β-谷甾醇對結腸癌細胞HCT116增殖和凋亡的影響

[摘要]"目的"探究β-谷甾醇對結腸癌細胞HCT116增殖和凋亡的影響及其對磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，PKB，又稱Akt）信號通路的調控作用。方法"體外培養結腸癌細胞HCT116并分為β-谷甾醇高（240μmol/L）、中（120μmol/L）、低劑量（60μmol/L）組，設置空白對照組（0μmol/L）。應用不同濃度的β-谷甾醇處理HCT116細胞。24h后應用細胞計數試劑盒8（cell"counting"kit-8，CCK-8）法檢測β-谷甾醇對HCT116細胞增殖的影響，并在顯微鏡下觀察細胞的形態變化；應用Hoechst"33342細胞核染色法檢測β-谷甾醇對HCT116細胞凋亡的影響；應用細胞克隆集落形成實驗檢測HCT116細胞的集落形成能力；應用蛋白質印跡技術檢測HCT116細胞中PI3K、磷酸化Akt、Akt、抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bax等相關蛋白的表達情況；利用AutoDock軟件實現β-谷甾醇與PI3K和Akt蛋白的分子對接。結果"與對照組比較，β-谷甾醇可濃度依賴性地抑制結腸癌細胞HCT116的增殖，抑制細胞的集落形成能力，促進細胞的凋亡；抑制HCT116細胞中磷酸化Akt、PI3K、Bcl-2蛋白的表達，促進Bax蛋白的表達；β-谷甾醇與PI3K、Akt蛋白的結合均較為穩定。結論"β-谷甾醇可通過抑制PI3K/Akt信號通路調節HCT116細胞的增殖與凋亡。

[關鍵詞]"β-谷甾醇；結腸癌；增殖；凋亡；信號通路

[中圖分類號]"R285""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.09.019

Effects"of"β-sitosterol"on"proliferation"and"apoptosis"of"colon"cancer"cell"HCT116

CHEN"Xi，"LI"Ruonan，"LI"Jing，"ZHAO"Lina，"XU"Zhili

College"of"Pharmacy，"Liaoning"University"of"Traditional"Chinese"Medicine，"Dalian"116600，"Liaoning，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"effects"of"β-sitosterol"on"the"proliferation"and"apoptosis"of"colon"cancer"cell"HCT116，"and"its"regulation"of"on"phosphoinositide"3-kinase/protein"kinase"B"（PI3K/Akt）"signaling"pathway."Methods"Cultivated"colon"cancer"cells"HCT116"in"vitro"and"divided"them"into"β-sitosterol"High"（240μmol/L）、medium"（120μmol/L）"and"low-dose"（60μmol/L）"groups，"set"control"group"（0μmol/L）."Applied"different"concentrations"of"β-sitosterol"treatment"of"HCT116"cells."And"24h"later，"the"cell"proliferation"and"activity"were"determined"by"cell"counting"kit-8"（CCK-8）"method，"the"morphological"changes"observed"under"a"microscope;"Cell"apoptosis"was"observed"by"Hoechst"33342"nuclear"staining;"Used"cell"colony"formation"assy"to"detect"the"colony"forming"ability"of"HCT116"cells;"and"Western"blot"was"used"to"evaluate"the"expression"of"PI3K，"p-Akt，"Akt，"Bcl-2"and"Bax"in"cells."Used"AutoDock"software"for"molecular"docking"of"β-sitosterol"with"Akt"and"PI3K."Results"Compared"with"the"control"group，"β-sitosterol"could"inhibit"the"proliferation"of"colon"cancer"HCT116"cells"in"a"concentration"dependent"manner"，inhibit"their"colony"forming"ability"and"promote"cell"apoptosis"and"inhibit"the"expression"of"p-Akt、"PI3K、and"Bcl-2"proteins"in"HCT116"cells"and"promotes"the"expression"of"Bax"protein."The"binding"of"β-sitosterol"with"PI3K"and"Akt"proteins"is"relatively"stable."Conclusion"β-sitosterol"may"regulate"the"proliferation"and"apoptosis"of"HCT116"through"inhibiting"PI3K/Akt"signaling"pathway.

[Key"words]"β-sitosterol;"Colon"cancer;"Proliferation;"Apoptosis;"Signaling"pathway

結腸癌（colon"cancer，CRC）是全球第3大高發腫瘤，其患病率和病死率逐年增加[1]。據估計，2030年全球新發CRC患者將增至220萬例[2]。目前，手術治療、化療、免疫治療等在CRC的臨床診治中獲得較好效果，但腫瘤復發、轉移或產生嚴重并發癥的風險仍較高。而中醫藥相關研究與藥物研發成為CRC臨床和基礎研究的熱點之一。

β-谷甾醇呈白色粉末狀，多種中藥材可分離出β-谷甾醇，其分子式為C29H50O[3-4]。多項研究發現，β-谷甾醇具有抑制多種類型腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡的活性，如卵巢癌、結腸癌、前列腺癌及肺癌[5-8]。本研究旨在探討β-谷甾醇對人結腸癌細胞HCT116增殖和凋亡的影響，并探索其對磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide"3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein"kinase"B，PKB，又稱Akt）信號通路的調節作用。

1""材料與方法

1.1""材料

人結腸癌HCT116細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司；β-谷甾醇（純度≥98%，貨號：SS8580）購自北京索萊寶科技有限公司；細胞計數試劑盒8（cell"counting"kit-8，CCK-8，貨號：CA1210）、胎牛血清（貨號：S9020）購自北京索萊寶科技有限公司；Hoechst"33342染色液、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色液購自北京索萊寶科技有限公司；Akt、PI3K、磷酸化Akt（p-Akt）、促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、辣根過氧化物酶（horseradish"peroxidase，HRP）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin"G，IgG）二抗購自沈陽萬類生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic"acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；全蛋白提取檢測試劑盒（貨號：20201120）購自南京建成生物工程研究所有限公司；McCoy's"5A完全培養基（貨號：PM150710）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

凝膠成像系統購自上海天能科技有限公司；熒光倒置顯微鏡購自尼康科技有限公司；電泳儀購自伯樂生命醫學產品有限公司；半干法轉膜儀購自伯樂生命醫學產品有限公司；MR-96A型酶標儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司。

1.2""方法

1.2.1""細胞培養""將人結腸癌細胞HCT116培養于含1%青霉素、1%鏈霉素、10%胎牛血清的McCoy’s"5A培養基中，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。給藥組分為β-谷甾醇高（240μmol/L）、中（120μmol/L）、低劑量（60μmol/L）組，并設置對照組（0μmol/L）。根據CCK-8法增殖實驗，本研究確定60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L為β-谷甾醇的有效給藥濃度進行后續實驗。

1.2.2""細胞形態觀察""收集處于對數生長期的HCT116細胞，調整細胞密度至8×104個/ml，接種于24孔板中培養過夜。對照組加入適量培養基，給藥組分別加入等體積的含有濃度為60μmol/L、120μmol/L、240μmol/L的β-谷甾醇培養基，在37℃、5%CO2的培養箱中培養24h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察對照組及給藥組細胞的形態，并拍照記錄。

1.2.3""CCK-8法檢測HCT116細胞增殖""將HCT116細胞接種于96孔板中（空白孔不接種細胞），設置對照組，實驗組細胞用β-谷甾醇濃度分別為15、30、60、120、240μmol/L的培養基進行培養。24h后每孔中加入10μl的CCK-8試劑，在培養箱中孵育2h。使用酶標儀測量450nm波長處各孔細胞的光密度（optical"density，OD）值，并計算細胞存活率。細胞存活率=[（給藥組OD值–對照組OD值）/（對照組OD值–空白孔OD值）]×100%。

1.2.4""克隆集落形成實驗""將密度為5×103個/ml的細胞接種于6孔板中并培養過夜。給藥方法同1.2.2，孵育24h后，更換新鮮培養基再培養14d，其間每3d換液1次。待細胞集落形成至合適大小時，吸棄原培養基，磷酸鹽緩沖液（phosphate"buffer"solution，PBS）洗滌2次，然后將細胞集落固定于4%多聚甲醛中30min，棄液后PBS洗滌2次，蘇木精溶液染色15min，棄染色液，PBS洗滌2～3次，用光鏡計數含有50個以上細胞的集落數。

1.2.5""Hoechst33342細胞核染色法""將密度為2×104個/ml的細胞接種于24孔板中并培養過夜。給藥方法同1.2.2，用4%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗滌2次，每孔加入100μl的Hoechst33342，于室溫避光染色15min，去除染色液并用PBS洗滌2次，使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.2.6""蛋白質印跡（Western"blot，WB）檢測相關蛋白表達""調整細胞密度為1×106個/ml接種于6孔板中，給藥方法同1.2.2，24h后提取總蛋白。用預冷的1×PBS溶液洗滌3次后，根據說明書按比例加入含PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃環境中以12"000轉/min離心15min，小心吸取上清液得全蛋白提取物。BCA法調整各組蛋白濃度，使各組蛋白樣品終濃度統一。應用WB技術檢測相關蛋白的表達情況。采用恒壓法進行電泳，樣品在濃縮膠中電壓控制為80V，當樣品開始進入分離膠時改電壓為120V，上樣蛋白量30μg。電泳結束后，進行半干法轉膜，以“濾紙-PVDF膜-凝膠-濾紙”順序從下到上疊好，接通電源，25V轉膜，依據分子量大小確定轉膜時間。用5%脫脂奶粉溶液封閉2h，加入相應的一抗（1∶500）孵育（4℃冰箱過夜）。PBST洗膜（4次），HRP標記山羊抗兔IgG二抗（1∶800）室溫孵育2h，PBST洗膜（4次），ECL化學發光法顯影并采集圖像，Image"J軟件進行灰度值分析并計算各個蛋白條帶的相對表達水平。

1.2.7""分子對接""在TCMSP數據庫中下載β-谷甾醇的2D結構、RSCBPDB數據庫中下載PI3K/Akt蛋白的2D結構[9-10]。利用AutoDock"4.2軟件對基因分子結構進行半柔性結合分子對接。

1.3""統計學方法

應用SPSS"21.0統計學軟件對數據進行分析處理。計量資料以均數±標準差（"）表示，采用單因素方差分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""β-谷甾醇對HCT116細胞形態影響的比較

對照組細胞形態完整，細胞邊界清晰；與給藥組比較，對照組細胞的密度最大；給藥組隨著β-谷甾醇給藥濃度的增加，細胞形態發生不同程度的變化，如細胞邊界模糊、細胞皺縮變小的程度逐漸加深，細胞貼壁能力減弱，細胞膜破裂、胞質降解的程度逐漸加深，見圖1。

2.2""β-谷甾醇對HCT116細胞增殖影響的比較

與對照組比較，給藥組處理人結腸癌HCT116細胞24h時，細胞增殖抑制作用的差異有統計學意義（Plt;0.05）。半數抑制濃度（half"maximal"inhibitory"concentration，IC50）為192.21μmol/L，見圖2。

與對照組比較，給藥組的HCT116細胞集落形成能力受到顯著抑制，且隨劑量的增加，集落形成能力逐漸減弱，見圖3。

2.3""β-谷甾醇對HCT116細胞凋亡影響的比較

與對照組比較，給藥組的HCT116細胞表現出凋亡早期染色質濃密的特征，發出亮藍色熒光的細胞數目逐漸增多，細胞核分布不均且相對集中的程度逐漸加深。Hoechst33342細胞核染色結果見圖4。

2.4""相關蛋白的表達情況

與對照組比較，給藥組的HCT116細胞中PI3K蛋白的表達差異有統計學意義（Plt;0.01），各濃度組的p-Akt與Bcl-2蛋白的表達水平逐漸降低（Plt;0.01），Bax蛋白的表達水平逐漸升高（Plt;0.01）。p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白在β-谷甾醇濃度為240μmol/L時變化最為顯著，見圖5。結果表明，β-谷甾醇可調控相關蛋白的表達水平，進而誘導HCT116細胞凋亡。

2.5""分子對接

β-谷甾醇與PI3K和Akt的對接結果分別為–7.48kcal/mol和–8.19kcal/mol。β-谷甾醇與PI3K的殘基ASPA∶316和PROA∶313存在氫鍵結合，有利于結構的穩定。β-谷甾醇與PI3K和Akt殘基間存在Alkyl和Pi-Alkyl相互作用。上述作用力使結合能降低、親和力增加，見圖6。

3""討論

結腸癌是一種惡性上皮腫瘤，由多種因素誘發，包括遺傳、環境污染和其他致癌因素。全球每年新發病例超過4萬例，占所有惡性腫瘤的10%～15%[11]。研究表明，中草藥在腫瘤治療的整個過程中發揮重要作用，其可抑制腫瘤進展、緩解手術并發癥、增加化學治療和放射治療的敏感度、減輕手術等治療的損害[12]。

PI3K/Akt信號通路在調控細胞生長、細胞增殖和細胞凋亡中扮演重要角色[13]。活化的Akt可調節腫瘤細胞的生長、分化、運動、存活和凋亡。研究表明，磷酸酶及張力蛋白同源物等突變均可導致PI3K信號通路的異常激活[14]。因此，上述信號通路是結腸癌治療的潛在靶點。臨床研究表明，靶向PI3K/Akt信號通路的抑制劑對腫瘤的治療有積極作用[15]。

本研究結果表明，β-谷甾醇可降低HCT116細胞的活力，抑制HCT116細胞的增殖，且可降低HCT116細胞的集落形成能力。WB研究表明，β-谷甾醇可降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，增加促凋亡蛋白Bax的表達。上述結果表明，HCT116是結腸癌的潛在抗癌劑。基于PI3K/Akt信號通路、細胞增殖與細胞凋亡的關系，推斷β-谷甾醇可靶向調控PI3K相關分子，并可能參與細胞凋亡的調控。β-谷甾醇與PI3K和Akt蛋白分子對接結果良好。綜上，β-谷甾醇是治療結腸癌的潛在藥物，其機制可能是通過影響PI3K/Akt信號通路的相關蛋白。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

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