高尿酸血癥對雌性大鼠生殖功能的影響及其機制

龔雪琳 鄒通 宋淼 劉呈楊 張清 孫鈺 邢士超

［摘要］ 目的

探討高尿酸血癥（HUA）對雌性大鼠生殖功能的影響及其機制。

方法 雌性Wistar大鼠18只，隨機分為3組，每組各6只。高尿酸組（HUA組）和高尿酸恢復組（HR組）大鼠每天灌胃50 mg/kg尿酸及腹腔注射250 mg/kg氧嗪酸鉀，至第9周時，HR組大鼠改用等體積生理鹽水進行灌胃和腹腔注射，HUA組不變，再繼續處理7周；對照組（N組）大鼠給予相同體積的生理鹽水灌胃及腹腔注射，持續16周。第16周時，測量三組大鼠體質量和子宮、卵巢質量，并計算子宮、卵巢系數；蘇木精-伊紅染色法觀察3組大鼠子宮、卵巢組織的病理變化；酶聯免疫吸附試驗法檢測3組大鼠血清中促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、雌二醇（E2）含量；使用陰道脫落細胞涂片法觀察3組大鼠動情周期；采用比色法檢測3組大鼠子宮組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平；采用免疫熒光法檢測3組大鼠子宮組織中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的熒光強度。

結果 與N組大鼠相比，HUA組大鼠子宮系數降低、卵泡數量減少、子宮內膜厚度變薄，動情間期縮短，血清FSH水平增加，子宮組織中SOD、GSH水平降低，而MDA含量增加（F=7.80～111.40，t=3.95～12.37，P<0.05），子宮組織中TNF-α熒光強度增高；與HUA組大鼠相比，HR組卵泡數量顯著增多、子宮內膜顯著變厚，血清中FSH水平增高，子宮組織中SOD、GSH水平顯著增高，而MDA水平顯著降低（t=3.40～11.56，P<0.05），子宮組織中TNF-α熒光強度降低。

結論 HUA可致雌性大鼠生殖功能下降，其可能機制與大鼠血清尿酸水平升高，致性激素分泌紊亂、機體氧化應激水平增高，進而誘導炎癥反應發生有關。

［關鍵詞］ 高尿酸血癥；動情期；性腺甾類激素；細胞因子類；炎癥；氧化性應激；女（雌）性；大鼠，Wistar

［中圖分類號］ R589.7；R711.5??? ［文獻標志碼］ A

尿酸是人體嘌呤代謝的最終產物，次黃嘌呤和黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的催化下最終形成尿酸。尿酸主要產生于肝臟、腸道、肌肉、腎臟、血管內皮等，其他部位也少量產生。約2/3的尿酸由腎臟排泄，其余1/3由腸道排泄或被腸道細菌吸收[1]。高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）是由于尿酸產生增加或排泄減少而導致血清尿酸水平異常升高的一種代謝性疾病。研究表明，血液中尿酸水平與女性生殖健康間存在密切聯系，比如PCOS患者血液中尿酸水平及HUA患病率明顯高于非PCOS患者[2-3]。關于HUA對女性生殖功能的直接影響方面，文獻報道較少。本研究旨在通過觀察HUA雌性大鼠動情周期、血液中各性激素水平、子宮組織中氧化應激相關指標及炎癥因子的表達情況，探究HUA對雌性大鼠生殖功能的影響，為HUA女性患者的生殖健康提供實驗數據參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

6周齡健康成年雌性Wistar大鼠18只，購自濟南朋悅實驗動物技術有限公司。尿酸、氧嗪酸鉀以及亞甲藍染色劑購買于上海生工生物工程股份有限公司；ELISA檢測試劑盒購買于上海愛萌優寧生物技術有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒購買于南京建成生物工程研究所有限公司；兔抗鼠一抗、二抗抗體及蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物以及分組 18只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為高尿酸組（HUA組）、高尿酸恢復組（HR組）和對照組（N組），每組各6只。HUA組和HR組大鼠每天灌胃50 mg/kg尿酸及腹腔注射250 mg/kg氧嗪酸鉀，至第9周時，HR組大鼠改用等體積生理鹽水分別進行灌胃和腹腔注射，HUA組不變，再持續處理7周。N組大鼠給予相同體積的生理鹽水灌胃以及腹腔注射，共16周。實驗期間各組大鼠每隔2 d測量一次體質量，每2周內眥采血0.2 mL，采血前大鼠先空腹6 h，采集的血液室溫靜置 2 h后，于4 ℃下以3 500 r/min離心10 min，采用血清生化儀檢測大鼠血清當中尿酸水平，采用ELISA試劑盒檢測血清中促性腺激素釋放激素（GnRH）、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）及雌二醇（E2）的含量。

1.2.2 動情周期觀察 各組大鼠均于每日8：00和20：00時，用生理鹽水濕潤醫用棉簽后，伸入大鼠陰道中收集脫落的組織，制作細胞涂片，經亞甲藍染色5 min后，置于普通光鏡下觀察，記錄涂片中白細胞和上皮細胞形態和各類型細胞比例，并根據文獻[4]中的標準判斷大鼠的動情周期（動情前期、動情期、動情后期、動情間期）。

1.2.3 子宮、卵巢系數計算 第16周時，各組大鼠經異氟烷深度麻醉后處死，測量體質量，完整剝離大鼠一側的子宮、卵巢，吸除表面水分后測量子宮、卵巢的質量，計算子宮、卵巢系數。

1.2.4 HE染色及觀察 分別取各組大鼠的一側子宮和卵巢組織，依次行固定、脫水、透明、石蠟包埋處理后，制作成石蠟切片。每組各取1/2的子宮和卵巢組織切片行HE染色，以中性樹膠封片后，于普通光學顯微鏡下觀察并拍照。其余組織切片備用。

1.2.5 大鼠子宮組織中MDA、SOD及GSH水平的測定 分別稱取各組大鼠的子宮組織100 mg，放入冷凍研磨儀中加入生理鹽水制備10%組織勻漿，4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取上清液，按照MDA、SOD、GSH檢測試劑盒說明書要求的操作步驟，檢測子宮組織中MDA、SOD及GSH的水平。

1.2.6 免疫熒光染色 取各組大鼠剩余的子宮、卵巢組織石蠟切片，經脫蠟、脫水、抗原修復、封閉后，與稀釋一抗4 ℃孵育過夜；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌3次，室溫20 ℃下與二抗（1%牛血清白蛋白）避光孵育1 h，PBS避光洗滌3次，用含DAPI的抗熒光淬滅封片劑封片后，在全自動正置熒光顯微鏡下觀察子宮組織中TNF-α熒光強度。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計學分析并制圖。各組大鼠不同時間點的各項計量數據比較采用重復測量設計的方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結? 果

2.1 各組大鼠體質量和血清中尿酸水平比較

重復測量設計的方差分析結果顯示，在干預處理的16周內，各組大鼠間體質量比較差異無顯著性（P>0.05），見圖1A。三組大鼠的血清中尿酸檢測結果顯示，時間、組別、時間與組別的交互作用對血清中尿酸水平均有明顯影響（F時間=112.20，F組別=14.82，F時間*組別=47.18，P<0.05）；其中，N組大鼠血清中尿酸水平隨時間延長無顯著性差異（P>0.05）；HUA組大鼠血清中尿酸水平隨時間延長呈增高趨勢（F=8.17～12.33，P<0.05）；HR組大鼠8周前血清中尿酸水平隨時間延長呈增高趨勢（F=6.48～7.24，P<0.05），第10周較第8周顯著降低（F=23.68，P<0.05），第10周后隨時間延長無明顯差異（P>0.05）；HUA組大鼠各時間點血清中尿酸水平均明顯高于N組大鼠（F=23.78～142.80，P<0.05）；前8周，HR組大鼠各時間點血清中尿酸水平均顯著性高于N組（F=27.62～62.31，P<0.05），與HUA組相比無明顯差異（P>0.05），在后8周，HR組大鼠各時間點血清中尿酸水平明顯低于HUA組（F=33.41～131.75，P<0.05），與N組相比無明顯差異（P>0.05）。見圖1B。

2.2 各組大鼠子宮、卵巢系數比較

第16周時，N組、HUA組、HR組大鼠子宮系數分別為0.23±0.02、0.17±0.02、0.19±0.02，各組大鼠比較差異有顯著性（F=10.98，P<0.05），其中與N組相比，HUA組子宮系數明顯降低（t=4.78，P<0.05），HR組與N組、HUA組相比均無明顯差異（P>0.05）。N組、HUA組、HR組大鼠卵巢系數分別為0.02±0.02、0.02±0.01、0.02±0.01，各組間比較差異無顯著性（P>0.05）。

2.3 各組大鼠卵泡數量及子宮內膜厚度比較

第16周時，HUA組大鼠的卵泡數量與N組相比明顯減少，HR組與HUA組相比明顯增多，與N組相比明顯減少；第16周時， HUA組大鼠的子宮內膜厚度與N組相比明顯變薄，HR組與HUA組相比明顯增厚，與N組相比無明顯差異。見圖2。

2.4 各組大鼠血清中性激素水平比較

第16周時，三組大鼠血清中GnRH、LH、E2水平比較差異無顯著性（P>0.05）；三組大鼠血清中FSH水平整體比較差異具有顯著意義（F=24.47，P<0.05），三組間兩兩比較差異均具有顯著性（t=3.95～10.12，P<0.05）。見表1。

2.5 各組大鼠動情周期比較

第16周時，三組大鼠的動情前期、動情期和動情后期比較差異無顯著性（P>0.05），動情間期比較差異有顯著性（F=7.80，P<0.05），其中HUA組大鼠的動情間期比N組大鼠顯著縮短（t=4.95，P<0.05），HR組與N組、HR組與HUA組比較差異均無顯著性（P>0.05）。見表2。

2.6 各組大鼠子宮組織中SOD、GSH和MDA水平比較

第16周時，三組大鼠子宮組織中SOD、GSH和MDA水平比較差異均有顯著意義（F=8.94～111.40，P<0.05）；其中HUA組與另外兩組比較，上述三個指標均有顯著差異（t=3.40～12.37，P<0.05）；HR組大鼠與N組上述三個指標比較無明顯差異（P>0.05）。見表3。

2.7 三組大鼠子宮組織中TNF-α熒光強度比較

第16周時，HUA組大鼠子宮組織中TNF-α熒光強度較N組和HR組明顯增強，HR組與N組比較無明顯差異。見圖3。

3 討? 論

隨著社會經濟發展和生活水平的提高，我國人群中HUA和痛風的患病率逐年上升，并且呈現年輕化的趨勢，嚴重影響患者生活質量[5]。既往有研究表明，HUA患病率在患有妊娠期高血壓的孕婦中高發[6]，并且患有子癇前期的孕婦常常同時伴有HUA[7]。血液中高尿酸水平還可通過促進炎癥、氧化應激來影響母體胎盤發育和功能，以及通過引發內皮功能障礙來影響母體血管健康[8]。

本研究在設立HUA組大鼠的基礎上，還設立了HR組大鼠，通過觀察HR組大鼠血清尿酸水平恢復至正常水平后，與N組及HUA組大鼠相比，各待測指標是否得以恢復，由此進一步明確血液中高尿酸水平對于生殖功能的影響。結果顯示，在干預處理的16周內，三組大鼠體質量比較無明顯差異，各組大鼠生長狀況均良好；HUA組大鼠血液中尿酸水平隨處理時間延長呈明顯升高趨勢；HR組從第9周開始，只灌胃等體積生理鹽水，大鼠因體內尿酸酶的作用，第10周血液中尿酸水平恢復至正常水平，與N組比較無顯著差異。器官系數能在一定程度上反應器官生長發育情況，本研究中HUA組大鼠子宮系數較N組明顯降低，子宮組織HE染色結果也提示，HUA組大鼠較N組子宮內膜變薄，當血液中尿酸水平恢復至正常水平后，HR組大鼠子宮內膜厚度出現一定程度的恢復。研究表明，小鼠子宮內膜過薄會導致受精卵無法良好著床，無法維持正常妊娠[9]。因此，本研究結果提示HUA會引發大鼠子宮內膜萎縮或其他退行性變，進一步影響受精卵著床。

本研究對大鼠卵巢組織切片進行HE染色，觀察結果顯示，HUA組大鼠較N組正常卵泡數量顯著減少，而當血液中尿酸水平恢復至正常水平后，HR組大鼠卵泡數量得以恢復，提示HUA可導致卵巢儲備能力降低。有研究顯示，雌性大鼠卵巢的生殖功能與分泌功能可影響大鼠動情周期[10]。本研究又進一步觀察各組大鼠的陰道涂片結果，發現HUA大鼠較N組動情周期出現紊亂，提示HUA會引發大鼠出現排卵異常。

血液中高尿酸水平除了對子宮、卵巢器質性的影響外，性激素在血液尿酸的調節中也起著重要作用。研究發現，絕經前的健康女性血液尿酸水平在月經周期中存在顯著差異，卵泡期血液中尿酸水平最高，黃體期血液中尿酸水平下降[11]；同時，血液中E2與尿酸水平呈負相關[11-12]。然而，本研究結果顯示，HUA組大鼠血液中E2水平較N組無顯著差異。研究顯示，痛風女性的血液中FSH水平與尿酸水平呈正相關[12]。本研究結果顯示，HUA組大鼠血液中FSH水平較N組明顯增高，而當血液中尿酸水平恢復至正常水平后，HR組血液中FSH水平較HUA組進一步增高。這表明血液中FSH水平的增高與血液中高尿酸水平的關聯不是獨立的。因此，關于血液中FSH與尿酸之間的關系還有待進一步深入研究，以澄清與臨床發現不一致的情況。

在生理條件下，血液中尿酸是機體重要的抗氧化劑，可以清除體內的氧自由基，防止血管內皮細胞的氧化應激損傷[13]；但當血液中尿酸水平過高時，反而會促進氧化應激反應，造成機體損傷[14]。氧化應激可以激活多種轉錄因子，導致某些炎癥因子基因的差異表達[15]。研究表明，氧化應激反應是誘發子宮疾病的機制之一[16]，可促進子宮內膜異位癥及相關腫瘤的發展[17]。本研究結果顯示，HUA組大鼠較N組子宮組織中SOD、GSH水平顯著性降低，MDA水平增高，炎癥因子TNF-α表達增加；而血液中尿酸水平恢復至正常水平后，HR組大鼠子宮組織中以上指標均得以逆轉，提示血液中高尿酸水平導致了大鼠子宮出現氧化應激，并促進了炎癥發生，進而降低大鼠的生殖功能。

綜上所述，HUA可導致雌性大鼠子宮內膜變薄、卵泡數量減少，動情周期及性激素水平出現紊亂，進而影響排卵和受精卵著床；血液中高尿酸水平還會導致子宮出現氧化應激損傷，誘導子宮出現炎癥，從而降低大鼠生殖功能。本研究為后續的臨床研究提供了一定的數據參考。但關于血液中高尿酸水平導致氧化應激及炎癥因子產生之間的具體機制，還有待進一步深入探討。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗均已通過青島大學附屬醫院實驗動物福利倫理委員會的審核批準（文件號AHQU-MAL20220520）。所有實驗過程均遵照《實驗動物管理條例》的條例進行。

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