基于星型膠質細胞探討針刺治療缺血性腦卒中機制的研究進展

譚信哲,王東巖,董 旭,王若愚,韓沂曉,廖智超,王庚鑒,李東霞

1.黑龍江中醫藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱 150001

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke,CIS)又稱腦梗死,是由各種原因所致腦組織缺血缺氧性壞死,并伴隨神經功能缺損的疾病。目前CIS的治療方法包括急性期的神經保護、亞急性期的亞低溫治療和恢復期的干細胞治療[1]。星型膠質細胞(Astrocytes,AS)是中樞神經系統中數量最多的神經輔助細胞,與神經血管聯系密切,在CIS的各個階段發揮著重要作用。

正常生理情況下,AS處于靜息狀態,代謝及內分泌保持較低水平,而在腦缺血等病理狀態下,AS會被各種途徑激活,形成反應性星形膠質細胞(Reactive astrocytes,RAS)。RAS分泌及信號傳導能力大幅度增強,在保護神經元的同時也對神經系統造成損傷。2012年Zamanian J L等[2]通過細胞純化和基因表達分析,發現全身性脂多糖注射和大腦中動脈栓塞(MCAO)誘導兩種不同類型的RAS,現在分別稱為A1和A2型RAS。A1型RAS主要介導炎癥反應和產生神經毒性,加速神經系統損傷,A2型RAS能夠通過產生多種抗炎及神經保護因子,保護神經元免受缺血損害[3]。AS的活化表型并不是一成不變的,其表型受到細胞外刺激因素的影響以及相關治療方法的調控。A1、A2表型是對RAS功能的分類,促進AS向A2表型轉化是治療CIS的一個非常有潛力的研究方向。針刺治療具有多靶點、多途徑和多環節調節的特點,在卒中治療中應用廣泛。針刺能夠通過調控AS及其相關分子促進CIS損傷恢復,現將相關機制概述如下。

1 針刺對AS的整體調節

1.1 針刺對AS活化的影響

CIS發生后,適當的AS活化有利于神經損傷修復,但是過度活化會加重神經元損傷。目前研究多以膠原纖維酸性蛋白(GFAP)作為AS活化的標志物。GFAP是AS細胞骨架的主要組成成分,對維持AS形態及發揮各種功能具有重要作用。生理狀態下GFAP生成很少,在胞內或胞外會自發降解。在腦缺血等中樞性損傷情況下,GFAP會大量增殖。GFAP幾乎唯一存在于AS內,是AS活化的標志產物。研究表明,GFAP在CIS發生后呈現先增高后降低的趨勢,最高點在卒中發生1周后,而針刺能夠減輕GFAP的升高程度[4],表明針刺通過抑制GFAP合成抑制AS活化。STAT3是信號轉導子和轉錄激活子家族成員之一,可與GFAP啟動子位點結合,誘導酪氨酸快速磷酸化,促進AS活化增生。研究表明,針刺通過抑制GFAP/STAT信號通路抑制AS活化,減輕腦缺血損傷[5]。

1.2 針刺對AS增生的影響

通過計算梗死周圍區GFAP陽性細胞數,Han X等[6]得出結論,針刺具有促進AS增殖,但又抑制AS過度增殖的趨勢。由此推斷,針刺的治療作用可能是在CIS早期促進AS增殖,填補修復損傷神經元;在CIS后期抑制AS增生,減少膠質瘢痕的過度生成。

1.3 針刺對AS超微結構的影響

在缺血缺氧條件下,AS因自身基本生理活動無法維持,細胞會逐步走向死亡,超微結構表現為細胞腫脹、細胞器破壞與周圍組織連接破壞。針刺能夠保護AS超微結構的穩定,維持保護細胞結構的完整性。羅燕等[7]通過透射電鏡觀察缺血周圍區AS超微結構,結果顯示,針刺組AS腫脹程度較模型組輕,線粒體較豐富。董衛國等[8]制造大鼠右大腦中動脈閉塞模型,通過電鏡觀察AS結構,與對照組比較,針刺治療組AS細胞數目以及完整細胞器較多,與神經元和微血管的接觸較多,并且與AS接觸神經元的細胞器多。由此可見針刺有助于維護CIS中AS結構的穩定,保證AS對神經元的支持保護作用。

1.4 不同針刺參數對AS的影響

不同的針刺手法、刺激頻率以及施術時間對AS的影響不同。通過對比手針和電針對腦梗死大鼠AS的影響差異,葉曉雪[9]研究表明,手針與電針均能夠促進梗死大鼠神經功能的恢復,但是電針的治療效果更理想。通過比較不同電針頻率,Xiao Y等[10]得出結論,15 Hz和30 Hz電針頻率較100 Hz電針頻率治療CIS的效果更理想,更有利于維持AS結構的穩定性。Young-wook P等[11]把針刺治療組小鼠分為急性電針組(缺血后立即治療)、亞急性電針組(缺血后4 d治療)和延遲電針組(缺血后10 d開始治療),治療結果顯示,亞急性組的治療效果最好,更有利于卒中后功能恢復。

2 針刺治療CIS與AS相關機制

2.1 針刺促進神經再生與修復

CIS發生后,AS通過自身分泌以及促進相關細胞分泌神經營養因子及修復因子保護神經元,促進損傷神經元再生修復。神經生長因子(NGF)是具有神經元營養和促進突起生長雙重作用的神經營養因子。腦缺血發生時,RAS釋放NGF,提高神經元的存活率。NGF能夠促進軸突生長與突起的伸展,誘導神經干細胞(Neural stem cells,NSCs)轉化成神經元。研究表明[12],電針能夠抑制大鼠海馬區GFAP的表達,促進海馬區NGF的表達,改善高脂血癥合并大腦中動脈梗阻(MCAO)大鼠神經損傷。腦源性神經營養因子(BDNF)在腦缺血等神經元損害時可由AS、小膠質細胞(MC)等細胞分泌。BDNF能夠促進細胞存活、神經發生和突觸可塑性。研究表明[13],針刺能夠促進AS和MG產生、釋放BDNF和NGF,促進神經可塑性,治療缺血性中風后神經功能障礙。

膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)屬于轉化生長因子-β超家族的成員,在缺血性腦損傷中具有強大的神經保護作用。GDNF在腦缺血發生時的主要來源是RAS,針刺能夠促進AS內GDNF的合成,減輕大鼠腦缺血損傷。GDNF能夠促進NSCs的生成,研究表明[14]針刺通過促進GDNF和NSCs標志物巢蛋白(Nestin)表達,增加NSCs的增值分化能力,促進大鼠急性腦出血神經重塑。另有研究表明[15],電針對新生大鼠缺氧缺血性腦病的神經保護作用與GDNF及其受體RET介導的下游PI3K/AKT信號通路有關。

2.2 針刺調控興奮性氨基酸代謝

腦缺血后,腦組織會代償性產生大量興奮性氨基酸(主要為谷氨酸)來保持神經元興奮性。但是過量的興奮性氨基酸堆積會產生神經毒性,加快神經細胞損傷。AS能夠通過攝取過量興奮性氨基酸,維持細胞間隙正常氨基酸水平。AS主要表達兩種谷氨酸轉運體(EAATs),分別是EAAT1和EAAT2。其中腦組織中90%的谷氨酸被EAAT2攝取,EAAT2 起著“谷氨酸泵”的作用。針刺能夠促進 GFAP、EAAT2含量增長,促進谷氨酸代謝,發揮神經保護作用。Na+/K+-ATP酶通過調控細胞內外離子濃度為EAATs轉運谷氨酸提供電化學梯度,針刺能夠上調海馬Na+/K+-ATP酶和EAATs的表達,減少細胞外谷氨酸堆積,發揮抑制卒中后痙攣的作用[16]。N-myc下游調節基因2(NDRG2)作為一種與癌癥相關的基因,在腦缺血后神經細胞凋亡過程中起到促進作用,電針預處理通過抑制EAAT2的下調,逆轉NDRG2的上調,誘導腦缺血耐受[17]。

代謝性谷氨酸受體5(mGluR5)在RAS及活化MC內表達,在腦缺血發生過程中具有神經保護作用。AS上mGluR5的急性激活可以促進EAATs攝取突觸間隙的谷氨酸,減小谷氨酸對神經元的興奮性,減少神經元損傷。研究表明[18],針刺能夠減輕興奮性氨基酸神經毒性,其機制可能與針刺促進mGluR5的表達有關。

大麻素1型受體(CB1R)在神經元和AS內都有表達,AS表達的CB1R主要介導Ca2+信號傳遞以及調節AS谷氨酸的釋放。Yang C等[19]通過電針預處理MCAO模型小鼠,結果顯示電針治療后內源性大麻素水平增加,隨后激活AS的CB1R,導致細胞外谷氨酸的適度上調,保護神經元免受腦缺血損傷。Du J等[20]研究結果表明,電針預處理能夠促進ERK1/2的表達,且通過CB1R誘導大鼠腦缺血耐受。谷氨酸受體AMPAR中的GluR2亞基決定了的Ca2+通透性,缺血損傷后,GluR2蛋白表達下調,導致大量鈣離子進入神經元,使胞內Ca2+超載,造成神經元死亡。電針預處理通過提高大麻素CB1B水平促進下游GluR2分子的蛋白表達,誘導腦缺血耐受,發揮腦保護作用[21]。

大麻素2型受體(CB2R)在中樞神經系統中主要在AS和MC中表達,與活躍炎癥密切相關。研究表明[22],電針預處理可增強CB2R表達,抑制Ca2+內流,阻斷TLR4/NF-κB信號傳導,減輕脂多糖誘導的大鼠炎癥。

2.3 針刺調節能量代謝

生理情況下,神經元主要依靠葡萄糖供能,但在腦缺血等病理情況下,神經元也可以通過乳酸代謝供能。在葡萄糖和乳酸同時存在的情況下,神經元可能會優先利用乳酸,乳酸不僅能為神經元供能,還具有直接的神經保護作用。AS-神經元乳酸穿梭假說認為,大量興奮性氨基酸的攝入,激活AS內糖酵解,產生大量乳酸,AS和神經元通過細胞表面的單羧酸轉運體(MCTs)將乳酸轉運到神經元,為神經元所利用。AS主要表達MCT1和MCT4,神經元主要表達MCT2。電針治療能夠激活AS乳酸代謝,促進MCT1的表達,促進乳酸的轉運及利用,以維持神經元在腦缺血時的能量供應[23]。另有研究表明[24],針刺通過促進MCT2和MCT4的表達,減輕顱腦損傷后因能量代謝障礙引起的繼發性腦損傷。

2.4 針刺調控血管再生

促紅細胞生成素(EPO)是一種可刺激紅細胞生成的糖蛋白。在缺氧情況下EPO可以通過低氧誘導因子誘導其產生。近年研究發現EPO在中樞神經損傷中有重要保護作用。AS是中樞神經系統中產生EPO的主要場所。EPO對腦缺血損傷的保護作用主要集中在促進血管再生和抑制凋亡兩個方面。在血管新生方面,Wang L等[25]試驗證明,電針水溝可能通過激活EPO/Src/VEGF信號通路促進血管再生。王保國等[26]研究表明,針刺可通過上調EPO的表達,激活JAK2/STAT5信號通路促進下游VEGF表達,促進卒中后血管新生。在抑制細胞凋亡方面,Liu F等[27]研究表明,電針能夠促進EPO/JAK2/STAT5信號通路相關基因和蛋白表達,促進凋亡抑制基因Bcl-2表達,抑制凋亡促進基因Bax表達,發揮神經保護作用。

內皮素-1(ET-1)被認為是由血管內皮細胞分泌的具有收縮血管性質的血管活性物質。腦缺血時,活化的AS也能夠產生大量ET-1,通過JAK/STAT3途徑促進神經祖細胞向AS分化[28]。針刺能夠通過抑制腦缺血后ET-1的升高,調節腦血流狀態,減少腦缺血損傷。

2.5 針刺減輕氧化反應

腦缺血后的氧化損傷主要表現為兩個方面:缺血發生時的自由基損傷和血流再灌注時的活性氧損傷。中樞神經系統能夠通過產生抗氧化分子抑制氧化反應的發生,與AS密切相關的是以谷胱甘肽(GSH、GSSG)為核心的谷胱甘肽抗氧化系統。AS能夠促進GSH的生成,為神經元提供氧化底物,AS相對于神經元能夠釋放更多的還原輔酶Ⅱ(NADPH),NADPH能夠催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)轉化為還原型谷胱甘肽(GSH)。AS還能為神經元提供合成GSH的前體,如谷氨酰胺、半胱氨酸和胱氨酸,表達谷氨酸脫羧酶的AS表現出更高的GSH含量。研究發現[29],腦缺后腦組織中GSH的含量下降,GSSG含量升高,GSH/GSSG比例降低,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性顯著降低;針刺能夠使已降低的GSH升高、已升高的GSSH降低,提高GSH/GSSH比值,升高GSH-PX活性。表明針刺通過對谷胱甘肽抗氧化系統的整體調整,促進GSH的生成進而減輕腦缺血損傷。蔡媧等[30]研究表明,針刺能夠增加GSH生成,降低氧化產物丙二醛水平,減輕氧化應激損傷,發揮神經保護作用。

2.6 針刺抑制AS相關的炎癥反應

腦缺血后發生的炎癥反應,表現為雙重作用,一方面大量炎癥因子的產生及炎性細胞的聚集會加重神經細胞損傷;另一方面炎癥反應可以促進損傷修復。MC作為神經系統中的炎性細胞,在調控炎癥反應方面發揮了重要作用。近些年發現AS也參與中樞神經系統的炎癥反應,AS和MC通過“AS-MC串擾”調節細胞表型轉化促進或者抑制炎癥反應的發生[31]。AS在CIS后的炎癥反應中發揮了重要作用。AS可通過產生TNF-α、IL-1等炎癥因子,促進炎癥反應發生,也可以分泌TGF-β、IL-10等抑炎因子抑制炎癥反應。

細胞間黏附分子-1(ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員,通過促進免疫細胞與組織之間的吸附,加速炎癥反應發生。腦缺血時ICAM-1可以被TNF-α、IL-1β、INF等炎癥因子誘導生成。NF-κB是一種重要的轉錄分子,能夠促進炎癥因子釋放。腦缺血發生時AS大量增殖并表達ICAM-1和NF-κB,促進炎癥反應。研究表明[32]“醒腦開竅”針法能夠通過抑制炎癥介質ICAM-1和MMP9的產生,發揮腦保護作用。另有研究表明[33]針刺能夠通過抑制IL-6、TBF-α的表達以及抑制ICAM-1和血管細胞黏附分子-1的表達抑制腦出血后的炎癥反應。

S100B蛋白屬于鈣結合蛋白S100家族。中樞神經系統中S100B蛋白廣泛存在于神經膠質細胞中,可作為AS的標志物[34]。AS釋放S100B蛋白與晚期糖化終產物受體(RAGE)相互結合,促進MAPK信號通路及其下游NF-κB信號通路的活化,促進炎癥反應的發生。針刺能夠下調AS的S100B蛋白表達,減少S100B蛋白與RAGE的結合從而減輕相關炎癥反應[35]。

白細胞介素33(IL-33)屬于IL-1家族成員,通過與輔助型T細胞2(Th2)上的ST2受體結合而發揮作用。IL-33能夠促進T細胞向Th2型轉變以及巨噬細胞(小膠質細胞)從M1型向M2型轉化。而Th2和M2型MC都具有抑制炎癥作用。研究表明,電針能夠通過促進IL-33/ST2軸的激活,抑制AS和MC的活化,減輕大腦炎癥反應,發揮了神經保護作用[36]。

三磷酸腺苷(ATP)作為細胞內的主要能源物質,在腦缺血發生后,由損傷神經元和膠質細胞釋放到細胞外,細胞外ATP的升高會誘發一系列炎癥反應發生。嘌呤受體作為ATP及其代謝產物二磷酸腺苷(ADP)的主要受體,在介導炎癥反應方面發揮了重要作用。游小芳[37]通過免疫熒光雙標法,觀察嘌呤受體P2X7R和P2Y1R分別與AS標志物GFAP和MC標志物ED1共定位情況,結果表明,腦缺血促進嘌呤受體的表達及AS和MC的活化,針刺能抑制其表達和活化,針刺通過抑制P2X7R和P2Y1R的表達抑制炎癥反應。

2.7 針刺對細胞通訊的調節

縫隙連接蛋白(CXs)是組成縫隙連接通道或半通道的細胞膜蛋白。半通道主要進行細胞與細胞外環境之間的信息交流,縫隙連接通道由相鄰細胞膜之間的半通道組成,進行細胞間的信息交流。生理情況下,縫隙連接處于開放狀態,半通道處于關閉狀態。腦缺血損傷時會促進半通道的開放,致使細胞內外離子平衡破壞,加速細胞死亡。

CX43是AS縫隙連接的主要蛋白。Cx43可能通過促進細胞凋亡和線粒體自噬影響神經元的存活。針刺可以阻斷Cx43的過表達,減輕腦神經元缺血再關注損傷。研究表明[38],針刺可以通過抑制mGluR5和P38MAPK mRNA的表達,調節 Cx43半通道的通透性,減輕腦缺血損傷。Cx43半通道是Ca2+進入細胞的重要途徑,而細胞內Ca2+紊亂是腦缺血損傷的重要原因之一。研究表明[39],針刺能夠通過抑制半通道的開放抑制細胞內鈣超載,減少腦損傷。

2.8 針刺抑制腦水腫

水通道蛋白家族(AQPs)是一類主要負責水和小分子物質跨膜轉運的膜蛋白。APQ4是該家族在中樞神經系統的主要成員,在AS大量表達。AS足突包繞血管,與血管內皮細胞、周細胞及神經元等共同組成神經血管單元(NVU),NVU作為一個完整的功能單位,在針刺治療CIS中具有重要作用。AQP4在腦缺血時表達增多,是導致腦水腫的重要原因,針刺通過抑制AQP4表達,減輕腦水腫的發生。頭針治療可通過抑制V1AR/CaMK2/AQP4信號通路抑制CIS腦水腫[40]。AS中表達的另一種AQPs為AQP9,與腦水腫的發生密切相關。研究表明,針刺能夠抑制AQP9的表達,減輕腦水腫的發生[41]。

2.9 針刺促進神經干細胞分化

NSCs是神經系統中能夠自我更新并具多向分化潛能的細胞。成年人腦中NSCs主要存在兩個區域,一個是側腦室室管膜下區(SVZ),另一個是海馬齒狀回。腦缺血能夠激活NSCs向神經元或膠質細胞分化。AS可能在NSCs增殖過程中起到促進或中介作用。研究表明[42],腦缺血后大鼠SVZ區GFAP表達增加,針刺治療后GFAP進一步增加,提示AS的活化可能與NSCs在此處的增殖密切相關。同樣,在對腦缺血大鼠海馬齒狀回的研究[43]表明,針刺能夠通過調節AS活化促進神經發生及神經細胞的修復。

CIS發生后,部分RAS具有干細胞潛能,能夠往神經元方向分化。通過熒光雙標法分別用GFAP和神經元特異性烯醇化酶(NSE)標記大鼠海馬AS和神經元,觀察不同組別各時間點被標記細胞數量差異,結果顯示,針刺治療組較模型組GFAP和NSE雙標細胞數量增多,NSE單標細胞數量增多,提示針刺可能促進RAS向神經元轉化[44]。

巢蛋白(Nestin)屬于中間絲蛋白,常作為NSCs的標志物。在RAS中發現有大量巢蛋白表達,進一步提示RAS可能具有多分化潛能。研究表明[45]針康治療能夠促進腦缺血大鼠巢蛋白的表達,促進NSCs增生。

波形蛋白(Vimentin)屬于膠質細胞中間絲的成分之一,一般在胚胎期表達,出生后會很快被GFAP替代。波形蛋白也常作為NSCs的標志之一。近年研究發現,波形蛋白在腦損傷周圍組織出現,Vimentin陽性表達與NSCs和RAS密切相關。研究表明[46],針刺治療能夠明顯促進缺血皮質和紋狀體Vimentin陽性細胞表達,改善大鼠神經功能缺損。Tao J等[47]研究表明,針刺曲池和足三里能夠促缺血再灌注大鼠紋狀體中GFAP/Nestin/Vimentin共標記陽性RAS的增殖,發揮中樞神經保護作用。

2.10 針刺抑制膠質瘢痕過度生成

腦缺血發生后,伴隨AS活化,缺血周圍區AS大量激活,膠質再生活躍,增生的神經膠質一方面能夠抑制炎癥擴散,減輕腦水腫及組織損傷,另一方面過度增生的神經膠質形成膠質瘢痕,抑制神經元的軸突再生,阻礙神經功能修復。硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)是一組以共價結合硫酸軟骨素的蛋白質,屬于細胞外基質分子家族成員。CSPGs是構成神經膠質瘢痕的重要成分,在中樞神經受損傷時,主要由AS生成。CSPGs通過抑制軸突伸展和側枝萌發以及抑制層粘連蛋白的促軸突生長功能限制受損神經修復[48]。電針通過抑制CSPGs如神經蛋白聚糖和磷酸肌酸蛋白聚糖抑制膠質瘢痕的生成減輕腦缺血再灌注損傷[49]。

3 小結

AS作為中樞神經系統中具有廣泛細胞組織聯系與多功能的神經輔助細胞,在CIS發生發展過程中發揮了重要作用。針刺在CIS中對AS的整體調控表現在:抑制AS活化、促進AS增殖與抑制AS過度增生,有利于AS超微結構的穩定性。針刺治療通過多途徑雙向調節AS相關機能,促進神經再生與修復、調控興奮性氨基酸代謝、調節能量代謝、調控血管再生、抑制氧化及炎癥反應、調節細胞通訊、抑制腦水腫、促進神經干細胞分化及抑制膠質瘢痕的過度生成等途徑促進CIS損傷修復。

A1、A2型AS雖然已經提出,但是在腦缺血缺氧情況下對于單一表型的研究相對較少。在針刺刺激下的AS表型轉化及相關物質代謝改變缺少詳細研究。AS在腦缺血缺氧時的改變是一個動態的過程,對于不同時間階段腦內AS相關物質代謝改變還不夠確切,如果能夠判別在不同時間階段AS內代謝變化,選取最合適的干預時間及干預手段,誘導AS表型向著有利于疾病恢復的方向發展,將會是一個非常有價值的研究方向。針刺治療的不同干預時間、干預方式以及不同的刺激參數對于疾病的影響也存在差異,針灸治療腦卒中療效顯著并且有許多可以深入發掘的方向,希望隨著研究的深入,未來會有更多研究出現,針刺治療的干預方式會變得更加可控,針刺治療療效也會得到相應的提高。