甘肅岷縣紅三葉病害及其對紅三葉生長和品質的影響

摘要：‘岷山’紅三葉（Trifolium pratense cv.Minshan）是適宜于岷縣地區生長的優良豆科牧草品種。前期的調研發現該地區紅三葉田間病害發病較重，限制了紅三葉的生產，而目前尚缺少該地區病害的系統研究。本研究調查了‘岷山’紅三葉在岷縣田間的主要病害及發生規律，并研究了匍柄霉葉斑病對紅三葉生長和品質的影響。該地區紅三葉主要田間病害為匍柄霉葉斑病（Stemphylium sarcniforme）、小光殼葉斑病（Leptosphaerulina trifolii）和長隔孢葉斑病（Longiseptatispora meliloti）。其中紅三葉匍柄霉葉斑病最為嚴重，最高發病率26.67%，病情指數8.20。匍柄霉葉斑病顯著影響了紅三葉的產量和品質，導致鮮重顯著下降20.14%、葉綠素含量顯著下降20.93%及引起各項營養指標的不同變化。本研究明確了岷縣地區紅三葉主要病害的發生情況及發病最為嚴重的匍柄霉葉斑病對紅三葉生物量和品質的影響，為該地區的紅三葉病害防控提供依據。

關鍵詞：‘岷山’紅三葉；田間病害；致病性；生長指標；牧草品質

中圖分類號：S432.4+4""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）05-1303-11

Diseases of Red Clover and Their Effects on the Growth and Quality of

Red Clover in Min County，Gansu Province

ZHENG Rong-chun， NAN Zhi-biao， DUAN Ting-yu*

（State Key Laboratory of Herbage Improvement and Grassland Agro-ecosystems， College of Pastoral Agriculture

Science and Technology， Lanzhou University， Lanzhou， Gansu Province 730020， China）

Abstract：Trifolium pratense cv. Minshan，an excellent legume forage，is suitable for growing in Min County，Gansu Province. Previous investigations have found that red clover suffered serious yield losses due to field diseases. However，systematic studies on the effects of diseases on performance of the plant remained unclear. This study aimed to investigate the major diseases and their occurrence patterns in the fields. Additionally，the study examined the impact of Stemphylium leaf spot disease on the growth and quality of red clover. The main field diseases were Stemphylium leaf spot，Leptosphaerulina leaf spot，and Longiseptatispora leaf spot，caused by Stemphylium sarcniforme，Leptosphaerulina trifolii，and Longiseptatispora meliloti，respectively. Among them，Stemphylium leaf spot had the highest severity，with a peak incidence rate of 26.67% and a disease severity index of 8.20 and caused a 20.14% reduction in fresh weight，a 20.93% decrease in chlorophyll content，and various changes in nutritional indicators. Stemphylium leaf spot had a significant impact on the growth and quality of red clover. This study provided a clear understanding of major diseases occurring in red clover fields in Min County，particularly the impact of Stemphylium leaf spot on the growth and quality. The findings provided valuable insights for disease prevention and control of red clover cultivation in this region.

Key words：Trifolium pratense cv. Minshan;Filed disease;Pathogenicity;Growth indexes;Pasture quality

紅車軸草（T. pratense）又名紅三葉，為豆科（Leguminosae）車軸草屬（Trifolium）多年生草本植物，是世界上栽培最早和最重要的牧草之一［1］。紅三葉莖葉柔軟，蛋白質含量高，適口性好，家畜喜食用，用作青刈、曬制干草均可，同時也是很好的放牧型牧草［2］。紅三葉具有容易建植、生長迅速、固氮及改良土壤等特性，因此也是重要的果園及農田綠肥植物［3］。

病害是限制紅三葉生產的重要因素，截至2022年，世界范圍內共報道紅三葉病害55種，由109種真菌病原引致（基于中國知網、Web of Science和Fungal Databases數據庫）。其中危害最為嚴重的有白粉菌屬（Erysiphe）病原菌引致的白粉病、鐮孢菌屬（Fusarium）病原菌引致的根腐病及核盤菌屬（Sclerotinia）病原菌引致的菌核腐爛病等。白粉病發生嚴重時，紅三葉植株生長遲緩、產量降低、種子產量下降或不實、粗蛋白含量下降、適口性降低、牲畜避食［3］。1984—1985年，由于根腐病為害，貴州牧草種籽繁殖場約10 ha紅三葉僅收50 kg種籽，損失80%以上［4］。菌核病一旦發生，氣候適宜的情況下能夠造成田間植物成片死亡，其災害是毀滅性的［5］。由三葉草核盤菌引起的冠腐和莖腐病，是美國東部、中北部地區以及歐洲豆科牧草最具破壞性的病害之一。對三葉草而言，該病原菌主要破壞夏末或初秋建植的幼苗，在合適的條件下，幼苗可以被完全摧毀［6］。報道的紅三葉病害種類多樣，分布廣泛且危害嚴重，但缺乏深入研究。

‘岷山’紅三葉1943年從美國引進，1975—1985年由甘肅省草原隊（現甘肅省草原技術推廣總站）在岷山種畜場選育成功。1987年經全國飼料牧草品種審定委員會審定登記注冊為地方優良牧草新品種，在當地已有60多年的栽培歷史，是定西南部高寒陰濕地區最適宜種植的優良牧草品種［7-8］。蘭州大學草地保護研究所團隊前期在甘肅岷縣的調研表明，‘岷山’紅三葉病害時有發生，在生長后期種子田中植株發病率目測高達90%以上，嚴重影響其生產，而目前尚缺乏該品種病害的研究。了解病害發生的情況與規律是防治病害的必要條件，是實施科學有效的防控的重要依據。因此，研究明確該地紅三葉的病害及種帶真菌，厘清主要病害病原及病害發生規律和危害，對岷山紅三葉的種植、推廣及畜牧業生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究材料試驗地概況及樣地設立

岷縣位于甘肅省定西市（北緯34°26′22″，東經104°02′13″），海拔2 400 m，氣候屬于溫帶半濕潤向高寒濕潤氣候過渡帶，高寒陰濕，植被覆蓋很好，年平均氣溫為5.5℃，最熱7月份平均氣溫16℃，最冷1月份平均氣溫—6.9℃；年降水量為635 mm，雨水集中在7—9月；平均相對濕度68%。

供試紅三葉種植田共三塊，分別位于岷縣寺溝鎮立珠村、立林村和奔直寺岷山種畜場等三個獨立區域，具體情況如表1。

1.2 研究方法

1.2.1 病害調查 2021—2022年于定西市岷縣連續兩年實地調查紅三葉生長季的病害發病情況并采集樣本，方法參考任繼周主編的《草業科學研究方法》第十一章［9］。

每個地點分別調查數個區域。采用5點取樣法，選取5個小區（1 m×1 m），調查病害發生情況。調查時，每小區紅三葉隨機取50個葉片調查發病率，記錄嚴重度，每個區域每次調查250張葉片。調查過程中，拍照記錄患病植株的發病部位與病癥，并將采集到的植株標本放入標本夾或紙袋中保存待用，同時仔細記錄該植株的采集時間、地點等信息。

根據紅三葉病斑所占葉片面積的百分比進行嚴重度分級，分別記錄各級別下的葉片數，分級標準如下：

0級：無病；

1級：病斑面積占葉面積的0.1%～20%；

2級：病斑面積占葉面積的20.1%～40%；

3級：病斑面積占葉面積的40.1%～60%；

4級：病斑面積占葉面積的60.1%～80%；

5級：病斑面積占葉面積的80.1%～100%。

計算發病率（I）、病情指數（DI）：

發病率I（%）＝病葉數/調查總葉片數×100

病情指數DI=100×∑（各級病葉數×各級代表值）/調查總葉數×最高級代表值

1.2.2 病原菌的分離鑒定 按照常規組織分離法分離病原菌［10］。取病健交界處切成小塊，置于75%酒精中30 s，然后置于1%NaClO中2 min，再用無菌水沖洗3～5次。將植物組織置于馬鈴薯瓊脂（PDA）培養基平板上，放在25℃恒溫培養箱（SANYO MIR-254）中黑暗培養3～4 d，再從菌落邊緣挑取菌絲進行純化獲得純培養，于4℃冰箱中保存。將病原菌接種于PDA培養基25℃黑暗培養14～28 d后，記錄菌落的形態特征，包括菌落的正、反面顏色和邊緣形態。用光學顯微鏡（Carl Zeiss）觀察分生孢子、分生孢子梗特征，使用熒光生物-體視顯微鏡（奧林巴斯BX51 SZX12）拍照并測定分生孢子的大小（50個）。

刮取PDA平板上的菌絲置于研缽中，加入液氮迅速研磨，再利用真菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程公司）提取病原菌DNA，經凝膠電泳檢測后進行PCR擴增。采用ITS1/ITS4［11］和GDP1/GDP2［12］等引物對相應的DNA片段進行擴增。PCR產物送往上海生工生物工程技術有服務限公司測序。將測得的序列在NCBI進行BLAST比對，構建系統進化樹，確定病原菌的屬種。

根據真菌形態學特征與分子生物學鑒定結果進行綜合鑒定。

1.2.3 溫室致病性測定 試驗于蘭州大學榆中校區智能溫室進行。供試品種為‘岷山’紅三葉，2020年秋季收獲于岷縣田間。選取健壯完整的種子，經75%酒精浸泡30 s、1% NaClO消毒10 min后，用無菌蒸餾水洗滌5次，放置于鋪有兩層滅菌濾紙的培養皿內，濾紙用無菌水潤濕，置于溫度25℃、濕度65%的植物培養箱中培養3～4 d，每日加水保濕。盆栽沙土比2∶1，混合過篩剔除雜物后平鋪于瓷盤上，將瓷盤置于烘箱中169℃滅菌2 h，待降溫后裝盆（直徑15 cm）播種，每盆10粒種子，出苗后定植3株。

病原菌接種采用噴霧接種法。向培養皿中添加10 mL無菌水，充分攪拌過濾以收集分生孢子。利用血細胞計數板計數，將孢子懸浮液濃度調整至1×106個·mL-1，重復計數3次。收集20 mL孢子懸浮液并添加0.02% Tween 80溶液以提高粘附能力，將孢子懸浮液均勻噴灑在紅三葉葉片上。不產孢的病原菌則接種菌絲懸浮液，同樣采用噴霧接種［14］。每種病原菌處理5個重復，將接種20 mL無菌水的植株作為對照。發病后每3 d調查統計發病率、嚴重度。對發病的部位進行病原菌的再分離純化。

1.2.4 病害損失評定 接種21 d后收獲，測量三葉草植株的株高、分枝數、干鮮重及粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、氨基酸含量等營養指標。

株高：使用卷尺測量植株株高。

分枝數：計數統計植株分枝數。

干鮮重：將盆栽內的紅三葉植株齊地面剪下，測其鮮重后在103℃干燥箱內殺青30 min，后在70℃干燥箱烘7～8 h，稱量干重。

牧草品質：將烘干后的紅三葉地上部粉碎，自封袋分裝。樣品處理好后送往武漢多米諾生物科技有限公司測定。具體指標及測定方法如下：

葉綠素、綠原酸：使用比色法測量葉綠素和綠原酸含量［15］。

粗蛋白：使用凱式定氮法測定樣本含氮量并計算粗蛋白含量［16］。

粗纖維：采用范式洗滌法測定粗纖維含量［17］。

粗脂肪：采用索氏抽提法測定脂肪含量［18］。

粗灰分：用干灰化法測量粗灰分含量［19］。

可溶性蛋白：采用考馬斯亮藍比色法測定可溶性蛋白含量［15］。

可溶性糖：采用硫酸蒽酮法測定可溶性總糖含量［15］。

氨基酸：采用高效液相色譜儀串聯質譜儀測定氨基酸含量［20］。

礦質元素：采用ICP-AES/OES/MS測定多元素含量［21］。

1.3 實驗數據統計處理

使用MEGA 11.0軟件進行序列分析，采用鄰近-連接法（the Neighbor-Joining method）構建系統聚類樹獲得，檢驗系統樹的可靠性用Bootstrap法，經1 000次循環。數據使用Excel專業增強版2016進行錄入處理，利用IBM SPSS Statistics 25軟件對所測得數據進行統計分析，Duncan法進行事后比較，使用GraphPad Prism 9.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及鑒定

2.1.1 匍柄霉葉斑病 該病主要為害葉片，初為小褐點，后逐漸擴大為近圓形或不規則形褐斑，稍凹陷，中部色較淡，有時呈現輪紋狀。受害嚴重時葉片干枯（圖1A-C）。在PDA平板上，病原菌的菌落直徑大于60 mm，展開呈絨毛狀，菌落下層與背面呈灰黑色，表層覆蓋有一層棕灰色霉層（圖1D-E）。分生孢子梗常簇生，長達80～82 μm，粗4～8 μm，具隔，圍繞各環痕膨大部分各有一條暗色帶（圖1F）。分生孢子近圓形，褐色具縱橫隔膜，（18～28） μm×（19～32） μm，與他人對束狀匍柄霉的形態特征描述相同［22-23］。使用引物擴增內部轉錄間隔區（ITS）和甘油-3-磷酸脫氫酶基因（GAPDH）。將基因序列上傳至GenBank數據庫，ITS序列登錄號為PP212851，GAPDH序列登錄號為PP236998。BLAST比對結果顯示，該ITS序列與登錄號為KU850621.1的束狀匍柄霉有99.81%相似性，GAPDH序列與登錄號為AB979949.1的束狀匍柄霉有100%相似性。多基因聯合建樹結果表明，該菌與S. sarcniforme聚為一枝，自展值為100（圖1G）。通過形態學和分子生物學鑒定，病原菌被鑒定為束狀匍柄霉，田間病害為紅三葉匍柄霉葉斑病，亦稱輪紋病或污斑病。

2.1.2 小光殼葉斑病 該病主要為害幼嫩的葉片，葉片遍布小黑點，發病初期為黑色小斑點（圖2A和2B），一些病斑中部可見灰白色凹陷（圖2C）。未見其后期發展形態。菌絲體在PDA平板上多生長于培養基中，呈放射狀，邊緣不規則（圖2D和2E）。菌落黑色，表面覆蓋有灰黑色硬殼。產生顆粒狀物（子囊殼），大小約為25 μm×60 μm，未見到子囊孢子的產生（圖2F），形態學特征與他人描述的三葉草小光殼相同［24-25］。將基因序列上傳至GenBank數據庫，ITS序列登錄號為PP212852。BLAST比對結果顯示，該ITS序列與登錄號為MK379997.1的三葉草小光殼有98.4%相似性。構建系統發育樹，該菌與三葉草小光殼聚為一枝，自展值為83（圖2G）。通過形態學和分子生物學鑒定，將該病原菌被鑒定為三葉草小光殼，田間病害為紅三葉小光殼葉斑病。

2.1.3 長隔孢葉斑病 該病在田間主要為害葉片，初為白色小斑點，后逐漸擴大為近橢圓形或不規則形灰白色斑（圖3A和3B），病斑周圍呈淺黑色，中部色較淡，或可見數個小突起（圖3C）。病原菌在PDA平板上菌絲體呈氈狀，生長緩慢，菌落面積較小，為粉色至白粉色，表面有褶皺，稍厚（圖3D-E）。分生孢子器厚壁，孔口乳頭狀，分生孢子梗缺如，全壁芽生式產孢，孢子大小約為（6～15） μm×（4～8） μm，無色，長橢圓形至卵圓形，有隔（圖3F）。該菌的形態學特征與田間癥狀與他人研究中的草木樨長隔孢一致［26-27］。將基因序列上傳至GenBank數據庫，ITS序列登錄號為ON259933。BLAST比對結果顯示，該ITS序列與登錄號為MT520594.1的Leptosphaeria weimeri有97.40%的相似性。經系統發育樹分析，該菌與草木樨長隔孢聚為一枝，自展值為99（圖3G）。通過形態學和分子生物學鑒定，將該病原菌鑒定為草木樨長隔孢（Longiseptatispora meliloti＝S. meliloti＝L. weimeri），田間病害為紅三葉長隔孢葉斑病。

2.2 田間發病動態

岷縣紅三葉的生長季節為每年4月至9月，4月播種或返青，此時未觀察到明顯的病害發生。2021年5月在田間觀察到紅三葉發病，此時匍柄霉葉斑病的發病率為0.93%，小光殼葉斑病的發病率為2.90%，長隔孢葉斑病的發病率為0.80%。匍柄霉葉斑病的發病率9月達到最高，為23.60%，病情指數為7.90；小光殼葉斑病及長隔孢葉斑病8月發病率最高，發病率分別為4.60%和3.20%，病情指數為1.27和1.23；在生長中后期，匍柄霉葉斑病的發病率和病情指數顯著高于其他兩種葉斑病（Plt;0.05）（圖4A和4B）。

2022年，匍柄霉葉斑病發病率由5月最低的2.00%不斷增長，至8月最高，為26.67%，病情指數由0.77增加至8.20。長隔孢葉斑病發病率由5月最低的1.30%不斷增長，至8月最高，為4.80%，病情指數由0.50增加至1.53。長隔孢葉斑病病情發展總體呈現增長趨勢，但總體發病率與病情指數較低。在2022年的多次田間調查中，小光殼葉斑病僅6月與7月在立林村田間偶見發生，發病率極低，僅為0.20%和0.24%。在生長中后期，匍柄霉葉斑病的發病率和病情指數顯著高于長隔孢葉斑病（Plt;0.05）（圖4C和4D）。

2.3 致病性

2.3.1 匍柄霉葉斑病 采用噴霧法接種5 d后觀察到植株發病，葉片上出現小黑點，發病率為33.0%，病情指數12.63。接種17 d后，發病率達到最高，為45.0%，病情指數為19.00，發病嚴重時黑斑遍布整個葉片，黑點發展為圓形或橢圓形病斑，呈現輪紋狀（圖5A）。溫室發病癥狀與田間癥狀一致，并且能夠從病葉上重新分離獲得束狀匍柄霉（圖5B）。

2.3.2 小光殼葉斑病和長隔孢 接種三葉草小光殼和草木樨長隔孢后，僅有數片葉片發現發病且癥狀不明顯，發病率分別為0.5%和1.5%。三葉草小光殼的發病癥狀與田間癥狀相似（圖6A），但草木樨長隔孢的發病癥狀與田間略有不同（圖6B），二者均能從病葉上重新分離獲得一致的病原菌。

2.4 匍柄霉葉斑病對紅三葉生長和品質的影響

溫室接種匍柄霉葉斑病以評定其對于紅三葉產量和品質的損失。接病植株的鮮重相比對照植株顯著降低了20.14%（Plt;0.05），接病植株的干重相比對照植株沒有顯著差異；接病植株與不接病植株的分枝數之間沒有顯著差異；接病植株的株高相比對照植株顯著降低了13.96%（Plt;0.05）（圖7）。

同對照相比，接病植株的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗灰分含量較對照降低了1.53%～6.67%，可溶性蛋白及可溶性糖含量較對照提高了4.50%～4.68%，但沒有顯著差異；葉綠素含量相比對照顯著降低了20.97%（Plt;0.05）。在檢測的20種氨基酸中，異亮氨酸相比對照顯著降低了64.98%，甲硫氨酸、酪氨酸含量顯著提高了273.68%和61.35%（Plt;0.05）。在接病和不接病處理下的植株7種礦質元素含量均沒有顯著差異（表2）。

3 討論

本研究通過形態學對比、分子生物學鑒定及致病性測定，明確了在岷縣紅三葉田中主要病害為3種葉斑病，病原菌分別為束狀匍柄霉、三葉草小光殼及草木樨長隔孢。其中，由草木樨長隔孢引致的紅三葉葉斑病為在中國的首次報道記錄。

商鴻生曾報道過由草木樨殼多孢（S. meliloti）引致的白三葉新病害，定名三葉草殼多孢葉斑病，其有性態為草地小球腔菌（L. weimeri），田間未見［27］。2020年，Hou等通過形態學對比及分子生物學鑒定研究將其重新分類，為草木樨長隔孢（L. meliloti）（暫譯）［28］。草木樨長隔孢目前僅在豆科苜蓿屬（Medicago）、車軸草屬、羽扇豆屬（Lupinus）及草木樨屬（Melilotus）的植物上報道有病害的發生（表3）。該病原菌曾導致澳大利亞和法國苜蓿發病減產［26-29］，在美國阿拉巴馬州引發白三葉的破壞性危害［30］。在紅三葉上，草木樨長隔孢的研究僅局限于病害的記錄，未能有更深入的探索，且少有報道。在岷縣紅三葉種植田中，草木樨長隔孢的整體發病率與病害嚴重度低，但在整個生長季均能發現有明顯的發病，對紅三葉的生產有一定的影響。在溫室致病性試驗中，紅三葉接種草木樨長隔孢7 d后出現癥狀，而后隨著植株的生長，病害癥狀未加重，說明該病原菌的致病能力不強。

三葉草小光殼是一種地理分布范圍廣泛的寄生性真菌，寄主植物的類型多樣，主要寄生在以下科的經濟作物上：十字花科（Brassicaceae）、大戟科（Euphorbiaceae）、禾本科（Poaceae）、豆科和茄科（Solanaceae）（表3），在環境條件適宜的情況下會導致寄主植物發病［31］。發病時植物的葉子和葉柄上出現許多棕黑色凹陷的小病斑，豆科植物癥狀尤其明顯，有時也會產生葉焦［25］。三葉草小光殼一般由寄主葉片上萌發的子囊孢子直接穿透角質層和外表皮細胞壁進行傳播，傳播與侵染也可能通過種子發生［24］。2004年5月至2007年，韓國江原道高爾夫球場的肯塔基早熟禾（Poa pratensis）發生了由三葉草小光殼引起的小光殼葉枯病，患病嚴重的植株從葉尖向下到冠部全部枯萎死亡［32］；三葉草小光殼引致的小光殼葉斑病也曾導致澳大利亞、北美等地的苜蓿減產［33-34］，導致經濟損失。在紅三葉上，該病害的研究僅停留在報道記錄上。在田間，小光殼葉斑病的發病率與病害嚴重度低，僅在幼嫩葉片上發現，癥狀為零星小黑點。在溫室致病性試驗中，三葉草小光殼的致病性較差，接種5 d后僅僅數片葉子出現癥狀，而后隨著植株的生長，癥狀消失。田間調查與溫室致病實驗的結果表明紅三葉小光殼并不是常見性病害，且致病能力弱，對紅三葉生長的影響很小。

匍柄霉葉斑病是三葉草生產中的重要病害，世界性分布，在我國見于云南、貴州、湖北、甘肅等種植區。最常見的病原菌為束狀匍柄霉，主要為害葉片，受害嚴重時葉片干枯，提早脫落。束狀匍柄霉的宿主除豆科常見的苜蓿、三葉草、豌豆等，還有菊科和禾本科的一些作物（表3）。可侵染三葉草的匍柄霉屬真菌還有簇孢匍柄霉（S. botryosum）和囊狀匍柄霉（S.vesicarium）［34-35］。匍柄霉以休眠菌絲體或分生孢子在病株或病殘體上越冬，次年生長季節，分生孢子借助風雨重復侵染，擴展蔓延至流行。紅三葉匍柄霉葉斑病在美國東北部、加拿大及歐洲大部分地區都有發生，病害嚴重度高，產量損失高達10%［36］；該病影響了我國貴州、云南等地的紅三葉生產，造成紅三葉產量和品質下降、種子減產［37-38］。在岷縣田間，匍柄霉葉斑病自五月開始發生，伴隨紅三葉的整個生長季，為當地紅三葉最為嚴重的病害，受害植株葉片出現大量黑斑，病葉枯死，植株矮小，嚴重影響紅三葉的生產。溫室致病性實驗發現，在接種病原菌后匍柄霉葉斑病迅速發展，導致葉片蜷縮枯萎，顯著降低了葉片葉綠素含量、植株的鮮重和干重，這說明匍柄霉葉斑病顯著影響了紅三葉的光合作用和產量。對其品質指標進行測定，接病植株的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪和粗灰分含量雖沒有顯著性的差異，但整體呈現降低趨勢，這可能是由于發病周期較短，采集樣品時病害的影響未能繼續擴大。

氨基酸是生物大分子的組成部分［39］，一些氨基酸是合成各種次級防御代謝產物的前體成分。例如，脂肪族氨基酸（如丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸和纈氨酸）和芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）參與脂肪族、芳香族和吲哚型硫代葡萄糖苷的形成，硫代葡萄糖苷的水解產物可作為防御化合物對抗食草動物和病原體［40］；谷氨酸激活水楊酸（SA）途徑以觸發水稻的稻瘟病抗性［41］；異亮氨酸（Ile）是植物激素茉莉酸（JA）活性成分JA-Ile的前體，外源Ile的加入可增強生菜（Lactuca sativa）、玫瑰（Rosa rugosa）和草莓（Fragaria×ananassa）等作物對灰霉病（B. cinerea）的抗性［42］。綜上研究說明氨基酸代謝與抗病性之間存在明顯的相關性。本研究中，匍柄霉葉斑病降低了異亮氨酸含量，但增加了甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）含量，這種變化不僅代表其牧草品質發生了改變，也意味著病害的發生激活了其體內相關的防御機制，具體情況仍需進一步探索。

牧草中的鉀（K）、鈣（Ca）、磷（P）等大量元素不僅是促進自身生長發育的重要營養元素，也是牧草礦質營養的重要組成部分，對草食動物的營養調節代謝有著重要的作用［43］。K參與植物滲透壓、細胞膜點位及pH的調節過程，同時參與蛋白質合成、葡萄糖轉運及光合作用過程中酶的活化等重要生理生化過程。Ca是生物體內普遍存在的第二信使，參與各種細胞過程，調控植物的發育，響應生物和非生物脅迫。P與植物產量調控密切相關，有研究報道當植物對P的攝入不足時會使植株產量降低10%～15%，適宜施P肥可有效提高苜蓿種子莢果數、結莢率和種子產量［44］。Zn，Fe，Cu，Se等微量元素也是植物生長和動物生長發育必不可少的元素，直接影響牧草品質的優劣［45］。本實驗中，接病處理下各類礦質元素的含量相比對照并有顯著差異，除鈣元素外，其他礦質元素含量均有不同程度的提高，推測其與植株體內的脅迫相應機制有關。

4 結論

于岷縣田間發現的3種葉部病害，病原菌分別為束狀匍柄霉（S. sarcniiforme）、三葉草小光殼（L. trifolii）及草木樨長隔孢（L. meliloti）。由草木樨長隔孢引致的紅三葉葉斑病為在中國的首次報道記錄。其中紅三葉匍柄霉葉斑病最為嚴重。匍柄霉葉斑病顯著影響了紅三葉的產量和品質，導致鮮重下降20.14%，葉綠素含量下降20.93%。接病紅三葉植株的粗纖維、粗蛋白、粗脂肪及灰分含量下降1.53%～6.67%。在測定的20種氨基酸指標中，異亮氨酸相比對照顯著降低了64.98%，甲硫氨酸和酪氨酸含量顯著提高了273.68%和61.35%。測定的礦質元素含量沒有顯著性變化。

參考文獻

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-10-20；修回日期：2024-01-15

基金項目：國家綠肥技術產業體系（CARS-22）資助

作者簡介：

鄭榮春（1997-），男，漢族，福建福州人，博士研究生，主要從事牧草病理學研究，E-mail：zhengrch2023@ lzu. edu. cn；*通信作者Author for correspondence，E-mail：duanty@ lzu. edu. cn