8、CK18、PSA，基底細胞標志物基因CK5、P63，以及增殖基因KI67、PCNA的表達水平。

結果 明場顯微鏡及熒光顯微鏡觀察結果顯示，A組人LNCaP細胞呈現典型鋪展上皮細胞形態，而B～D組均呈現團聚小細胞片狀態，且D組細胞形成了三維類器官結構。RT-qPCR結果顯示，四組人LNCaP細胞中KI67、P63基因表達水平無顯著差異（P＞0.05）；B組PCNA基因表達水平顯著高于A、C組（F=34.96，t=8.39、6.37，P＜0.05）；B組CK5基因表達水平顯著高于其他三組（F=29.35，t=4.46～6.73，P＜0.05）；D組AR、CK8、CK18、PSA基因表達水平顯著高于其他三組（F=13.66～56.43，t=3.03～11.51，P＜0.05）。

結論 硬度較低（楊氏模量1 kPa）的細胞外基質環境能較好維持人LNCaP細胞的管腔細胞特征，而硬度較高（楊氏模量20 kPa）的細胞外基質能使人LNCaP細胞呈現出中間態細胞表型，或許是導致前列腺癌發生的因素之一。

［關鍵詞］ 前列腺腫瘤；細胞系，腫瘤；細胞外基質；細胞可塑性

［中圖分類號］ R737.25;R329.24??? ［文獻標志碼］ A

前列腺癌發生發展的過程中往往伴隨著癌細胞可塑性的變化。細胞可塑性是指一種類型的細胞變成另一種類型細胞的過程[1]。癌細胞的可塑性特性可使前列腺癌細胞逃避靶向藥物作用，從而促進腫瘤細胞存活，與腫瘤侵襲性增加密切相關，給臨床腫瘤治療增加極大難度[2]。細胞外基質是腫瘤早期或中期微環境發生改變的因素之一，可影響細胞的行為和表型[3]，與實體腫瘤的發生有著緊密的聯系[4]。實體腫瘤的發生發展往往同時伴隨著腫瘤硬度的增加[5]。細胞外基質的成分和生物力學性質的改變可為前列腺癌細胞創造適當的生長條件，從而促進前列腺癌發展及癌細胞的侵襲性和耐藥性[6]。目前國內外有關細胞外基質對前列腺癌細胞可塑性影響的研究較少，本研究在實驗室前期建立的細胞外基質硬度可調的基礎上，探究細胞外基質硬度對人前列腺細胞LNCaP的可塑性調控作用，以求為控制前列腺癌進展提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人LNCaP細胞、細胞培養基1640、胎牛血清、PBS磷酸緩沖液均購自武漢普諾賽生命科技有限公司，青霉素、鏈霉素、兩性霉素B溶液的三抗溶液購自上海生物科技股份有限公司，胰蛋白酶購自青島艾菲特生工生物科技有限公司，反轉錄試劑及其試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，Trizol試劑、Nanodrop儀購自美國Thermo Fisher科技有限公司，OCT包埋劑、倒置熒光顯微鏡購自美國賽默飛世爾科技有限公司，DAPI熒光染料購自北京索萊寶生物科技有限公司，電動明場顯微鏡購自日本Nikon公司，4%多聚甲醛固定液購自武漢卡諾斯科技有限公司，蔗糖購自上海阿拉丁生化科技有限公司，實驗用離心管、培養皿和槍頭耗材購自上海依科賽生物技術有限公司。

1.2 人LNCaP細胞的分組與培養

將實驗室前期配制好的細胞外基質溶液[7]倒入培養皿中孵育1 h，用PBS磷酸緩沖液清洗普通聚苯乙烯培養皿基底（楊氏模量約為3 GPa）作為A組，將不同容量的細胞外基質溶液倒入培養皿中，置于無菌干燥盒中37 ℃干燥48～72 h，得到楊氏模量約為20 kPa（B組）、6 kPa（C組）和1 kPa（D組）的胞外基質基底。將人LNCaP細胞在含體積分數0.05 CO2、溫度36～37 ℃、濕度95%的環境下培養7 d后，在電動明場顯微鏡下觀察細胞，當細胞鋪占整個培養皿約80%的面積時，用質量濃度2.5 g/L的胰蛋白酶將大片狀細胞完全消化后，移至脫落細胞培養皿進行計數。分別取約3×105個細胞量種植于上述四組細胞外基質基底上進行培養，四組細胞每天更換相應培養基5 mL，培養環境同前，培養7 d后備用。

1.3 顯微鏡觀察各組細胞形態

使用電動明場顯微鏡觀察1.2中各組細胞形態并拍照。用4%多聚甲醛固定四組細胞30 min，每組細胞均依次浸沒于質量濃度150、300 g/L的蔗糖溶液中各24 h進行脫水處理，隨后包埋于OCT包埋劑中進行冰凍切片。加入DAPI熒光染料染色30 min后封片，隨后進行熒光顯微鏡觀察拍照。

1.4 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各組細胞相關基因表達水平

取1.2中各組細胞，每組各取部分使用Trizol試劑提取人LNCaP細胞總RNA，使用Nanodrop儀測定RNA濃度與純度。按照反轉錄試劑盒使用說明書將RNA反轉錄為cDNA，使用RT-qPCR法檢測各組細胞中管腔細胞標志物基因AR、CK8、CK18、PSA，基底細胞標志物基因CK5、P63，以及增殖基因KI67、PCNA表達水平，以GAPDH為內參，引物名稱及其序列見表1。

1.5 統計學方法

使用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數據進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結? 果

2.1 四組細胞的形態學比較

電動明場顯微鏡及熒光顯微鏡觀察結果顯示，A組人LNCaP細胞鋪展良好，呈現典型的單層上皮細胞形態，B～D組中人LNCaP細胞以團聚的小細胞片形式生長，且D組人LNCaP細胞生長為三維類器官結構。見圖1、2。

2.2 四組細胞中管腔細胞標志物、基底細胞標志物及增殖基因表達水平比較

RT-qPCR檢測結果顯示，B組細胞增殖基因PCNA表達水平顯著高于A、C組（F=34.96，t=8.39、6.37，P＜0.05），增殖基因KI67表達水平四組間無顯著差異（P＞0.05）；D組管腔細胞標志物基因AR、CK18、CK8、PSA表達水平顯著高于其他三組（F=13.66～56.43，t=3.03～11.51，P＜0.05）；B組基底細胞標志物基因CK5表達水平顯著高于其他三組（F=29.35，t=4.46～6.73，P＜0.05），而基底細胞標志物基因P63表達水平四組間無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

3 討? 論

傳統觀點認為細胞外基質只是一個簡單的組織細胞支持結構，但隨著研究的不斷深入，細胞外基質的結構復雜性和功能多樣性被逐漸認識[8-9]。細胞外基質是細胞賴以生存的微環境，且直接參與細胞間的力學轉導、信息傳遞、調節干細胞行為等一系列生物學活動[10-11]。癌細胞的增殖、存活及其侵襲能力也在很大程度上依賴于腫瘤微環境中的細胞外基質[12]，反之癌細胞也可重塑胞外基質，兩者相互作用從而導致腫瘤的生長、擴散及轉移[13-14]。不同硬度的細胞外基質可以調節腫瘤的基因型和表型，誘導癌細胞表型變化[15]。腫瘤轉移的基本特征包括侵襲性、可塑性、微環境調節能力及在侵襲組織中定殖能力，這些特征都與細胞外基質的性質（組成、密度和硬度等）緊密相關[16-17]。

大多數前列腺癌細胞屬于管腔細胞類型，其管腔細胞標志物AR和PSA基因表達水平較高[18]。本研究選擇人LNCaP細胞進行實驗驗證，原因為LNCaP細胞系具有較為明顯的上皮細胞特性，細胞分裂速度較快[19]，對雄激素較敏感[20]，且表達管腔細胞的關鍵生物標志物基因AR、PSA等，這些特點使其廣泛應用于前列腺癌的研究。本研究結果顯示，不同硬度的細胞外基質能夠影響人LNCaP細胞形態，人LNCaP細胞在軟基底上較易團聚成小細胞片，尤其是在D組基底（楊氏模量1 kPa）上形成三維類器官球狀結構，而在較硬的A組基質（楊氏模量3 GPa）上鋪展良好，形成緊密的單層上皮細胞層，這意味著硬基底可能促進人LNCaP細胞的相互連接和遷移。

本研究針對人LNCaP細胞增殖能力，檢測了細胞中兩種增殖標志物基因KI67和PCNA，結果顯示B組（楊氏模量20 kPa）PCNA表達水平顯著高于A、C組（楊氏模量3、6 kPa），而另一種增殖基因KI67表達水平四組間無顯著差異。該結果表明細胞外基質硬度對于腫瘤細胞增殖能力的調節可能是非線性的，即在某些特定細胞外基質硬度范圍內，腫瘤細胞增殖相關基因表達才隨硬度增高而上調，該結果有待后續深入研究。

腫瘤細胞的可塑性是近年來前列腺癌研究領域的熱點之一。本研究結果顯示，D組細胞的管腔細胞標志物AR、CK8、CK18、PSA表達最高，表明軟細胞外基質環境更有利于管腔細胞的表型維持和生長。另外，B組細胞的基底細胞標志物CK5表達水平顯著高于其他三組，該結果表明基底軟硬程度可調節LNCaP細胞的可塑性。在B組細胞外基質中，人LNCaP細胞同時具備管腔細胞和基底細胞的特征，呈現出中間態細胞的特征。中間態細胞是人胚胎發育過程中短暫出現的一種細胞類型，在成人前列腺組織中數量減少，中間態細胞可能是前列腺癌的重要細胞來源。本研究結果提示細胞外基質硬度的增強可能在前列腺癌中間態細胞形成的調控中發揮作用。

另外，本研究具有一定的局限性，如體外實驗與體內真實情況具有一定差異。本研究所利用的體外模型是基于不同厚度的細胞外基質所呈現硬度（楊氏模量）的不同[21-22]，然而體內影響細胞外基質的腫瘤微環境更為復雜，如細胞外基質的重排、交聯、沉積及特定細胞外基質蛋白的降解等[23-24]，另外體內外細胞外基質的蛋白成分也有一定差異[25]。上述差異是本研究難以模擬的部分，有待后續研究進一步改進。

本研究比較了四種不同硬度的細胞外基質對人LNCaP細胞的可塑性影響，發現硬度較低（楊氏模量1 kPa）的細胞外基質環境能較好維持前列腺細胞的管腔細胞特征，而硬度較高（楊氏模量20 kPa）的細胞外基質能使人LNCaP細胞呈現出中間態細胞表型，或許是導致前列腺癌發生的因素之一。

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