青海草原毛蟲(chóng)IR基因的鑒定及組織表達(dá)分析

摘要：本研究利用生物信息學(xué)分析及qRT-PCR技術(shù)，對(duì)GqinIRs基因進(jìn)行鑒定及表達(dá)譜分析。本研究共鑒定出12個(gè)GqinIRs基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)青海草原毛蟲(chóng)IRs屬于兩性蛋白，除GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR75a、GqinIR76b都具有信號(hào)肽，具有2～4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，二三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲組成；系統(tǒng)進(jìn)化表明青海草原毛蟲(chóng)IR與東方黏蟲(chóng)和疆夜蛾親緣關(guān)系較近。基因表達(dá)譜分析表明，鑒定的青海草原毛蟲(chóng)12個(gè)IR基因在雌雄不同組織體現(xiàn)不同的表達(dá)水平（Plt;0.05）。本研究為進(jìn)一步研究青海草原毛蟲(chóng)離子型受體蛋白對(duì)外界氣味分子的識(shí)別及反應(yīng)機(jī)制提供重要依據(jù)，并且為深入研究青海草原毛蟲(chóng)嗅覺(jué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青海草原毛蟲(chóng)；離子型受體；生物信息學(xué)分析；表達(dá)譜分析

中圖分類號(hào)：S968.1""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）05-1392-09

Identification and Expression Profiling of Ionotropic receptors Gene in

Gynaephora qinghaiensis （Lepidoptera：Lymantriidae）

LIU Zhan-ling， KOU Gui-xiang， NAN Yan-bin， WANG Ke-xing， ZHOU Yuan-tao*

（College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：In this study，based on the transcriptome data of Gynaephora qinghaiensis，bioinformatics methods and qRT-PCR technology were used to identify and analyze the expression profiling of GqinIRs genes. In this study，a total of 12 GqinIRs genes were identified，and bioinformatics analysis showed that the IRs of Gynaephora qinghaiensis belonged to amphoteric proteins，except for GqinIR7，GqinIR8a，GqinIR10a，GqinIR75a，and GqinIR76b，all of them had signal peptides and 2～4 transmembrane domains，and the second- and third-order structures were mainly composed of α helix and random coils. Phylogenetic results showed that the IR of Gynaephora qinghaiensis was closely related to Oriental armyworm and Spodoptera exigua. Gene expression profile analysis showed that the relative expression levels of the 12 IR genes in different tissues of Gynaephora qinghaiensis were different，and the GqinIR6 gene was basically not expressed in the antennae of the male，while the remaining 11 GqinIRs genes were expressed in the antennae of the male，while their expression levels were different （Plt;0.05）. This study provides an important basis for further study of the recognition and response mechanism of ionotype receptor proteins of Gynaephora qinghaiensis to external odor molecules，and lays a foundation for further research on the olfactory mechanism of Gynaephora qinghaiensis.

Key words：Gynaephora qinghaiensis;Ionotropic receptors;Bioinformatics analysis;Expression profile analysis

離子型受體（Ionotropic receptors，IRs）是Benton等［1］首次在果蠅（Drosophila）中鑒定出來(lái)的一種新的化學(xué)感覺(jué)受體，在與配體結(jié)合的離子通道過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其含有一個(gè)胞外N端、離子型區(qū)和2個(gè)裂片［2］，2009年，Benton等［3］首次在黑腹果蠅中鑒定出了66個(gè)離子型受體［3］。隨后，在其他昆蟲(chóng)體內(nèi)陸續(xù)鑒定出離子型受體，例如在蘋(píng)果蠹蛾中鑒定出15個(gè)離子型受體基因［4］，海灰翅夜蛾鑒定出12個(gè)離子型受體基因［5］，在棉鈴蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了19個(gè)離子型受體基因等［6］。根據(jù)基因生物信息學(xué)和功能分析，IRs基因家族可被分為三個(gè)亞家族：分化離子型受體（Divergent IRs）、嗅覺(jué)離子型受體（Olfactory IRs）和共表達(dá)離子型受體（Co-receptor IRs）。嗅覺(jué)離子型受體亞家族中大多數(shù)在雌雄不同組織中不表達(dá)或微量表達(dá)，但通常在觸角中特異表達(dá)，因此該亞家族也被稱為觸角IRs（antennal IRs），序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種昆蟲(chóng)中都有觸角IRs的同源基因，基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)其在觸角中特異表達(dá)，表明這些基因在進(jìn)化上比較保守；分化IRs在觸角中幾乎不表達(dá)，一些研究表明，分化IRs可能與味覺(jué)有關(guān)［7］；共表達(dá)IRs（IR25a和IR8a）廣泛存在于觸角腔錐形感器的神經(jīng)元中，與嗅覺(jué)IRs共表達(dá)［8］。早期研究已證實(shí)，昆蟲(chóng)IR可作為酸、胺等揮發(fā)性物質(zhì)的受體，并參與包括溫度、濕度感受和味覺(jué)感受等嗅覺(jué)以外的感受［9］。IRs參與嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能還需要進(jìn)一步研究，目前，主要利用qRT-PCR技術(shù)研究基因的表達(dá)與定位［10］，

青海草原毛蟲(chóng)（Gynaephora qinghaiensis）屬鱗翅目（Lepidoptera）毒蛾科（Lymantriidae）草原毛蟲(chóng)屬（Gynaephora），俗稱紅頭黑毛蟲(chóng)［11］，目前，研究發(fā)現(xiàn)在亞洲分布種類較多，有13種，其中8種分布在中國(guó)且都是青藏高原特有種［12］。青海主要分布在海晏、天俊、澤庫(kù)、瑪多、治多、雜多、祁連和門(mén)源等地方［13］。草原毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)以頭殼寬度為依據(jù)可分為7個(gè)齡期［14］，雌雄成蟲(chóng)形態(tài)具有較大差異，雌成蟲(chóng)的胸足、翅以及觸角退化［15］。青海草原毛蟲(chóng)是高寒草甸常見(jiàn)草食性害蟲(chóng)［16］，幼蟲(chóng)對(duì)人畜安全、草地生態(tài)結(jié)構(gòu)造成影響［17］，為害時(shí)蟲(chóng)口密度大，發(fā)生面積廣，危害程度嚴(yán)重［18］。此外，有研究報(bào)道青海草原毛蟲(chóng)對(duì)強(qiáng)紫外輻射、缺氧以及嚴(yán)寒等極端惡劣環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)能力、繁殖能力強(qiáng)，且幼蟲(chóng)背部具有毒腺，可導(dǎo)致家畜和人過(guò)敏，因而防治困難［19］。目前，已有一些有關(guān)鱗翅目昆蟲(chóng)離子型受體基因的研究報(bào)道［20］，未見(jiàn)對(duì)青海草原毛蟲(chóng)離子型受體基因的研究。嗅覺(jué)系統(tǒng)在介導(dǎo)昆蟲(chóng)行為過(guò)程中起主導(dǎo)作用，昆蟲(chóng)的IRs參與嗅覺(jué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可為害蟲(chóng)的綠色防治提供新思路［21］。本研究利用青海草原毛蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選并基于同源序列命名青海草原毛蟲(chóng)IRs基因，通過(guò)生物信息學(xué)方法分析GqinIRs基因的理化性質(zhì)、二三級(jí)結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)發(fā)育情況；并基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析GqinIRs基因在雌雄成蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究青海草原毛蟲(chóng)離子型受體基因功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

2023年6月在青海省海北州海晏縣采集青海草原毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)，于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)幼蟲(chóng)至羽化出雌雄成蟲(chóng)，解剖雌雄各30只成蟲(chóng)并收集雌雄成蟲(chóng)的頭、胸、腹以及雄蟲(chóng)觸角（雌成蟲(chóng)觸角退化），共7個(gè)樣品，每個(gè)樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)包含10只成蟲(chóng)組織，標(biāo)記樣品并立即用液氮速凍保存至-80℃冰箱中備用。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

提取各樣品（7個(gè)組織）總RNA（Trizol法）并利用分光光度計(jì)分別檢測(cè)各組織RNA純度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）（Beijing Solarbio Science）將RNA純度在合格范圍（OD260 nm/OD280 nm為1.8～2.2）內(nèi)的樣品合成cDNA并保存于-20℃冰箱備用。

1.3 設(shè)計(jì)并合成引物

從青海草原毛蟲(chóng)雌雄成蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選獲得GqinIRs基因序列，采用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物并委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，內(nèi)參基因（RPS15）引物來(lái)自于蘭州大學(xué)昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室。

1.4 GqinIRs序列獲取

在青海草原毛蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中，進(jìn)行查找（以“IR”和“Ionotropic”為關(guān)鍵詞）并篩選出候選離子型受體基因序列，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLASTn比對(duì)（設(shè)定相似性大于60%）得到相似物種，采用在線網(wǎng)站ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)篩選出的GqinIRs序列進(jìn)行預(yù)測(cè)得到ORF完整的氨基酸和核苷酸序列。

1.5 GqinIRs的生物信息學(xué)分析

采用在線網(wǎng)站ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析GqinIRs生物信息學(xué)，如相對(duì)分子量、等電點(diǎn)、正負(fù)殘基數(shù)、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)，總平均疏水性等；運(yùn)用Signalp4.1Server（http：//cbs.dtu.dk/services/Signalp/）預(yù)測(cè)GqinIRs信號(hào)肽；采用在線網(wǎng)站TMHMM2.0對(duì)GqinIRs進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測(cè)；采用在線網(wǎng)站SOPMA（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/secpred＿sopma.pl）對(duì)GqinIRs二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）對(duì)GqinIRs三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)0。使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，包括來(lái)自青海草原毛蟲(chóng)12條IRs，疆夜蛾（Peridroma saucia）10條IRs，棉鈴蟲(chóng)（Melitaea cinxia）9條IRs，煙青蟲(chóng)（Lobesia botrana）6條IRs，草地貪夜蛾（Trichoplusia ni）、斜紋夜蛾（Bicyclus anynana）、東方黏蟲(chóng)（Vanessa cardui）各2條IRs，網(wǎng)蛺蝶（Helicoverpa armigera）、歐洲葡萄蛾（Helicoverpa assulta）、粉蚊夜蛾（Spodoptera frugiperda）、偏瞳蔽眼蝶（Manduca sexta）、小紅蛺蝶（Achelura yunnanensis）、煙草天蛾（Spodoptera litura）、云南錦斑蛾（Mythimna separata）、黃野螟（Heortia vitessoides）各1條IR。采用NJ法，用JTT模型，方法采用NNI（nearest-neighbor-interchang），自展支持率（bootstrap）1 000次重復(fù)。

1.6 GqinIRs的qPCR檢測(cè)

以合成的cDNA樣品（雄雄成蟲(chóng)的頭、胸、腹以及雄成蟲(chóng)觸角）為模板，7個(gè)樣品各含3次生物學(xué)重復(fù)，每次生物學(xué)重復(fù)取3次技術(shù)重復(fù)。擴(kuò)增體系（20 μL）：正反引物各0.8 μL，Master Mix 10 μL，ddH2O 7.4 μL和cDNA模板1 μL。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI7500型）中進(jìn)行反應(yīng)，PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性1 min、95℃變性15 s、退火（退火溫度60℃）15 s、72℃ 45 s，40次循環(huán)。每個(gè)基因在雌雄成蟲(chóng)的各組織中以雄成蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量為對(duì)照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

GqinIRs基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量以在雄蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量作為對(duì)照用2-ΔΔCt值法計(jì)算，數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和顯著性差異檢驗(yàn)（LDS），同時(shí)使用軟件Graphpad prism進(jìn)行T檢驗(yàn)（Plt;0.05）并繪制組織表達(dá)譜。雌雄間表達(dá)量差異利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海草原毛蟲(chóng)IRs的生物信息學(xué)分析

在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選出青海草原毛蟲(chóng)12個(gè)IRs（表2）。基于來(lái)自疆夜蛾（P. saucia）、東方黏蟲(chóng)（M. separata）、棉鈴蟲(chóng)（H. armigera）同源序列，命名為GqinIR1、GqinIR2、GqinIR3、GqinIR4、GqinIR5、GqinIRIR6、GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR75a、GqinIR76b。經(jīng)過(guò)ORFfinder與NCBI Blastp驗(yàn)證，GqinIRs核苷酸長(zhǎng)度為564～3 159 bp。采用在線網(wǎng)站SignaIP4.1預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，結(jié)果表明青海草原毛蟲(chóng)12個(gè)GqinIRs中7個(gè)GqinIRs具有16-19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；采用在線網(wǎng)站TMHMM2.0對(duì)GqinIRs進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測(cè)，結(jié)果表明GqinIR10a、GqinIR75a具有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，GqinIRIR4、GqinIR7具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其余GqinIR均具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與該基因的典型結(jié)構(gòu)特征相吻合。將GqinIRs與其他昆蟲(chóng)序列進(jìn)行相似性比較，GqinIR1基因與亞洲玉米螟（O. furnacalis）基因序列（GenBank登錄號(hào)為BAR64795.1）、GqinIR7基因與疆夜蛾（P. saucia）基因序列（GenBank登錄號(hào)為QHB15340.1）、GqinIR6基因與疆夜蛾（P. saucia）基因序列（GenBank登錄號(hào)為QHB15336.1）、GqinIR25a基因與疆夜蛾（P. saucia）基因序列（GenBank登錄號(hào)為QHB15318.1）相似度分別為97.02%，96.03%，95.57%，90.79%，相似度均為90%以上，其余GqinIRs基因與其他鱗翅目昆蟲(chóng)物種相似性均高于60%，表明GqinIRs與這些鱗翅目昆蟲(chóng)序列可能同源。

2.2 青海草原毛蟲(chóng)IRs理化性質(zhì)分析

青海草原毛蟲(chóng)離子型受體蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果表明：氨基酸長(zhǎng)度在319～1 052 aa之間，相對(duì)分子量在35～116kD之間。脂肪系數(shù)較高，12個(gè)IRs均為熱穩(wěn)定性蛋白。GqinIR2、GqinIR3、GqinIR4、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a等電點(diǎn)位于4～6之間（偏酸性蛋白）；GqinIR6、GqinIR7、GqinIR75a、GqinIR76b等電點(diǎn)位于8～10之間（偏堿性蛋白）；GqinIR1、GqinIR5等電點(diǎn)在6～7之間（弱酸性蛋白）。GqinIR正電荷殘基數(shù)目在22～117之間，負(fù)電荷殘基數(shù)目在34～151之間。GqinIR1-7，GqinIR76b不穩(wěn)定系數(shù)大于40（蛋白性質(zhì)不穩(wěn)定）。GqinIRs的總平均疏水性都介于-0.5～0.5之間（兩性蛋白）［22］。

2.3 青海草原毛蟲(chóng)IRs的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

GqinIRs二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)青海草原毛蟲(chóng)IRs主要由α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。除GqinIR7和GqinIR76b二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，分別占主要組成部分的42.02%和42.39%，其余GqinIRs二級(jí)結(jié)構(gòu)α螺旋是主要組成部分，且所占比例均在40%以上，其中GqinIR75a α螺旋含量最高，為47.29%，12個(gè)GqinIRs的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β折疊和延伸鏈所占比例較少。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)α螺旋是GqinIRs的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成部分，并維持三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

2.4 青海草原毛蟲(chóng)IRs的系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用12個(gè)GqinIRs和篩選出的其他14種鱗翅目昆蟲(chóng)的39個(gè)IR氨基酸序列用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示所有的GqinIRs都與鱗翅目昆蟲(chóng)IRs聚到一起，但在整個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)中分布比較分散（圖3），其中GqinIR8a與PsauIR8a、HarmIR8a、SlitIR8a聚在同一進(jìn)化枝；GqinIR10a與MsepIR10a在同一小組，置信值為95；GqinIR25a與其他昆蟲(chóng)（Psau、Hass、Slit）的IR25a聚在一起；GqinIR75a與HarmIR75a、SfruIR75a聚在同一進(jìn)化枝；GqinIR76b與HvitIR76b、PsauIR76b、HassIR76b聚在同一進(jìn)化枝；GqinIR10a與MsepIR10a、GqinIR6與PsauIR3聚在同一小組，置信值為89、GqinIR1與PsauIR4在同一小組，因此推測(cè)青海草原毛蟲(chóng)IRs與疆夜蛾（P. saucia）以及東方黏蟲(chóng)（M.separata）親緣關(guān)系最近。

2.5 青海草原毛蟲(chóng)IR基因的組織表達(dá)譜分析

本研究通過(guò)RT-qPCR技術(shù)研究GqinIRs基因在青海草原毛蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)水平（以雄蟲(chóng)觸角作為陽(yáng)性對(duì)照），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GqinIRs基因在雌雄不同組織中的表達(dá)量呈現(xiàn)不同水平，除GqinIR6基因之外，其余11個(gè)GqinIRs基因在雄蟲(chóng)觸角中均有表達(dá)，其中：GqinIR3、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR75a基因在雄成蟲(chóng)觸角顯著表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于其他組織（Plt;0.05），推測(cè)這些基因?yàn)橛|角IRs；GqinIR1、GqinIR2、GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a等基因在雄蟲(chóng)頭部顯著表達(dá)，其表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)頭部，GqinIR4、GqinIR5基因在雌蟲(chóng)頭部顯著表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量顯著高于雄蟲(chóng)頭部，而GqinIR3、GqinIR75a、GqinIR76b基因在雌雄成蟲(chóng)頭部的表達(dá)無(wú)顯著差異（Plt;0.05）。此外，GqinIR1、GqinIR2、GqinIR4、GqinIR8a、GqinIR75a基因在雌雄成蟲(chóng)胸部幾乎不表達(dá)或微量表達(dá)，而GqinIR3、GqinIR5、GqinIR7、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR76b基因在雌雄成蟲(chóng)的胸部表達(dá)存在顯著差異，其中GqinIR3、GqinIR5呈現(xiàn)雌性偏好表達(dá)模式，GqinIR7、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR76b則呈現(xiàn)雄性偏好模式（Plt;0.05）；GqinIR1、GqinIR3、GqinIR5、GqinIR10a基因在雌雄成蟲(chóng)腹部幾乎不表達(dá)或微量表達(dá)，而GqinIR2、GqinIR4、GqinIR7、GqinIR8a、GqinIR25a、GqinIR75a、GqinIR76b基因在雌雄成蟲(chóng)腹部的表達(dá)存在顯著差異，其中GqinIR8a、GqinIR25a基因呈現(xiàn)雌性偏好表達(dá)模式，而GqinIR2、GqinIR4、GqinIR7、GqinIR75a、GqinIR76b基因呈現(xiàn)雄性偏好表達(dá)模式（Plt;0.05）（圖4）。

3 討論

本研究共篩選并鑒定出12個(gè)GqinIRs基因，其數(shù)目多于棉鈴蟲(chóng)（6個(gè)IRs）［23］，少于小菜蛾（16個(gè)IRs）［20］、斜紋夜蛾（45個(gè)IRs）［24］、茶古蛾（25個(gè)IRs）［25］。青海草原毛蟲(chóng)GqinIR1-6都具有信號(hào)肽。跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，GqinIRs均具有2-4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這與小菜蛾［20］、稻飛虱［26］IRs預(yù)測(cè)結(jié)果一致。二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，GqinIRs二、三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋以及無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，并維持GqinIRs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因?yàn)闊o(wú)規(guī)則卷曲空間結(jié)構(gòu)易于發(fā)生改變，而α螺旋和β折疊空間結(jié)構(gòu)不易發(fā)生改變［27］。GqinIRs與其他昆蟲(chóng)序列相似性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析表明GqinIR1～GqinIR7與疆夜蛾（P. saucia）、草地貪夜蛾（S. frugiperda）等蛾類相似度在67.26～97.02%之間，同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)GqinIRs也與這幾個(gè)物種聚在同一進(jìn)化枝；GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR25a、GqinIR75a、GqinIR76b與疆夜蛾（P. saucia）、草地貪夜蛾（S. frugiperda）、斜紋夜蛾（S. litura）、東方黏蟲(chóng)（M. separata）等物種的IR8a、IR10a、IR25a、IR75a、IR76b分別聚集在同一進(jìn)化小枝，這些結(jié)果說(shuō)明符合青海草原毛蟲(chóng)IRs命名規(guī)則。GqinIRs與其他鱗翅目昆蟲(chóng)物種相似性均高于60%，推測(cè)GqinIRs與這些鱗翅目昆蟲(chóng)序列可能同源。GqinIR8a與GqinIR25a聚在同一進(jìn)化枝上，推測(cè)GqinIR8a與GqinIR25a為GqinIRs共受體［28］；GqinIR10a與MsepIR10a、GqinIR6與PsauIR3、GqinIR1與PsauIR4在同一小組，因此推測(cè)青海草原毛蟲(chóng)IRs與疆夜蛾（P. saucia）以及東方黏蟲(chóng)（M. separata）親緣關(guān)系最近；大部分GqinIRs與疆夜蛾（P. saucia）、棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）、煙青蟲(chóng)（H. assulta）聚在同一進(jìn)化枝，表明這些物種的IRs基因可能擁有共同祖先。

利用qRT-PCR技術(shù)分析GqinIRs在青海草原毛蟲(chóng)各個(gè)組織中的表達(dá)情況，進(jìn)而推測(cè)GqinIRs功能，結(jié)果表明：GqinIRs基因在雌雄不同組織中呈現(xiàn)不同表達(dá)水平（Plt;0.05），除GqinIR6基因之外，其余11個(gè)在雄蟲(chóng)觸角中均有表達(dá)，推測(cè)這些IRs基因在雄蟲(chóng)定位雌蟲(chóng)，求偶和交配過(guò)程中發(fā)揮不同的作用［23］。GqinIR3、GqinIR75a、GqinIR76b基因在雌雄成蟲(chóng)頭部的表達(dá)無(wú)顯著差異，這與孔暢儀對(duì)小菜蛾的研究結(jié)果一致［20］，推測(cè)這些基因在功能上較為保守。青海草原毛蟲(chóng)中GqinIR3、GqinIR8a、GqinIR10a、GqinIR75a基因在雄成蟲(chóng)觸角的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他組織（Plt;0.05），從黑腹果蠅檢測(cè)出66個(gè)IRs基因中16個(gè)特異性表達(dá)于觸角［4］；從斜紋夜蛾（S. litura）觸角檢測(cè)出了12個(gè)IRs、蘋(píng)果蠹蛾（C. pomonella）觸角檢測(cè)出15個(gè)IRs、棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）觸角中也檢測(cè)出了12個(gè)IRs基因［4］，推測(cè)這些IR為觸角IR。在觸角特異表達(dá)的IRs可能對(duì)酸類和胺類等物質(zhì)的感受中發(fā)揮重要作用［9］，并且具有影響交配行為、適應(yīng)性進(jìn)化、味覺(jué)識(shí)別及生物鐘調(diào)節(jié)等功能［29］，推測(cè)在青海草原毛蟲(chóng)觸角特異表達(dá)的IRs同樣能夠感受環(huán)境中丁酸和丙酸等酸類氣味物質(zhì)，并且具有影響交配行為、適應(yīng)性進(jìn)化、味覺(jué)識(shí)別及生物鐘調(diào)節(jié)的功能［30-31］。GqinIR1、GqinIR5在雌雄頭部的表達(dá)量較高，可能這些基因與昆蟲(chóng)味覺(jué)、嗅覺(jué)以及溫濕度的感受有關(guān)［23］。昆蟲(chóng)利用背側(cè)器官中高度敏感的溫度感覺(jué)細(xì)胞感受環(huán)境中的溫度變化，在果蠅幼蟲(chóng)的溫度感覺(jué)細(xì)胞中檢測(cè)到的離子型受體能夠感受寒冷的環(huán)境從而避免極端溫度的傷害［32］。本研究發(fā)現(xiàn)GqinIR7、GqinIR76b在雄蟲(chóng)胸部中顯著表達(dá)，推測(cè)這兩個(gè)基因可能借助背部的溫度感覺(jué)細(xì)胞在青海草原毛蟲(chóng)感知外界溫度變化中發(fā)揮重要作用［32］。IRs通過(guò)一個(gè)激活的途徑參與促進(jìn)強(qiáng)烈的嗅覺(jué)行為［33］。苯乙酸和苯乙醛等揮發(fā)性氣味物質(zhì)可以激活I(lǐng)R受體神經(jīng)元，進(jìn)而影響求偶和交配的行為［34-35］，GqinIR2、GqinIR4、GqinIR25a在腹部的表達(dá)量較高，推測(cè)這些IR的受體神經(jīng)元能通過(guò)作為環(huán)境催情劑的苯乙醛激活進(jìn)而在雄蟲(chóng)求偶中發(fā)揮重要作用［33］。基于青海草原毛蟲(chóng)IRs基因在不同組織中表述情況所推測(cè)的IRs功能，表明離子型受體在青海草原毛蟲(chóng)的生殖發(fā)育和嗅覺(jué)機(jī)制中具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)方法及qRT-PCR技術(shù)，對(duì)GqinIRs基因進(jìn)行鑒定及表達(dá)譜分析，鑒定的青海草原毛蟲(chóng)IRs與疆夜蛾（P. saucia）以及東方黏蟲(chóng)（M. separata）親緣關(guān)系最近，與草地貪夜蛾（S. frugiperda）、斜紋夜蛾（S. litura）、棉鈴蟲(chóng)（H.armigera）煙青蟲(chóng)（H. assulta）等參與建樹(shù)的鱗翅目昆蟲(chóng)的IRs基因可能擁有共同祖先。青海草原毛蟲(chóng)12個(gè)IRs基因在雌雄不同組織體現(xiàn)不同的表達(dá)水平（Plt;0.05）。本研究通過(guò)對(duì)GqinIRs表達(dá)譜進(jìn)行分析，推測(cè)IRs功能，為進(jìn)一步研究青海草原毛蟲(chóng)離子型受體蛋白對(duì)外界氣味分子的識(shí)別及反應(yīng)機(jī)制提供重要依據(jù)，同時(shí)為深入研究青海草原毛蟲(chóng)嗅覺(jué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-12-20；修回日期：2024-01-22

基金項(xiàng)目：青海省科技廳青年基金項(xiàng)目；草原毛蟲(chóng)嗅覺(jué)感受分子機(jī)理的研究（2022-ZJ-949Q）資助

作者簡(jiǎn)介：

劉占玲（2000-），女，漢族，青海西寧人，碩士研究生，主要從事昆蟲(chóng)化學(xué)生態(tài)學(xué)研究，E-mail： liu20000607ling@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail： ZhouYT@qhu.edu.cn