電針對2型糖尿病模型大鼠腸黏膜屏障的影響

嚴江天,曾 林,唐 倩,康文武,鄭燦磊,2,蘇振宏,梁鳳霞,4△

1.湖北中醫藥大學,湖北 武漢 430065; 2.濟寧醫學院中西醫結合學院,山東 濟寧 272067;3.腎臟疾病發生與干預湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435003;4.針灸治未病湖北省協同創新中心,湖北 武漢 430065

糖尿病發病率逐年上升,預計將在2030年達到10.9%[1]。其中以2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)為主,我國的T2DM患者占總糖尿病人群的90%以上,隨著經濟發展和生活方式的改變,T2DM的發病率逐年上升并呈現年輕化的趨勢[2]。同時,最新研究發現Covid-19患者在康復后患T2DM的可能性會大大增加[3-4]。

T2DM作為一種慢性持續性炎癥疾病,炎癥在其發生發展中起到了重要的作用[5-6]。高脂高糖等不良飲食習慣導致腸道菌群紊亂,使得腸道上皮組織緊密連接被破壞,腸道通透性增加,腸道屏障功能受損[7]。腸道屏障功能損傷又會進一步導致內毒素(Lipopolysaccharide,LPS)進入體循環,誘發機體全身腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)等炎癥因子的上調,炎癥因子的上調進一步誘發β細胞功能紊亂,造成胰島素抵抗,同時又會加劇腸黏膜屏障損傷,形成惡性循環。因此,修復腸道黏膜損傷、恢復腸屏障功能現已成為治療T2DM的新靶點,本研究旨在觀察電針對T2DM模型大鼠全身炎癥及小腸黏膜屏障功能的改善作用,以期為針刺防治T2DM的臨床應用和后續機制研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

6周齡SPF級SD大鼠18只體質量160～200 g,購自湖北省醫學科學研究院動物中心提供(動物合格證號:42010200006503)。動物房溫度20～25 ℃,濕度(50±10)%,光照時間為12 h,自由進食與飲水,每籠5只,定期更換墊料并保證動物房清潔度達標。適應性喂養1周后,根據隨機數字表法,將大鼠分為正常組、模型組與電針組,每組各6只。本實驗過程對動物的處置嚴格按照科技部2006年頒布的《關于善待動物的指導性意見》。本課題經湖北中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(審批號:HUCMS201904005)。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器 中研太和牌針灸針(天津億朋醫療器械有限公司);HANS-LH202H型電針儀(南京濟生醫療科技有限公司);血糖儀(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司);DR-3518G酶標儀(無錫凱夫制藥有限公司);AXTG16G高速離心機(鹽城市安信實驗儀器有限公司);DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠);DYCZ-400D電泳儀槽(北京市六一儀器廠);Touch Imager成像系統(上海易孛特光電技術有限公司)。

1.2.2 試劑 鏈脲佐菌素(GC301002,武漢賽維爾生物科技有限公司);戊二醇固定液(BL-G014,南京森貝伽生物科技有限公司);LPS酶聯免疫吸附測定試劑盒(ARD40472,廣州奧瑞達生物科技有限公司);胰島素酶聯免疫吸附測定試劑盒(ARD40174,廣州奧瑞達生物科技有限公司);大鼠IL-6/TNF-αELISA試劑盒(PI328、PT516,上海碧云天生物技術有限公司);大鼠D-乳酸(D-lacticacid,D-LA)/二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)ELISA試劑盒(RC-D907681、RC-D907054,天津睿創生物科技有限公司);大鼠單克隆ZO-1抗體(sc-33725,圣克魯斯生物技術有限公司);小鼠單克隆Occludin抗體(sc-133256,圣克魯斯生物技術有限公司);小鼠單克隆Claudin-1抗體(sc-166338,圣克魯斯生物技術有限公司);小鼠單克隆GAPDH抗體(60004-1-Ig,武漢三鷹生物技術有限公司);山羊抗小鼠IgG(H+L)(SA00001-1,武漢三鷹生物技術有限公司);山羊抗大鼠IgG(H+L)(SA00001-15,武漢三鷹生物技術有限公司)。

1.3 模型建立及評價標準

大鼠適應性喂養1周后,隨機選取6只大鼠作為正常組,給予普通飼料(3.8 kcal/g,含70%碳水化合物,20%蛋白質,10%脂肪)喂養。其余大鼠采用高脂飼料喂養結合小劑量單次注射STZ制備T2DM模型[8-9]。給予高脂飼料(5.4 kcal/g,含38.5%碳水化合物,15%蛋白質,46.5%脂肪)喂養8周,4周后大鼠禁食不禁水20 h,然后按大鼠體質量35 mg/kg腹腔注射STZ。注射完成后72 h開始測血糖,凡隨機血糖水平在16.7 mmol/L以上,并維持2周以上者視為造模成功。

1.4 干預方法

參照《實驗針灸學》[10]和中國針灸學會制定大鼠實驗動物常用穴位名稱與定位[11]選取大鼠雙側“足三里”“三陰交”“腎俞”“脾俞”進行針刺。針刺前使用自制鼠衣對大鼠進行固定,并剃除針刺部位毛發。針刺采用0.30 mm×13 mm一次性無菌針直刺3～5 mm。電針組大鼠同側“足三里”“三陰交”接HANS-LH202H型電針儀,連續波,頻率15 Hz,電流2 mA,電針20 min/d,每周3次,隔日1次,共治療8周。以上采取的穴位選取、刺激頻率、電針時間和療程根據文獻報道綜合決定[12-14]。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 大鼠空腹血糖檢測 于干預前后測量并記錄各組大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG),檢測前各組大鼠禁食不禁水12 h,取大鼠尾尖血用魚躍血糖儀測量并記錄FBG。

1.5.2 血清各項生化指標檢測 干預結束后,大鼠禁食不禁水12 h,采用2%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,用一次性采血針快速扎入心間處,見有回血后迅速將另外一頭扎入促凝管中,3 000 r/min離心15 min后取上層血清,置于-80℃冰箱保存備用。采用ELISA法檢測血清中空腹胰島素(Fasting insulin,FINS)及TNF-α、IL-6、LPS、D-LA和DAO含量,并計算胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment-insulin resistance,HOMA-IR);HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。嚴格參照ELISA檢測試劑盒說明書步驟檢測各項指標。

1.5.3 小腸組織上皮超微結構觀察 采用透射電鏡觀測大鼠小腸上皮超微結構。取位于胃下3～6 cm的小腸組織,用眼科剪去除小腸組織上的脂肪組織和結締組織,經PBS沖洗后于冰上操作。用預冷的手術刀片將小腸組織切成0.5 mm×1 mm×3 mm大小,放入預冷的2.5%戊二醇中固定48 h,再用1%鋨酸后固定2 h,梯度乙醇脫水,環氧樹脂包埋,超薄切片(50 nm),3%醋酸鈾與硝酸鉛雙染色,室溫干燥過夜,透射電鏡下觀察并采集圖像。

1.5.4 小腸組織ZO-1、Occludin蛋白檢測 取各組大鼠小腸組織50 mg制備蛋白樣本。蛋白樣本采用BCA法測定濃度后,沸水浴加熱10 min使蛋白變性并進行SDS-PAGE凝膠電泳,電泳后將蛋白濕轉至PVDF膜。牛奶封閉2 h后,4 ℃搖床孵育一抗過夜(ZO-1 1∶500;Occludin 1∶1 000;Claudin-1∶1∶1 000;GAPDH 1∶10 000)。次日,根據一抗來源種屬孵育相應二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h。配置ECL化學發光試劑,用Touch Imager成像系統對PVDF膜進行曝光顯色。用Image Pro軟件對蛋白條帶進行定量分析。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR比較

與正常組比較,模型組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠FBG、FINS和HOMA-IR比較

2.2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量比較

與正常組比較,模型組大鼠TNF-α、IL-6含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠TNF-α、IL-6含量顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6含量比較

2.3 各組大鼠血清LPS、D-LA和DAO含量比較

與正常組比較,模型組大鼠LPS、D-LA和DAO含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,電針組大鼠LPS、D-LA和DAO含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清LPS、D-LA和DAO含量比較

2.4 各組大鼠小腸組織超微結構比較

正常組大鼠小腸緊密連接完整,橋粒數量較多;模型組大鼠小腸緊密連接不完整,橋粒數量減少;電針組緊密連接完整、橋粒正常。見圖1。

注:箭頭指向為緊密連接。圖1 各組大鼠小腸黏膜上皮超微結構觀察(5 000×)

2.5 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin與Claudin-1蛋白表達水平比較

與正常組比較,模型組大鼠小腸組織中ZO-1、Occludin與Claudin-1的表達水平顯著降低(P<0.01);與模型組比較,電針組大鼠小腸組織中ZO-1、Occludin與Claudin-1的表達水平顯著升高(P<0.01)。見圖2、表4。

圖2 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表達

表4 各組大鼠小腸組織ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表達水平比較

3 討論

中醫學中本無糖尿病這一病名,但根據其癥狀可將其歸為“消渴”“脾癉”等范疇。同時認為糖尿病的發生與飲食、情志和氣候等因素有關,主要是由于肺、脾和腎三臟的功能失調,導致氣血津液的異常代謝?！端貑枴て娌≌撈谒氖摺份d:“帝曰:有病口甘者,病名為何?何以得之?岐伯曰:此五氣之溢也,名曰脾癉……肥者令人內熱,甘者令人中滿,故其氣上溢,轉為消渴?！闭J為本病的誘因在飲食不節,根源在于脾胃,逐步發展為“消渴”。糖尿病早期消渴,以陰虛燥熱為主,煎灼津液,傷津耗氣致脾腎兩虛,日久脾虛及腎,腎陰虛火旺。故中醫治療糖尿病主要是以調節肺、脾和腎三臟為核心,健脾補腎、益氣養陰,調和氣血津液,消除痹阻,恢復正常代謝。故本研究選取腎俞、脾俞二穴相配伍,調理脾腎;選取足三里、三陰交,以扶正培元、益氣養陰。

STZ是目前制備糖尿病模型運用最為廣泛的藥物,但單一使用STZ誘導對注射劑量把控要求較高,造模成功率不穩定且死亡率較高[15]。因此,本實驗采用高脂飼料喂養結合單次小劑量注射STZ制備T2DM模型大鼠,一方面通過高脂飲食造成大鼠胰島素抵抗,一方面通過小劑量注射STZ對大鼠胰島β細胞造成輕度破壞,在提高造模成功率、降低死亡率的同時,也更加符合人類T2DM的發病機制[16]。

由LPS誘發的系統性炎癥是包括T2DM在內的代謝性疾病發病機制的重要因素[17],體循環中LPS的增加能夠引起多種組織炎癥,并最終導致胰島素抵抗[18-19]。腸黏膜屏障正是防止LPS進入體循環的關節結構。因此,改善腸道黏膜屏障功能,降低腸道通透性,減少腸道細菌代謝產物如LPS進入血液循環,目前被認為是改善T2DM等代謝性疾病的新治療策略[20]。腸黏膜屏障主要由腸上皮細胞及其緊密連接等組成。緊密連接在維持腸道黏膜屏障的正常功能方面起著重要作用。閉鎖蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudins)和閉合小環蛋白(ZO-1、ZO-2及ZO-3)等是緊密連接的主要組成。這些蛋白協同作用,維持腸道上皮細胞穩定性,調節腸道屏障的通透性,減少腸道大分子和微生物通過腸壁進入內環境[21]。正常情況下,緊密連接并非是靜止不動的,當腸上皮細胞受到細菌和毒素等的侵擾時,緊密連接可發生移位阻止這些有害物質進入,避免腸道細胞損傷。當腸道機械屏障遭到破壞時,細菌和毒素會侵入腸道細胞并引起多種細胞炎癥因子的釋放,從而導致腸道炎癥的發生。本研究結果顯示,電針能恢復T2DM大鼠小腸上皮緊密連接的完整性,并上調ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白表達,從而修復T2DM大鼠的腸黏膜屏障。

除此之外,還能通過腸道通透性來評價腸黏膜屏障功能的完整性。在正常生理狀態下,血液中的LPS、D-LA和DAO活性較低。然而,當腸上皮細胞或緊密連接結構受損時,腸道屏障的完整性會喪失,導致腸上皮細胞通透性增加,細菌易位,從而大量釋放LPS、D-LA和DAO進入血液循環[22-23]。因此,血清中的D-LA、DAO和LPS濃度變化可以作為間接反映腸道屏障功能的重要指標。本研究結果顯示,電針能下調T2DM大鼠血清中LPS、D-LA和DAO的含量,提示電針能夠降低腸道通透性,恢復大鼠腸道屏障功能。

綜上所述,電針“足三里”“三陰交”“脾俞”“腎俞”能夠降低T2DM大鼠空腹血糖,減輕大鼠全身炎癥及胰島素抵抗狀態,其機制可能與下調血清中LPS、D-LA和DAO的含量,降低腸道通透性,恢復小腸上皮細胞緊密連接,上調ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白表達有關。