人體生物樣本的預處理方式、RNA 提取方法及質量控制技術應用進展

秦雪怡，孫萌，郜晶，侯立功，張現偉，羅淑穎，，張耀東，，張萬存，，

1 鄭州大學附屬兒童醫院河南省兒童遺傳代謝性疾病重點實驗室，鄭州 450018；2 鄭州大學附屬兒童醫院河南省兒科病防治國際聯合實驗室；3 鄭州大學附屬兒童醫院河南省衛生健康委員會兒童腫瘤精準診療重點實驗室

血液、組織、尿液等是人體主要生物樣本，它們的預處理方式分別為離心分離白細胞、紅細胞、血小板及粉碎、裂解和離心去除沉淀物等，這些對于后續RNA 提取和分析的結果具有重要影響。人體生物樣本的RNA 提取方法包括酚氯仿法、硅基柱法和磁珠法等，選擇合適的RNA 提取方法是至關重要，對RNA 質量產生主要影響。在質量控制方面，需要注重RNA 純度、濃度以及完整度，穩定性十分重要。高質量的RNA 可以滿足各種下游實驗需求，并直接影響cDNA 文庫構建、基因克隆、基因表達分析等結果可靠性［1］，需要對保存試劑、保存時間、凍融程序等多個方面進行嚴格把控［2］。現就人體生物樣本的預處理方式、RNA 提取方法及質量控制技術應用進展情況綜述如下。

1 人體生物樣本預處理方式

高質量的RNA 可通過立即從新鮮的人體生物樣本中抽提得到［2］，操作過程需要在無RNase 的環境下進行，收取樣本后，如不具備當場抽提RNA 的條件，則需要將人體生物樣本進行適當的預處理。對人體生物樣本進行有效的預處理可以避免RNA酶的污染，防止RNA 降解［3］。組織樣本預處理需縮短冷缺血時間，選擇合適固定方式，減少凍融次數，以保障RNA 質量。不同人體樣本提取RNA 需適當預處理，離心分離血樣樣本，洗滌細胞顆粒和保留更多尿量等尿液樣本預處理，以及粉碎和裂解組織樣本，精子洗滌，陰道分泌物保存在RNAlater 中低溫保存，眼淚放入無RNase微管冷凍等預處理方式，均可以提高RNA質量。

1.1 人體血液樣本的預處理 在臨床工作中，人體血液樣本采集簡單，對患者創傷小，是理想的RNA來源。但是血液樣本在采集、處理、存儲過程中的不當操作，都可能使RNA 出現降解現象，進而影響RNA 質量［4］。例如溶血樣本的紅細胞破碎后會大量釋放血紅蛋白（Hb），使RNase 逐步釋放，RNA 產生降解，所以在選擇血液樣本時，需要選擇離心后上清外觀清亮的血液樣本［5］。為了減少血液樣本出現溶血的現象，通常要求工作人員在3～5 h 完成血液樣本的離心及分裝處理［6］。不同的血液樣本類型［7］、不同的放置時間及反復凍融次數［8］等，都會對血液樣本中RNA 質量產生影響；使用合適的采血管，如PAX-gene全血RNA采血管，添加保護劑如RNAlater、TRIzol，也是保證RNA 質量的重要舉措。為了評估血液樣本的預處理方法對RNA 質量的影響，張佳怡等［9］選取了8種外周血不同預處理方法及儲存時長，提取RNA 后對其產量、純度以及完整性進行比較，證實了經過預處理后的血液樣本提取出來的RNA在產量、純度以及完整性方面皆優于直接凍存法保存的血液樣本。不同類型的血液樣本提取出來的RNA 完整性及反轉錄后基因擴增效果有明顯差異，常見用于提取RNA 的血液樣本類型主要有全血、血漿、血清、白膜層、紅細胞等。劉欣等［7］通過提取凍存血研究了不同血液成分，如分離白細胞法、低滲紅細胞法、全血直提法提取的RNA 質量及其反轉錄后基因擴增效果，發現與分離白細胞法、低滲紅細胞法相比，全血直提法提取的凍存血RNA 完整性更好，其反轉錄后基因擴增效果更高，這對臨床血液樣本以何種成分保藏有一定的指導意義。反復凍融血液樣本對RNA 質量的影響較為明顯，何松哲等［10］考察了反復凍融血液樣本對RNA 質量的影響，通過將樣本置于不同溫度條件下，設置儲存時長1～7 d，凍融1～3 次，分別提取RNA，結果表明反復凍融主要影響全血RNA 提取效率和得率。由此可見，對血液樣本進行有效的預處理，選擇合適的采血管及保護液收集血液樣本、合適成分的血液樣本減少血液樣本的凍融次數能夠切實有效的提高血液樣本提取RNA的質量。

1.2 人體組織樣本的預處理 人體組織樣本是臨床診斷和科學研究中應用廣泛的生物樣本資源之一，從組織樣本中提取出來的RNA 質量可以很好地反映該樣本的質量［11］。組織樣本離體后影響其穩定性的因素較多，采集、固定及保存環節均影響著樣本RNA 完整性［12］，如樣本保存環境、細胞裂解、RNA 提取方法、內源RNase 激活、環境RNase 污染、低濃度RNA 的沉淀、提取后的RNA 儲存、源自富含降解酶的組織樣本等，都會對組織樣本中的RNA 質量產生影響，其中RNase廣泛而穩定存在，耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌，在實驗中要嚴格控制外源RNase 的污染，同時也要最大限度地抑制內源性RNase［13］。為保障人體組織樣本中RNA 的質量，對組織樣本進行適當的預處理，如控制冷缺血時間、選擇合適的保存方式、減少凍融循環次數等都是必要的環節。首先，冷缺血時間是影響人體組織樣本質量的重要因素，組織樣本在采集保存過程中的冷缺血時間主要是指組織離體后到儲存前的時間［11］，冷缺血時間與RNA 的質量具有一定的相關性。何璟榮等［14］隨機選取5 例手術切除的肝癌組織，分別在離體后5 個時間點處置，提取RNA 進行質量檢測，發現肝癌組織標本離體后，在25 ℃環境下放置30 min 內處置，提取RNA 的穩定性尚有質量保障，而離體40 min 后處置，RNA 已有一定降解，因此應該盡量縮短組織樣本的冷缺血時間，以保障RNA 的質量。其次，保存方式對人體組織樣本RNA 的質量也有重要影響，由于低溫保存過程中會包含結晶、反玻璃化以及冰晶再生長等冰晶生長過程，而冰晶的生長會對組織造成致命的機械損傷，所以在對組織的預處理中，可以加入保護劑（CPA）如二甲基亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇和二甲基甲酰胺等，它們可以通過氫鍵相互作用結合水分子，抑制冰晶生長并提高玻璃化轉變溫度［15］。組織的固定方法也是影響組織樣本RNA 質量的因素，例如石蠟包埋就是組織常見的固定方法，石蠟包埋組織中的RNA 含量極微，只能使用定量PCR 技術對其中的RNA 進行分析。嚴曉麗等［16］通過對相同病例的新鮮冰凍組織和石蠟包埋組織進行RNA 的提取，并對這兩種組織的長鏈編碼RNA 和短鏈非編碼RNA 中的微小RNA 進行逆轉錄擴增，比較兩種組織中不同類型RNA 的保存質量，認為石蠟包埋組織的RNA 濃度明顯低于新鮮組織，且石蠟包埋組織未能成功擴增ABCB1，結果未檢測出ABCB1 基因的表達。最后，反復凍融冰凍組織樣本對其提取的RNA 質量影響較為明顯，組織樣本凍融次數越多，RIN 值越低，并且隨解凍后RNA提取時間的延長，RNA 完整性也在不斷降低。張園等［17］收集15 例肝癌患者術后的組織樣本，低溫保存后將樣本分別在凍融0、1、3、6 次后提取RNA，通過對以上RNA 的完整性分析，發現當研究對RNA 質量要求比較高時，肝癌組織解凍不應超過3次，以保證RNA 的完整性。綜上，在人體組織樣本的預處理中，縮短組織缺血時間、選擇合適的固定方式，盡量減少凍融次數可以有效保障后續提取RNA的質量。

1.3 人體尿液樣本的預處理 尿液作為臨床上常見的樣本，與其他人體生物樣本的收集相比具有無創性、取用方便等優點，尿液樣本RNA 檢測被證實可能是泌尿系統疾病無創診斷和預后程序的最佳方法，RNA 的質量控制顯得十分重要。但尿液樣本的收集保藏又受到多種因素的影響，比如尿液收集方法、一天中的時間和排尿次數的變化等，為了提高尿液樣本中RNA 的質量，需要在提取之前對尿液樣本進行適當的預處理。BARAU 等［18］測試了幾種預處理策略，即洗滌細胞顆粒以去除可能的尿液痕跡，增加用于中和尿液樣本中含有的RNase的硫甘油酯的量，在RNA 提取過程中添加RNase 抑制劑，以及在尿液收集后立即向樣品中添加蛋白酶抑制劑，最終發現洗滌細胞顆粒的方法提供了最佳的提取率和RNA 質量，這種方法需要清洗細胞顆粒，以去除可能的尿液痕跡，從而能夠去除RNase，減少RNA的降解。不僅如此，尿液量也是提取RNA 的關鍵因素，王潔敏等［19］留取50 mL 尿液，以尿液容量區分，提取RNA 后發現兩組產量明顯不同，容量多的尿液提取出的RNA 產量顯著高于低容量的尿液，這組實驗還發現-80 ℃低溫凍存尿液標本7 d 或添加TRIzol 預處理凍存的方式對提取尿液沉渣細胞RNA 數量和質量均無影響，由此可見，在預處理中應盡量保留容量多的尿液樣本，可提高RNA 質量的重要因素，而凍存時長及保護液的添加對尿液中RNA 的質量影響不大。綜上，不管是洗滌洗滌顆粒細胞還是保留更多的尿量，對人體尿液樣本進行合適的預處理都是可以切實有效的提高尿液樣本中RNA 質量的手段。

1.4 其他人體生物樣本的預處理 除上述常見的人體生物樣本之外，腦脊液、陰道分泌物、精液、淚液等體生物樣本中也能提取出RNA，需要對其進行適當的預處理。有些樣本，例如人體精子樣本中所含RNA 量極少，且由于精子中圓形細胞存在，使得分離RNA 具有一定的挑戰性。于艷等［20］對人體精子樣本進行預處理，發現利用精子洗滌液純化精子，可以完全去除其他細胞的污染，為下一步提取高質量的精子RNA 奠定良好基礎。使用陰道分泌物提取RNA 之前也需要先進行合適的預處理，其方法通常是采集陰道灌洗液10 mL，離心后將沉淀物保存于1 mL 的RNAlater 中，并置于-70 ℃保存備用［21］。眼淚作為一種無創的遺傳物質和生物標志物，可以用于眼部和非眼部疾病的預后和診斷，考慮到淚液中RNA 的含量很少，選擇一種合適的預處理方法，對于提取出高質量的RNA 非常重要。DARA 等［22］發現，對淚液樣本最佳的預處理方式是將淚液樣品輕輕放入1.5 mL 無RNase 的微管中，在-70 ℃冷凍保存，待使用時再取出提取RNA，低溫凍存能夠最大程度上保證其中RNA 的質量。綜上，根據人體生物樣本的類型不同，進行的預處理方式也大不相同，而合適的預處理方法可以有效的提高RNA質量。

2 人體生物樣本RNA提取方法

常見的人體生物樣本RNA 提取方法主要包括TRIzol法、試劑盒法、改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB 法）等。TRIzol 法是一種常見的RNA 提取方法，能夠同時分離樣品中的RNA、DNA 和蛋白質，但存在分離效率不高和RNA 純度不穩定等缺點。RNA 提取試劑盒簡化操作，減少污染風險，適用于各種樣本，質量好可用于后續實驗。改良TRIzol 法和CTAB 法可提高RNA 提取效率和純度，適用于不同樣本特性［14］。

2.1 TRIzol 法提取RNA TRIzol 法是常見的RNA提取方法，最大的特點是TRIzol 試劑含有多組分分離作用，可同時分離一個樣品的RNA、DNA、蛋白質，但是存在分離效率不高，RNA 純度不穩定等缺點［23］。TRIzol 法能夠迅速裂解細胞釋放出RNA，并且能夠抑制細胞裂解產生出的核酸酶，從而可保護RNA 分子的完整性，因此對純化RNA 及標準化RNA 的生產十分有用［24］。TRIzol 法所使用的試劑，主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA 與蛋白質分離，并將RNA 釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA 進入水相，離心后形成水相層和有機層，這樣RNA 與仍留在有機相中的蛋白質和DNA 分離開。水相層主要為RNA，有機層主要為DNA 和蛋白質，再通過乙醇析出DNA，異丙醇沉淀蛋白質，即可將RNA 分離。有些人體組織樣本，例如胰腺，富含酶活力容易使RNA產生降解，使用TRIzol 法提取時需要注意對原始樣本的處理。魏偉等［25］對胰腺癌及癌旁組織進行優化處理，采用組織塊分離剪碎、RNase 清洗及抑制等方法，在液氮研磨后再使用TRIzol法進行提取，實驗發現優化處理后的組織相較之前很大程度上降低了RNA 的降解程度，為RNA 的表達檢測提供高質量的實驗樣本，增加了實驗的準確度。綜上，TRIzol法是目前提取RNA 的常用方法，能夠滿足大部分實驗需求，但亦需要根據樣本類型的不同，對提取步驟進行優化，減少提取過程中RNA 出現降解，保證RNA 的質量。

2.2 試劑盒法提取RNA 相較于TRIzol 提取法的操作繁瑣、費時、提取率低、易污染、直接接觸有毒的化學試劑等［26］，RNA 提取試劑盒的出現極大的簡化了操作步驟，使操作更為簡便，操作時間減短，避免了多次換管操作帶來的Rnase 污染的機會［27］。RNA試劑盒通常指用于各種植物、動物、微生物的RNA提取的試劑盒，適合RNA 的快速提取。目前，RNA提取試劑盒主要采用膜吸附技術（離心柱提取法）和磁珠吸附技術（納米磁珠法），不同的試劑盒在提取效率、時間、成本等方面存在較大差異，對RNA 的提取可影響RT-PCR 的檢測效果，各實驗室應根據自身條件及試驗目的合理選擇性價比較高的試劑盒對臨床樣本進行核酸提取［28］。在RNA質量方面，試劑盒與TRIzol法差異并不明顯，李冉冉等對比了6種試劑盒和TRIzol提取法的相對提取效率，在所有的提取方法中，綜合考慮RNA的產量、質量以及RT-PCR檢測結果，發現TRIzol 提取法及試劑盒（RNeasy?Mini Kit）提取的RNA 質量并無明顯差異。對于miRNA，試劑盒法的提取效果略優于TRIzol 法。黃學文等對miRNA 提取方法進行評價，發現硅膠吸附柱法比TRIzol 法更能有效提高miRNA 的提取效率和純度。綜上，無論是總RNA 還是miRNA 的提取，使用試劑盒提取的RNA 質量完整性好、純度高，可以用于分子生物學后續實驗。

2.3 其他方法提取RNA 除以上兩種常見的RNA提取方法，亦可以選擇對TRIzol 法進行改良或使用CTAB 法等。由于miRNA 在細胞中主要以蛋白復合體的方式存在，TRIzol 法容易造成miRNA 大量丟失。陳雪梅等根據血漿游離RNA 與蛋白結合的特性，通過調整有機試劑比例、改變RNA 沉淀時間等方式，改良了傳統TRIzol法，有效地提高了血漿游離RNA 的得率。CTAB 是一種強變性劑，能溶解細胞膜和核膜，使核蛋白解聚變性，從而使RNA 得以游離出來，有些人體生物樣本，如松質骨內含有大量造血細胞及脂肪等，富含降解核酸的各種酶分子。因此，很難從細胞量少、難于裂解的致密結締組織中提取出完整和純凈的總RNA，趙煥英等通過對比TRIzol法、試劑盒法及CTAB法提取人體松質骨組織樣本的RNA，發現用TRIzol 方法提取，不但基因組DNA 很難分離出去，且含有糖蛋白成分，導致獲得的RNA 純度最差。用試劑盒提取RNA 可以去除基因組DNA 污染，但完整性差，從電泳帶及A260/A230比值都證明了仍然有多糖分子殘留，而使用CTAB 法則提取得到了質量較高的RNA。由此可知，除傳統TRIzol 法及試劑盒提取法外，根據樣本的特性選擇其他合適的RNA 提取方法，如改良TRIzol 法、CTAB法也可以得到高質量的RNA。

3 人體生物樣本RNA質量控制技術

人體生物樣本RNA 的質量控制需要重點關注濃度、純度、完整度及基因表達水平這幾個方面。使用超微量分光光度計檢測RNA 的吸光度，ng/μL 為RNA 的濃度單位，A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波長，代表該核酸的濃度，A280nm是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，A230是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，A260/A280和A260/A230為RNA 的純度指標。A260/A280范圍在1.8～2.0，即表明該樣本RNA為高度純化，A260/A280低于1.8，則提示該樣本可能受到蛋白質等污染。RNA 的完整性通常使用RIN值來表示，使用10～1 反映RNA 完整性程度，10 為完整性最高，1 為降解程度最高；RIN≥7 視為較高質量的RNA，可用于基因芯片等的高級別研究。RIN值可通過毛細管凝膠電泳法對RNA 樣本進行檢測得出，此外如能在電泳中觀察到28S 的條帶亮度為18S 的2 倍，且無拖帶現象，則也可表明所提取的RNA 基本無降解，完整性好。值得注意的是，在進行毛細管凝膠電泳法檢測之前通常需要對RNA 樣本做變性處理，操作方法是使用PCR 儀對RNA 樣本進行70 ℃，2 min 的加熱后立即在冰上放置5 min 后再進行檢測。除此之外，有些實驗在提取RNA 后，將其反轉錄為cDNA，進行基因擴增，觀察期基因表達水平，以此作為該RNA 質量控制指標。綜上，RNA 質量的考察必須從多方面進行，需要關注其濃度、純度、完整度指標，不僅如此，其基因表達水平也是重要的質量控制指標。

綜上所述，人體生物樣本預處理對RNA 質量非常重要，包括控制收集和保存時間、選擇合適的保存劑以及減少凍融次數等預處理方式均與RNA 質量有關。此外，提取方法也是影響RNA 質量的關鍵環節，根據不同生物樣本類型選擇合適的提取方法，可以有效提高RNA 質量。最后，在評判RNA 質量時需要關注濃度、純度、完整度以及基因表達水平。未來研究重點和熱點包括改進生物樣本預處理技術，尋找更加有效的保存劑和提取方法，并且發展新型的RNA 質量評估指標。另外，在基因表達水平方面也有待深入研究，以更全面地評價RNA質量。