光果柱花草轉基因毛狀根及其原生質體制備體系的建立

摘要：光果柱花草（Stylosanthes leiocarpa）是柱花草屬（Stylosanthes Sw.）中可用于林果園間作的一個野生種。截至目前，光果柱花草的轉基因體系尚未建立。本研究以光果柱花草的子葉節為外植體，比較不同的發根農桿菌菌株與潮霉素B濃度對毛狀根誘導率及轉基因陽性率的影響。結果發現，以K599為誘導菌株且培養基添加8 mg·L-1潮霉素B為篩選壓，是最優的毛狀根誘導條件，誘導率達23.33%，陽性率為100%。在此基礎上，利用轉基因毛狀根制備原生質體，結果表明，添加2.5%纖維素酶和2%離析酶，以及8 h的酶解時間為最優條件，原生質體的產量達2.745×105個·g-1，活力為91.02%，制備的原生質體100%為轉基因細胞。本研究成功建立了一種發根農桿菌介導的光果柱花草轉基因毛狀根誘導體系及原生質體制備體系，為后續光果柱花草的基因功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：光果柱花草；發根農桿菌；轉基因毛狀根；原生質體制備

中圖分類號：Q789 """文獻標識碼：A """"文章編號：1007-0435（2024）05-1583-09

Development of Transgenic Hairy Root Induction and Protoplast

Preparation Systems for Stylosanthes leiocarpa

SUN Hao1，2，3， ZHANG Jian-yu1，2，3， LUO Li-juan1，2*， LIU Pan-dao3*

（1. School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan Province 570228， China; 2. Sanya Institute

Breeding and Multiplication， Hainan University， Sanya， Hainan Province 572025， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources

Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences amp; Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm

Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rual Affairs amp; Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm

Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province， Haikou， Hainan Province 571101， China）

Abstract：The wild species Stylosanthes leiocarpa，belonging to the genus Stylosanthes Sw. is suitable for intercropping in agroforestry systems. As of now，a transgenic system for Stylosanthes leiocarpa has not been established. In this study，cotyledonary nodes of Stylosanthes leiocarpa were used as explants to investigate the effects of different Agrobacterium rhizogenes strains and concentrations of hygromycin B on hairy root induction efficiency and transgenic positivity. The results showed that induction using strain K599 with the addition of 8 mg·L-1 hygromycin B as the selection pressure was the optimal condition，resulting in a hairy root induction efficiency of 23.33% and 100% transgenic positivity. Subsequently，transgenic hairy roots were used to prepare protoplasts，and the optimal conditions for this process were the addition of 2.5% cellulase R-10 and 2% macerozyme R-10，with an enzymatic digestion time of 8 hours. The protoplast yield reached 2.745×105 cells·g-1 and a viability of 91.02%. Notably，all obtained protoplasts were derived from transgenic cells. This study successfully established an Agrobacterium rhizogenes-mediated transgenic hairy root induction system and a protoplast preparation system for Stylosanthes leiocarpa，laying the foundation for further investigation of gene function in this species.

Key words：Stylosanthes leiocarpa;Agrobacterium rhizogenes;Transgenic hairy roots;Protoplast preparation

柱花草屬（Stylosanthes Sw.）系豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionoideae）植物，全屬大約有50個種，起源中心為南美洲［1］。柱花草屬已被馴化并栽培利用的種質資源主要來自圭亞那柱花草（S. guianensis）和西卡柱花草（S. scabra）兩個種，它們具有耐瘠薄土壤、耐旱等優點，是熱帶與亞熱帶地區重要的豆科牧草［2］。柱花草屬資源豐富、形態多樣，該屬許多野生種具有作為牧草和綠肥開發利用的潛力，其中，光果柱花草（S. leiocarpa）具有分枝數多、草層自然高度低、覆蓋度好及根蘗性等特點，可作為綠肥（覆蓋作物）用于林果園間作（圖1）。國內外對光果柱花草的已有研究主要集中于分類學、栽培及利用技術［3］，而對其育種技術研發及新品種培育工作尚處于起步階段。截至目前，仍未有關于光果柱花草轉基因技術體系的研究報道。建立光果柱花草的轉基因技術體系，將為進一步開展該種柱花草的基因功能研究及分子育種奠定基礎。

農桿菌（Agrobacterium）介導的轉基因技術是最常用的植物轉基因方法之一，相較于其它轉基因技術，該技術具有低成本、高效率以及基因重排概率低等特點［4］。用于轉基因的農桿菌主要包括發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）和根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens），兩者均為革蘭氏陰性菌，分別具有Ri質粒和Ti質粒。這兩種農桿菌分別具有誘導植物形成毛狀根和引起植物產生冠癭瘤的能力，主要機制是通過將Ri/Ti質粒上攜帶的T-DNA片段轉移并整合到目標植物基因組中［5］。根癌農桿菌主要用于植物的整株遺傳轉化，而發根農桿菌主要用于誘導產生的轉基因毛狀根。基于發根農桿菌介導的轉基因毛狀根技術具有轉化流程簡便、轉化周期短、轉化效率高等優點［6］。此外，由發根農桿菌介導產生的毛狀根具有可離體生長等特點，因此可被作為一種生物反應器，可用于代謝產物分析、基因功能驗證以及基因編輯等方面［7］。柱花草屬的圭亞那柱花草和細莖柱花草（S. gracilis）已通過發根農桿菌介導建立了轉基因毛狀根體系［8-9］，但截至目前尚未有光果柱花草轉基因體系研究的文獻報道。此外，雖然已有研究利用圭亞那柱花草的葉肉提取原生質體［10］，但利用柱花草轉基因毛狀根制備原生質體的體系尚未建立。

本研究以光果柱花草子葉節作為外植體，比較了4種發根農桿菌菌株對毛狀根誘導率，以及潮霉素B濃度對毛狀根陽性率的影響，旨在建立一種高效的光果柱花草轉基因毛狀根誘導體系。此外，本研究還進一步摸索了利用毛狀根制備原生質體的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 光果柱花草種質材料‘CIAT10105’（圖1），由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所提供。與圭亞那柱花草‘熱研5號’（‘Reyan No.5’）相比，光果柱花草‘CIAT10105’具有分枝數量多、草層自然高度低矮（10～20 cm）、草層覆蓋度好、根蘗性強等特點（圖1），作為綠肥（覆蓋作物）用于林果園間作的利用前景廣闊。

1.1.2 菌株和質粒 發根農桿菌ArQua1，C58C1，K599與MSU440購于上海唯地生物技術有限公司；pCXSN-EGFP質粒由本課題組前期構建并保存。

1.1.3 試劑 潮霉素B（Hygromycin B）購于Biofroxx（德國）公司；纖維素酶（Cellulase R-10）與離析酶（Macerozyme R-10）購于Yakult（日本）公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的選擇和活化 將4種發根農桿菌菌株分別涂布在50 mg·L-1鏈霉素（Streptomycin，Stre）的LB固體培養基上，置于28℃培養箱培養48 h。挑取單克隆菌株接種在50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素（Kanamycin，Kan）的LB液體培養基中，28℃，200 r·min-1培養12 h。取100 μL菌液轉移至10 mL含有Stre和Kan的LB液體培養基，在200 r·min-1的搖床上震蕩培養，使菌液的OD600=0.9，5 000 r·min-1離心10 min，棄上清，使用不含抗生素的LB液體培養基重懸菌體至OD600=0.3，重懸菌液用于侵染光果柱花草的子葉節外植體。

1.2.2 pCXSN-EGFP轉入發根農桿菌 參考上海唯地生物科技有限公司的發根農桿菌感受態轉化方法，將pCXSN-EGFP質粒轉入ArQua1，C58C1，K599與MSU440發根農桿菌中，取100 μL菌液涂布于含有50 mg·L-1Stre和50 mg·L-1 Kan的LB固體培養基上，28℃培養48 h，挑取單克隆菌落，進行PCR鑒定，鑒定出陽性克隆菌落在50 mg·L-1 Stre和50 mg·L-1 Kan的LB液體培養基中培養并保存（圖2）。

1.2.3 外植體的制備及毛狀根的誘導 選取顆粒飽滿的光果柱花草種子，剝去種皮后置于2 mL離心管中加入適量無菌水80℃熱激3 min，在超凈工作臺中吸出無菌水，加入等體積75%乙醇溶液消毒3 min，無菌水沖洗3次，0.1%氯化汞溶液消毒12 min，無菌水沖洗6次。將消毒后的種子鋪在浸滿無菌水的滅菌濾紙上，密封在無菌培養皿中，25℃，12 h·d-1光照條件下吸脹萌發處理2 d。參照趙興坤等人［9］建立的細莖毛狀根轉化方法，待種子萌發并長出下胚軸后，使用無菌手術刀片在子葉節下0.5～1 mm處切去下胚軸，沿下胚軸將兩片子葉節平均分開，利用手術刀片在每片子葉節劃出3個平行傷口，作為發根農桿菌介導轉化的外植體。

將制備好的外植體放入侵染液中浸泡侵染15 min，侵染完成后從侵染液中分離外植體，用無菌濾紙吸干外植體表面多余的侵染液，將外植體置于MS固體培養基上暗培養4 d；待暗培養完成后，利用200 mg·L-1特美汀溶液清洗外植體，最后吸干多余水分將外植體插入誘導培養基（1/2 MS+2%蔗糖+200 mg·L-1特美汀+8 mg·L-1潮霉素B+0.35%植物凝膠Phytagel）中，在25℃，12 h·d-1光照條件下以誘導其生發根。

1.2.4 發根農桿菌及潮霉素B濃度的確定 為了研究不同發根農桿菌和篩選壓濃度對光果柱花草誘導毛狀根誘導率和陽性率的影響，本試驗采用兩因子4×4完全隨機試驗設計，因子1為4種不同的發根農桿菌菌株（ArQua1，C58C1，K599和MSU440）；因子2為誘導培養基篩選壓，即添加不同濃度的潮霉素B（0，4，8和12 mg·L-1）。每個處理3次重復，每個重復20～25個外植體。3周后，統計毛狀根誘導率和轉基因陽性率。使用雙波長便攜式熒光蛋白激發光源（LUYOR-3415RG）觀察發綠色熒光（EGFP）的毛狀根為轉基因陽性毛狀根。計算公式如下：

誘導率=產生毛狀根外植體數量/外植體總數量×100%

陽性率=發綠色熒光毛狀根外植體數量/產生毛狀根外植體數量×100%

1.2.5 轉基因毛狀根的DNA分子鑒定 使用艾科瑞生物有限公司SteadyPure植物基因組DNA提取試劑盒（CTAB法）提取毛狀根DNA，并以此為模板，設計特異性引物（見表1），分別通過PCR擴增以下基因的片段：柱花草的看家基因PTB、發根農桿菌Ri質粒rolB基因、pCXSN-EGFP質粒上的Hyg和EGFP基因，以驗證是否為轉基因毛狀根。

1.2.6 轉基因毛狀根繼代培養 將轉基因毛狀根從誘導培養基中轉移至繼代培養基（1/2 MS+2%蔗糖+0.35%植物凝膠Phytagel）中，25℃黑暗條件下培養。待毛狀根穩定增殖后去除子葉，每7 d更換一次培養基。選擇生長良好的毛狀根，在無菌條件下，用手術刀切割下長約5～7 cm的根尖部分，將其置于新配制的繼代培養基中在相同條件下繼代培養。

1.2.7 毛狀根的原生質體制備 毛狀根繼代培養20 d后，使用滅菌手術刀切取1 g幼嫩的毛狀根轉移至培養皿中，加入0.8 mol·L-1甘露醇溶液，細胞質壁分離1 h后取出；再使用刀片將毛狀根切成約1 mm的切片（如圖2L），隨后移入培養皿中并加入5 mL酶解液（纖維素酶+離析酶+0.6 mol·L-1 甘露醇+10 mmol·L-1 CaCl2+10 mmol·L-1 MgCl2+10 mmol·L-1 MES+1% BSA）使毛狀根充分浸沒，25℃黑暗條件下以75 r·min-1振蕩酶解7～9 h。酶解液配制時將各組分混合后需在55℃水浴10 min，再冷卻至室溫，隨后使用0.22 μm濾膜過濾。酶解結束后，向酶解液中加入5 mL W5溶液（154 mmol·L-1 NaCl+125 mmol·L-1 CaCl2+5 mmol·L-1 KCl+10 mmol·L-1 MES，pH=5.7）以終止酶解。輕搖培養皿釋放原生質體，重復3次通過300目不銹鋼細胞過濾器后，收集原生質體至50 mL離心管，400 g離心3 min，吸取上清，加入500 μLW5溶液重懸原生質體。吸取10 μL至血球計數板，并在光學顯微鏡下計數。通過熒光顯微鏡觀察EGFP熒光信號，以評估其活性。計算公式如下：

1.2.8 毛狀根原生質體最佳酶解條件篩選 本試驗以纖維素酶濃度R-10、離析酶R-10濃度及酶解時間設計了3因素3水平L9（34）正交實驗（如表2），纖維素酶R-10與離析酶R-10濃度均設置為1.5%，2%或者2.5%，酶解時間分別設置為7 h，8 h或者9 h。

1.2.9 數據處理 采用SPSS 27.0和Microsoft office 2022軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同潮霉素B濃度及發根農桿菌菌株對毛狀根誘導的影響

在毛狀根誘導培養基中分別添加0，4，8，12 mg·L-1的潮霉素B為篩選壓，隨著潮霉素B濃度的提高，4種菌株所誘導的毛狀根誘導率均呈現下降趨勢（圖3A）。在不同篩選壓下，菌株C58C1均未能誘導產生陽性的轉基因毛狀根，其余3個菌株誘導的毛狀根陽性率隨潮霉素B濃度的提高呈現上升趨勢（圖3B）。在8 mg·L-1和12 mg·L-1的潮霉素B濃度下，菌株K599和MSU440誘導的毛狀根陽性率均達到100%。其中，菌株K599在8 mg·L-1潮霉素B濃度下的毛狀根誘導率最高（23.33%），且均為陽性（圖3和圖4）。因此，在供試的4個發根農桿菌菌株中，K599是誘導光果柱花草產生轉基因毛狀根的最佳菌株。

不同的菌株對光果柱花草毛狀根的誘導也產生了不同的影響。如圖3B所示，菌株C58C1在添加各濃度潮霉素B的誘導培養基中都無法成功誘導出轉基因毛狀根。潮霉素B濃度為8 mg·L-1時，K599菌株誘導毛狀根誘導率×陽性率=23.33%，顯著高于MSU440的16.67%以及ArQua1的6.67%。這表明發根農桿菌K599是誘導光果柱花草產生毛狀根的最佳菌株。

2.2 轉基因毛狀根的DNA分子鑒定

在綠色熒光蛋白激發光源下，陽性轉基因毛狀根呈現出綠色熒光，而非陽性毛狀根不能發出綠色熒光（圖5）。提取陽性毛狀根的DNA（T1～T4）作為模板，通過PCR檢測PTB，rolB，Hyg和EGFP基因。以野生型柱花草根系DNA（WT）和ddH2O（d）作為陰性對照，轉入pCXSN-EGFP質粒的K599農桿菌液（P）為陽性對照。PCR擴增產物的電泳結果顯示，在WT和T1～T4樣品中檢測到柱花草內參基因PTB的條帶，表明樣品的可靠性。在T1～T4樣品中擴增出rolB，Hyg和EGFP基因的條帶，說明這些基因已成功整合到光果柱花草毛狀根基因組中，為轉基因毛狀根（圖6）。

2.3 毛狀根原生質體制備最佳酶解條件的摸索

根據表2進行了不同纖維素酶和離析酶濃度及酶解時間為因素的正交試驗。結果發現，不同試驗組合均可以分離出有活力原生質體，但各組合分離毛狀根原生質體的產量和活力存在顯著差異（表3）。根據極差（R值）結果，酶解時間（R=0.858）對毛狀根原生質體產量的影響最大，而纖維素酶（R=0.439）和離析酶（R=0.428）的濃度對原生質體產量的影響較小且相近。纖維素酶和離析酶的最佳濃度均為2.5%；隨著酶解時間的增加，原生質體產量呈先增大后減小的趨勢，酶解時間在8 h時達到最佳產量（表3）。酶解時間（R=27.193）對毛狀根原生質體活力的影響最大，離析酶（R=9.122）的濃度也對原生質體活力有較大影響，而纖維素酶（R=3.266）對原生質體活力的影響最小，最佳濃度為2.5%。隨著離析酶濃度和酶解時間的增加，原生質體活力呈先增大后減小的趨勢，分別在2%和8 h時達到最佳活力（表3）。

根據正交試驗結果和原生質體產量和活力的均值乘積（k1×l1），光果柱花草原生質體制備的最佳酶解條件是正交試驗組合7［纖維素酶濃度2.5%（水平3），離析酶濃度2%（水平2），酶解時間8 h（水平2）］。此時原生質體產量為2.745×105個·g-1，原生質體活力為91.02%（表3和圖7）。

3 討論

發根農桿菌介導的轉基因體系操作簡單，高效快捷，因此已在多種植物被用于誘導轉基因毛狀根［11］。發根農桿菌種類、外植體類型、發根農桿菌菌液濃度以及培養環境等因素都會對毛狀根的誘導產生影響。在選擇菌株時，需要考慮植物物種的差異，并進行菌株篩選試驗以確保最佳效果［12］。因此，本研究比較了4個發根農桿菌菌株誘導光果柱花草產生轉基因毛狀根的效果，發現在添加8 mg·L-1潮霉素B的誘導培養基上，菌株K599是誘導毛狀根的最佳菌株（圖3）。而此前本課題組已建立的細莖柱花草毛狀根體系中［9］，菌株K599不能誘導細莖柱花草產生轉基因毛狀根。這表明對于柱花草屬兩個不同種，能誘導它們產生轉基因毛狀根的菌株存在差異，這可能與不同菌株的侵染性、生長速度及Ri質粒的多樣性有關［12］。

篩選壓是保證毛狀根陽性率的關鍵因素，其中潮霉素B相較于其他抗生素類和除草劑類篩選劑具有篩選時間短和假陽性率低等優點［13］。本研究在毛狀根誘導培養基中添加不同濃度的潮霉素B作為篩選壓，結果發現，在潮霉素B濃度為8 mg·L-1和12 mg·L-1的條件下，菌株K599和MSU440誘導的毛狀根陽性率均達到100%，但是12 mg·L-1潮霉素B會導致毛狀根誘導率顯著降低（圖3）。因此，培養基中添加8 mg·L-1潮霉素B是誘導轉基因毛狀根的最佳篩選壓。豆科植物中大豆［14］、紫花苜蓿［15］已建立了以潮霉素B作為篩選壓的毛狀根轉基因體系。在大豆中，20 mg·L-1潮霉素B是子葉為外植體誘導毛狀根體系的最佳篩選壓；而在紫花苜蓿中，使用5～8 mg·L-1潮霉素B篩選以葉片為外植體誘導的毛狀根。這種篩選壓濃度差異可能與不同植物物種以及外植體類型對潮霉素B的耐受度不同有關。

原生質體是指細胞壁被酶或機械去除的植物細胞，是一種可用于基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和合成生物學研究的多功能系統［16-17］。此外，原生質體還可以用于候選基因的功能研究，如亞細胞定位、體內蛋白質-蛋白質相互作用驗證、代謝產物分析、CRISPR/Cas9基因編輯系統的瞬時表達等［18-22］。原生質體制備受多種因素的影響，如酶的濃度、滲透壓、酶解時間以及離心速率等［23］。根據本研究結果，酶解時間是影響光果柱花草轉基因毛狀根制備原生質體產量和活力的最重要因素，這可能與其原生質體大小相關。本課題組之前已建立圭亞那柱花草利用子葉制備原生質體的體系，其最佳酶解時間為16 h，獲得的原生質體大小約為20 μm［10］。而本研究利用光果柱花草轉基因毛狀根制備原生質體的最佳酶解時間為8 h（表3），原生質體小于10 μm（圖7）。相對于圭亞那柱花草子葉原生質體，光果柱花草毛狀根原生質體更小，需降低酶解時間，以防止由于酶解時間過長導致原生質體的結構被破壞。此外，利用圭亞那柱花草子葉制備原生質體的最佳纖維素酶濃度為1.5%，離析酶濃度為1.25%［10］。而本研究利用光果柱花草毛狀根制備原生質體的最佳條件為2.5%纖維素酶和2%離析酶（表3），這可能是由于毛狀根中的細胞結構更為致密，需要更高的酶濃度。與利用非轉基因柱花草子葉制備原生質體的產量（4.56×106個·g-1）及活力（92.27%）［10］相比，利用轉基因毛狀根制備原生質體的產量（2.745×105個·g-1）及活力（91.02%）（表3）相對較低。但是，本研究基于轉基因毛狀根制備的原生質體100%為轉基因細胞，利用該體系分析候選基因功能更具優勢。

4 結論

本研究建立了一種發根農桿菌介導的光果柱花草轉基因毛狀根體系，在最優菌株K599誘導和最佳篩選壓8 mg·L-1潮霉素B條件下，誘導率為23.33%，陽性率達100%。同時，本研究還建立了一種利用轉基因毛狀根制備原生質體的體系，在2.5%纖維素酶、2%離析酶及8 h酶解時間的條件下，可以獲得最高的原生質體產量和活力。

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2024-01-13；修回日期：2024-03-21

基金項目：海南省自然科學基金項目（No. 323CXTD387;No. 322RC771）；國家自然科學基金面上項目（No. 32371769）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項（No. 1630032022023）資助

作者簡介：

孫昊（1999-），男，漢族，河南安陽人，碩士研究生，主要從事熱帶牧草轉基因技術研究，E-mail：sunh0713@163.cm；*通信作者 Author forcorrespondence，E-mail：liupandao@foxmail.com；luoljd@126.com