基于“腦心同治”探討電針不同介入時間對創(chuàng)傷性腦損傷后認知障礙的影響

郭文慧,張 衛(wèi),鄭淑美,苑鴻雯,張 璐,王天琪,崔學(xué)慧,崔 海△,杜若桑△

1.首都醫(yī)科大學(xué),北京 100069;2.宣武中醫(yī)醫(yī)院,北京 100050

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury,TBI)是由外力所導(dǎo)致的一種后天性腦損傷,可能導(dǎo)致腦功能暫時或永久性的傷害[1]。目前全世界TBI的發(fā)病率約為5 000萬例/年,造成的經(jīng)濟損失約為4 000億美元,約占世界生產(chǎn)總值的0.5%[2]。TBI的發(fā)病機制是一個復(fù)雜的過程,主要可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷[3]。原發(fā)性損傷與大腦受到的原發(fā)性外部撞擊直接相關(guān),而繼發(fā)性腦損傷可在原發(fā)性撞擊發(fā)生后數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)發(fā)生,出現(xiàn)炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元死亡、小膠質(zhì)細胞的激活以及自由基釋放等病理變化,會進一步加劇腦組織損傷[4]。

炎癥反應(yīng)被證實與認知障礙之間存在極其密切的關(guān)系,后者是TBI最常見的后遺癥之一[5],不同損傷程度的TBI會引起長、短期認知障礙,不僅嚴重影響患者的生活質(zhì)量,同時也阻礙患者的早期康復(fù)[6]。有研究顯示通過抑制腦組織內(nèi)神經(jīng)炎癥,可減輕大鼠認知障礙,增強學(xué)習(xí)記憶能力,改善神經(jīng)功能損傷[7]。而促炎因子IL-1β、IL-18表達水平的高低,對于檢測TBI后認知功能損傷程度具有一定的導(dǎo)向作用。針刺作為中醫(yī)重要組成部分,廣泛應(yīng)用于TBI后認知障礙、意識障礙與肢體活動障礙等癥狀[8]。亦有諸多研究關(guān)注針刺的起效機制,針刺可通過抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)、促進神經(jīng)修復(fù)、抗氧化、抑制細胞內(nèi)鈣超載、調(diào)節(jié)細胞能量代謝、改善腦循環(huán)及抑制細胞凋亡等多途徑治療TBI[9]。

根據(jù)中醫(yī)理論,心腦均與神志相關(guān),正如張錫純所言:“神明之功用,原心與腦相輔相成”“神明之體藏于腦,神明之用發(fā)于心”。腦為髓海,主精神意識和感覺運動。心藏神,總統(tǒng)魂魄《素問·靈蘭秘典論》云:“心者,君主之官,神明出焉”,TBI后認知障礙的發(fā)生與心腦密切相關(guān),治療宜從調(diào)理腦心功能、腦心同治入手。

課題組前期研究結(jié)果表明2/100 Hz疏密波電流下的電針治療能夠更加有效地緩解TBI大鼠的神經(jīng)炎癥,同時也能有效地提高大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力[10],但是其針對TBI后認知障礙的最佳干預(yù)時間仍未確定。基于此,本研究采用“腦心同治”針刺法,利用大鼠TBI模型,通過觀察炎癥反應(yīng)進一步探討不同介入時間點對TBI后認知障礙的療效差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用7～8周齡SPF級雄性SD大鼠80只,體質(zhì)量280～320 g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可SCXK(京)2016-003]提供,于首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心SPF級國家標準實驗室[SYXK(京)2018-0003]分籠飼養(yǎng),每籠3只。飼養(yǎng)溫度(22±3)℃,濕度40%～50%,12 h/12 h晝夜周期,均可自由攝食、飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。動物造模以及實驗研究過程嚴格遵守動物福利倫理原則,本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準通過(批號:AEEI-2023-043)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 β-actin單克隆抗體(Abcam,貨號:ab8227);IL-18兔源一抗(Proteintech,貨號:10663-1-AP);IL-1β兔源一抗(Abcam,貨號:ab283818);彩虹預(yù)染蛋白Maker(蘇州新賽美生物科技有限公司,貨號:P9006);HPR-山羊抗兔IgG(Proteintech,貨號:SA00001-2);594-山羊抗兔IgG(Abcam,貨號:ab150080);FJB染液(Merck Life Sciences,貨號:AG310)。

1.2.2 儀器 精密顱腦損傷撞擊器PCI3000(美國Hatteras instruments公司);68025型腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命技術(shù)有限公司);華佗牌一次性無菌針灸針(0.3 mm×13 mm,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);電泳、電轉(zhuǎn)儀套裝(美國加利福尼亞州Bio-Rad);化學(xué)發(fā)光、凝膠成像系統(tǒng)(美國加利福尼亞州Bio-Rad)。

1.3 造模方法

采用隨機數(shù)字方法將80只SPF級雄性SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、模型組、電針1組、電針2組與電針3組,每組均為16只。

除假手術(shù)組外,其余4組大鼠利用PCI3000制備TBI模型。本實驗全過程均采用異氟烷吸入麻醉法,3%異氟烷誘導(dǎo)大鼠麻醉后調(diào)為2%用以維持,大鼠頭部備皮俯臥于腦立體定位儀上。沿大鼠矢狀縫切一條長約1.5 cm的切口,使大鼠的前囟能完整暴露,以前囟右旁開約2.5 mm、后1.5 mm處為圓心,用微型手持式顱鉆鉆取直徑大約為6.0 mm的孔,打開骨窗并保持硬腦膜完整。除假手術(shù)組外其余組均用PCI3000進行撞擊(撞擊參數(shù)為撞擊頭直徑:4.0 mm;打擊速度:4 m/s;打擊深度:2.5 mm;停留時間:100 ms),撞擊完后清理創(chuàng)口,還納骨窗并用組織膠水封閉,隨后縫合傷口。

1.4 干預(yù)方法

電針1組、電針2組以及電針3組分別在造模結(jié)束后即刻、造模結(jié)束后第3天以及造模結(jié)束后第7天開始電針干預(yù)。所有電針組取穴均為“水溝”(DU26)、雙側(cè)“風(fēng)池”(GB20)和雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”(PC6),穴位定位及選取參照華興邦等制定的《實驗動物常用穴位名稱與定位》[11]。操作:2%異氟烷麻醉大鼠后俯臥位固定,向上斜刺水溝約1 mm,捻轉(zhuǎn)10 s后出針不留針;內(nèi)關(guān)直刺約2 mm,風(fēng)池斜刺3 mm;風(fēng)池、內(nèi)關(guān)兩穴行平補平瀉手法后連接電針儀。電針參數(shù)采用疏密波,頻率2/100 Hz,電流強度以大鼠身體輕微抖動為度,留針15 min,1次/d,連續(xù)針刺14 d。干預(yù)期間假手術(shù)組與模型組只麻醉不進行針刺干預(yù)。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 在大鼠造模結(jié)束后1 d、14 d以及21 d采用神經(jīng)功能評分表(modified neurological severity scores,mNSS)對各組的神經(jīng)功能缺損情況進行評價[12],綜合評價大鼠運動(肌肉狀態(tài)以及異常動作)、感覺(如視覺、觸覺及平衡覺等)以及反射反應(yīng)。測試得分越高則表示大鼠的神經(jīng)損傷功能損傷程度越嚴重,本測試滿分為18分。

1.5.2 新物體識別實驗 于造模后21 d對大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能進行評估,實驗持續(xù)3 d。第1天將大鼠放置于一個空曠的鐵皮箱中,進行時長5 min的環(huán)境適應(yīng)訓(xùn)練。第2天在箱子中放置兩個大小、質(zhì)地和顏色一樣的物體,讓大鼠進行時長為5 min的探索;訓(xùn)練后1.5 h進行短期記憶保留訓(xùn)練,訓(xùn)練時長為5 min,訓(xùn)練過程中將兩個物體中的一個替換成另外一個顏色、質(zhì)地一樣但是形狀不一樣的新物體,訓(xùn)練并分別記錄大鼠探索新舊物體的時間。24 h后進行長期記憶保留訓(xùn)練,再次將兩個舊物體中的一個替換成一個顏色、質(zhì)地一樣但形狀不同的新物體,其他不變,訓(xùn)練并記錄大鼠探索新舊物體的時間。最后分別計算短期記憶保留試驗以及長期記憶保留試驗中各組大鼠的新物體探索時間比:(探索新物體時間/總探索時間)×100以及對新舊物體的偏好指數(shù):(探索新物體時間-探索舊物體時間)/總探索時間[13]。

1.5.3 水迷宮實驗 于造模后第28天進行定位航行實驗和空間探索試驗,分別對大鼠的學(xué)習(xí)記憶以及空間定位功能進行評估。定位航行實驗:水迷宮實驗前4 d,將大鼠面朝池壁,順時針分別從4個不同的象限下水,平臺固定于第2象限,取大鼠在除平臺所在象限外其他3個象限尋找平臺所花費的時間的平均值作為衡量空間學(xué)習(xí)能力的指標。空間探索實驗:水迷宮實驗第5天撤去平臺,將大鼠放入水池并記錄2 min,記錄大鼠穿越原平臺的次數(shù),用以衡量大鼠空間記憶能力。

水迷宮試驗結(jié)束后每組隨機選取8只大鼠進行灌注取腦,將大腦浸泡于4%多聚甲醛中24 h,隨后進行石蠟包埋、制作切片用于FJB染色、HE染色和后續(xù)免疫熒光試驗。各組剩余8只大鼠經(jīng)異氟烷麻醉后,快速取出大腦,剝離損傷灶周圍皮層組織用于Western blot檢測。

1.5.4 Fluoro-jade B染色 采用FJB染色法檢測大鼠患側(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元細胞退行性變異情況。腦切片經(jīng)脫石蠟、復(fù)水后,用梯度環(huán)保脫蠟液脫蠟,再用梯度乙醇脫水,最后用蒸餾水洗滌,然后滴加FJB工作液,50%冰醋酸為溶劑,按1∶400配制FJB工作液,稀釋FJB綠色熒光探針,4 ℃過夜。DAPI染核8 min,最后用蒸餾水沖洗。切片晾干后,經(jīng)二甲苯洗滌,最后封片。染色圖像在直立熒光顯微鏡(Nikon,日本)下觀察和拍攝,放大倍數(shù)為400×,使用Image-pro plus 7.0軟件測量和計數(shù)陽性細胞。

1.5.5 HE染色法觀察大鼠損傷側(cè)大腦海馬區(qū)腦組織形態(tài)學(xué)變化 將腦組織浸泡在4%多聚甲醛(4 ℃)中24 h,然后用石蠟包埋組織,用顯微切割機將石蠟包埋的組織切成5 μm厚的切片。切片用二甲苯脫蠟,再用梯度乙醇(100%～75%)脫水。用雙蒸水沖洗后,將切片放入蘇木精溶液中浸泡3～5 min,然后用曙紅溶液染色5 min。最后用中性樹膠裝片。HE染色圖像由計算機輔助圖像分析系統(tǒng)捕獲,該系統(tǒng)由放大倍率為400×的顯微鏡組成。

1.5.6 Western blot法檢測大鼠損傷側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18蛋白表達 取50 g大鼠右側(cè)大腦皮層,用RIPA裂解液提取其蛋白,使用BCA法檢測蛋白濃度,取上清液加入5×SDS-PAGEA蛋白上樣緩沖液和PBS制成樣本儲存液。將樣本加入電泳槽中進行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉,隨后分別加入IL-1β一抗(1∶1 000)、IL-18(1∶8 000)和β-actin(1∶1 000),4 ℃慢搖過夜,次日洗膜后加入山羊抗兔IgG室溫孵育1 h(1∶20 000),加入增強化學(xué)發(fā)光顯影。Image J軟件計算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參灰度值的比值,作為目的蛋白的最終表達水平。

1.5.7 免疫熒光法檢測大鼠損傷側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18陽性表達 取5 μm腦切片后經(jīng)二甲苯脫蠟,無水乙醇等修復(fù)抗原。羊血清封閉,滴入一抗IL-1β(1∶50)抗體或IL-18(1∶200)抗體,放入染色暗盒中,孵育過夜,隨后加入稀釋過的FITC的羊抗兔二抗(1∶100)IgG。孵育1 h后,染核封片,熒光顯微鏡(200×)觀察染色結(jié)果并拍照分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

各組大鼠造模后1 d、14 d及21 d神經(jīng)功能缺損情況見表1。造模后1 d,除假手術(shù)組外,各組評分均呈上升趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠mNSS神經(jīng)損傷功能評分比較

造模后第14天及第21天mNSS評分結(jié)果顯示各組大鼠得分均有所下降,但模型組評分明顯高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,各電針組評分均明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組得分最低。見表1。

2.2 各組大鼠海馬組織形態(tài)比較

應(yīng)用FJB染色和HE染色觀察腦組織病理改變,首先,筆者團隊采用FJB染色法對TBI大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞退行性變異情況進行檢測,見圖1。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬區(qū)的FJB陽性細胞數(shù)量明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),經(jīng)過電針治療后,各電針組海馬區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量較模型組有所減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且電針1組與假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

注:綠色熒光染色代表腦組織中神經(jīng)元壞死細胞,尺標長度=50 m。圖1 FJB染色結(jié)果

表2 各組大鼠FJB相對表達水平比較

此外,在HE染色中假手術(shù)組大鼠右側(cè)大腦海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)清晰完整,形態(tài)正常,顏色淡染均勻,未見病理損傷灶;而與假手術(shù)組比較,模型組大鼠大腦右側(cè)海馬區(qū)有明顯的病理改變,主要表現(xiàn)為右側(cè)海馬區(qū)組織結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)細胞數(shù)量減少,細胞核皺縮坍塌,或有空泡樣改變。與模型組比較,電針1組、電針2組和電針3組大鼠右側(cè)大腦海馬區(qū)腦組織病變程度有所改善,主要表現(xiàn)為神經(jīng)細胞數(shù)量增多、細胞核皺縮坍塌以及空泡樣改變減少,且與其他電針組比較,電針1組的改善情況更趨近于假手術(shù)組。結(jié)果顯示,電針治療可以減輕TBI后海馬區(qū)的病理改變,且干預(yù)時間越早,療效越顯著。見圖2。

圖2 各組大鼠右側(cè)大腦海馬區(qū)HE染色結(jié)果(標尺=200 m)

2.3 各組大鼠新物體識別實驗比較

新物體識別實驗在造模后第21天進行,結(jié)果見表3,分析各組大鼠短期記憶訓(xùn)練中對新物體探索時間比以及偏好指數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在探索時間比中,與假手術(shù)組比較,模型組探索時間比值較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)過電針治療后電針組探索時間比值均有所提升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在短期記憶訓(xùn)練的偏好指數(shù)測試中,與假手術(shù)組比較,模型組的偏好指數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),電針1組與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,電針1組的偏好指數(shù)略高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);電針2組、電針3組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠新物體識別實驗記憶偏好指數(shù)及探索時間比統(tǒng)計比較

短期記憶訓(xùn)練結(jié)束后24 h對各組大鼠進行長期記憶訓(xùn)練,結(jié)果顯示在探索時間比中,與假手術(shù)組比較,模型組探索比比值顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較電針組的探索比比值均較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且3個電針組與假手術(shù)組比較,結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);但相比之下電針1組的比值略高于電針2組以及電針3組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在長期記憶訓(xùn)練的偏好指數(shù)測試中,模型組的偏好指數(shù)明顯低于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,電針組的偏好指數(shù)均有所回升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且電針1組與假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較

水迷宮實驗在造模后第28天開始,包括定位航行試驗以及空間探索實驗。在定位航行實驗中,筆者團隊對各組大鼠逃避潛伏期進行比較分析后發(fā)現(xiàn),隨著訓(xùn)練日期增加,各組大鼠尋找平臺的逃避潛伏時長均明顯減少。各組大鼠水迷宮實驗前4 d逃避潛伏期分析結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組逃避潛伏期時長明顯延長,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而經(jīng)過電針治療后,各電針組的逃避潛伏時長較模型組均明顯縮短,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組逃避潛伏期時長與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠水迷宮前4 d尋找平臺潛伏期時長

表4 各組大鼠水迷宮1～4 d潛伏期時長比較

在空間探索實驗中對撤除平臺后各組大鼠穿越原平臺次數(shù)進行分析比較發(fā)現(xiàn):與假手術(shù)組比較,模型組穿越平臺的次數(shù)明顯減少(P<0.01);與模型組比較,電針1組、電針2組和電針3組穿越平臺的次數(shù)均增加(P<0.05);電針1組與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠水迷宮實驗最后1 d穿越平臺次數(shù)比較

比較分析各組大鼠水迷宮實驗第1天以及第4天從同一下水點下水后的游泳軌跡圖,結(jié)果顯示,隨著訓(xùn)練日期的增加,各組大鼠尋找平臺的時間以及路徑均有所縮短,較之于其他組,假手術(shù)以及電針1組大鼠尋找平臺的軌跡更為清晰明確,花費的時間最短,見圖4。這些研究結(jié)果表明,電針治療能夠有效改善TBI后學(xué)習(xí)與記憶能力,其改善程度與電針干預(yù)時間的早晚密切相關(guān)。

圖4 各組鼠水迷宮第1 d和第4 d游泳軌跡代表圖

2.5 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-18蛋白表達比較

Western blot結(jié)果見圖5,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果見表6,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18的表達明顯上升,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,經(jīng)過電針治療后電針1組、電針2組和電針3組IL-1β、IL-18的蛋白表達均有所下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且電針1組IL-1β、IL-18表達和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖5 各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18蛋白水平

表6 各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18蛋白表達結(jié)果

2.6 各組大鼠腦組織中IL-1β、IL-18陽性表達比較

筆者團隊通過免疫熒光檢測各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β、IL-18表達情況,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠患側(cè)大腦皮層中IL-1β、IL-18的分布均顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,經(jīng)過電針治療后各電針組IL-1β、IL-18的分布有所減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中電針1組下降的更為明顯,值得注意的是,電針1組與假手術(shù)組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明,電針治療能夠有效抑制促炎因子的表達,有助于緩解TBI大鼠神經(jīng)炎癥。見圖6、表7。

注:a.各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-1β分布情況;b.各組大鼠患側(cè)大腦皮層IL-18分布情況。紅色熒光表示各蛋白陽性表達,藍色熒光表示細胞核,標尺=20 m。圖6 免疫熒光染色結(jié)果

表7 各組大鼠右側(cè)大腦患側(cè)皮層IL-1β、IL-18分布結(jié)果

3 討論

TBI是全世界導(dǎo)致年輕群體發(fā)病和死亡的主要原因之一,對患者的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重的影響。據(jù)報道,TBI后損傷涉及大腦皮質(zhì)的額葉、顳葉、頂葉、枕葉以及海馬等多個區(qū)域,會對患者的執(zhí)行功能、前瞻性記憶功能、延遲記憶功能、命名、注意力與定向力等方面造成嚴重影響,最終導(dǎo)致認知障礙[14]。本研究結(jié)果顯示TBI模型大鼠均存在神經(jīng)功能缺損、學(xué)習(xí)與記憶功能減退現(xiàn)象,且TBI大鼠海馬組織出現(xiàn)神經(jīng)元細胞數(shù)量減少、大量神經(jīng)元細胞出現(xiàn)退行性變異等病理變化,腦組織中促炎因子IL-1β、IL-18表達水平顯著上升。電針“內(nèi)關(guān)”“風(fēng)池”“水溝”可以降低TBI大鼠mNSS神經(jīng)功能評分,提高其學(xué)習(xí)與記憶能力,減輕腦組織病理變化情況,抑制神經(jīng)炎癥,這與既往相關(guān)研究結(jié)果一致[15-18]。既往研究結(jié)果表明TBI是神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展的重要風(fēng)險因素之一,其繼發(fā)的認知障礙作為該疾病的常見臨床癥狀在過去幾十年中受到的關(guān)注日益增多。然而,TBI后認知障礙發(fā)生發(fā)展的具體分子機制還未明晰[19]。因此,迫切地需要找到更加有效的治療策略來緩解這一疾病的發(fā)展。筆者團隊的研究結(jié)果表明,電針治療可以改善TBI大鼠的認知障礙水平,其部分原因是通過對神經(jīng)炎癥的抑制作用,且據(jù)結(jié)果推測,越早干預(yù)對疾病的改善程度越明顯。

從中醫(yī)角度分析,TBI后認知障礙多屬于中醫(yī)學(xué)的“呆病”“健忘”“善忘”等范疇[20],有學(xué)者[15]認為,頭為諸陽之會,內(nèi)涵腦髓,一旦損傷則腦髓震動,瘀阻清竅,清陽濁陰升降失調(diào)而發(fā)為健忘癡呆等。由此可見TBI后認知障礙的發(fā)生與腦密切相關(guān)。《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載:“人始生,先成精,精成而腦髓生”“頭者,精明之府,頭傾視深,精神將奪矣”,闡明腦與人體精神活動發(fā)生發(fā)展密不可分[21],同時《黃帝內(nèi)經(jīng)》中還有記載:“心者,君主之官,神明出焉”“神氣舍心,魂魄并具,乃成為人”,心與神志密不可分[22]。后世醫(yī)家張錫純在《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中提出:“人之神明,原在心與腦兩處”,由此可知人的精神意識思維皆與心、腦密不可分。目前也有學(xué)者提倡腦心同調(diào)治療神志、認知等疾病。腦心同治法對于疾病的臨床治療具有極大的指導(dǎo)意義,如魏寶鈺[23]運用清腦益智方,通過心腦同治法探討其改善血管性癡呆大鼠腦血流量的相關(guān)機制,結(jié)果顯示,清腦益智方能夠激活腦微血管內(nèi)皮細胞中AMPK/eNOS信號通路而促進NO的合成,同時舒張腦微血管和改善心功能,從而增加血管性癡呆大鼠的腦血流量,改善其認知功能。李潔等[24]在腦心同治治療思路下,選用內(nèi)關(guān)、水溝與神門等穴位聯(lián)合利培酮治療精神分裂癥患者,結(jié)果顯示其具有改善患者注意力、語言能力、記憶力、視空間及執(zhí)行能力等認知方面的優(yōu)勢作用,卓佳兵等[25]通過心腦同治針刺法結(jié)合認知康復(fù)訓(xùn)練,顯著改善了腦梗死患者的認知能力。本研究選取風(fēng)池、水溝和內(nèi)關(guān)3個穴位,其中“風(fēng)池”穴位于腦后部,是足少陽膽經(jīng)的腧穴,該穴具有補腦益智、醒腦開竅的作用[26];“水溝”屬督脈,督脈“入屬于腦”,此穴是醒腦開竅針刺法的主穴之一,具有開竅啟閉、醒腦神調(diào)臟腑的作用;“內(nèi)關(guān)”穴為手少陰心包經(jīng)之絡(luò)穴,心包經(jīng)代心受邪,針刺此穴可起到滋養(yǎng)心神、疏通氣血的作用。內(nèi)關(guān)穴其下有正中神經(jīng),而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中正中神經(jīng)電刺激可起到治療意識和認知障礙的作用,從側(cè)面為內(nèi)關(guān)治療認知和意識障礙提供了科學(xué)性依據(jù)。本實驗選用的風(fēng)池穴、內(nèi)關(guān)穴及水溝穴,通過調(diào)理心或腦的功能,腦心同治,共奏醒腦開竅、調(diào)神益智之功效,對TBI后認知障礙起到改善作用[27-28]。

根據(jù)既往的實驗及臨床結(jié)果顯示,介入時間點是針刺療效的決定性因素之一,目前臨床上應(yīng)用針刺治療創(chuàng)傷性腦損傷、腦卒中等腦病多在恢復(fù)期,確定發(fā)病早期針灸治療的有效性將擴大臨床上針灸的干預(yù)窗口期。已有研究者發(fā)現(xiàn)早期針刺介入能更好地改善腦卒中患者的臨床癥狀,他們推測發(fā)病6～48 h是針刺介入腦卒中的最佳時期[29-30]。劉勇等[31]為研究針刺介入時機對缺血性中風(fēng)大鼠腦組織神經(jīng)細胞中特異性磷酸酶(PTEN)、高磷酸化蛋白激酶(p-AKT)以及磷酸化糖原合酶激酶(p-GSK3)表達的影響,分別在造模后2 h、72 h以及168 h進行針刺。結(jié)果顯示造模后2 h進行針刺治療能夠更好地抑制缺血性中風(fēng)大鼠腦組織神經(jīng)細胞細胞凋亡,保護和修復(fù)受損神經(jīng)元細胞,療效較好。課題組前期研究表明造模后即刻開始針刺能降低大鼠血清(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)GFAP和S-100B蛋白水平,還可提高TBI大鼠腦內(nèi)GLT-1 mRNA的表達,抑制谷氨酸興奮毒性,減輕神經(jīng)炎癥,降低細胞凋亡,從而減輕腦損傷,明顯減輕大鼠腦損傷的程度[27,32],但仍缺乏關(guān)于電針不同介入時間對創(chuàng)傷性腦損傷后認知障礙影響的研究。本研究經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)造模后即刻開始針刺相比造模后第3天、造模后第7天針刺,能更顯著地改善認知功能。

綜上所述,本實驗表明電針介入時間越早,即傷后即刻開始針刺對TBI后認知障礙的療效最好,具體表現(xiàn)在降低IL-1β、IL-18的表達,減少炎癥和神經(jīng)細胞死亡數(shù)量,改善神經(jīng)功損傷,提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和水平,這為臨床上何時應(yīng)用針刺治療TBI患者提供科學(xué)依據(jù)。后續(xù)在本實驗的基礎(chǔ)上,筆者團隊將進一步深入探討電針治療TBI后認知障礙的機制,為針刺的有效性和科學(xué)性提供依據(jù)。